离子交换层析分离纯化蔗糖酶
蔗糖酶的分离提纯及酶促反应动力学实验
11.04.2024
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3、 蔗糖酶粗品（E1）的制备
①自溶：15g（一小袋）高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中、少量多次地 加入50ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙 酯，搅匀，再于35℃ 恒温水浴中搅拌30分钟，观察菌体自溶现象；
②抽提：补加蒸馏水30ml，搅匀，盖好，于35℃ 恒温过夜， 8000r/min
7.学习掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法、选择 确
定酶促反应最适条件（温度、pH值、离子浓度等）的方法；
8.学习《正交试验法》中最简单的入门知识：用正交表设计
试验方案、用极差分析处理试验数据并分析试验结果。
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Байду номын сангаас
二、实验原理
前言
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，可据酶蛋白的结构 和性质选择分离提纯条件和含量测定方法。
② 工作以曲葡线萄。糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标，画出
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3，5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作
试号 含糖量 葡萄糖标准液 去离子水 3，5-二硝基水杨酸试剂 A540
（mg） （ml） （ml）
（ ml）
10
0
2.0
3
2 0.4 0.2
1.8
3
3 0.8 0.4
⑥ 保存成品E3
测酶E3活力及蛋白质浓度
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成品E3 计算出E3浓度
周六（全天）上午8：00开始
(1).蔗糖酶米氏常数的测定
(2).用正交法测定几种因素
对蔗糖酶 活力的影响
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浙江大学生物化学实验甲 2011-酵母蔗糖酶的提取原理
酵母蔗糖酶的制备原理一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中，可专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。
酵母蔗糖酶的分子量约270000D（因来源不同，分子量有差异），pI约5.6，最适pH4.6，耐酸和热，最适温度50℃。
耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。
二、酵母蔗糖酶的分离纯化本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：缓冲液抽提，加热纯化，乙醇分级沉淀，DEAE-Sepharose柱层析分离纯化。
㈠、前三步分离纯化的原理如下：㈡、离子交换DEAE-Sepharose柱层析分离纯化的原理1、离子交换柱层析分离混合物的基本原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种根据待分离物质的阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术。
离子交换层析是一种液-固相层析技术。
其中，液相称洗脱液，固相的惰性支持介质称离子交换剂。
在离子交换剂上具有带电基团，不同的交换剂所具有的带电基团的电荷性质不同，如交换剂上的带电基团带正电荷，则可结合溶液（液相）中的阴离子，这样的交换剂称为阴离子交换剂，如DEAE 纤维素（二乙胺基乙基-纤维素）、强碱型的离子交换树脂等。
反之，如交换剂上的带电基团带负电荷，则可结合溶液中的阳离子，这样的交换剂称为阳离子交换剂，如CM-纤维素、强酸性的离子交换树脂等。
离子与交换剂的静电结合作用具有如下特点：可逆性：在一定条件下，结合在交换剂上的离子可被其它离子取代而离开交换剂并随洗脱液流出层析柱。
选择性：离子所带的电荷越多，水合离子半径越小越易结合。
遵循质量作用定理：对某一特定离子，随离子浓度的增大，则遵循质量作用定理向与交 换剂结合方向进行。
浙江大学生物化学实验甲酵母蔗糖酶的提取原理
酵母蔗糖酶的制备原理一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中，可专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。
酵母蔗糖酶的分子量约270000D（因来源不同，分子量有差异），pI约5.6，最适pH4.6，耐酸和热，最适温度50℃。
耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。
二、酵母蔗糖酶的分离纯化本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：缓冲液抽提，加热纯化，乙醇分级沉淀，DEAE-Sepharose柱层析分离纯化。
㈠、前三步分离纯化的原理如下：㈡、离子交换DEAE-Sepharose柱层析分离纯化的原理1、离子交换柱层析分离混合物的基本原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种根据待分离物质的阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术。
离子交换层析是一种液-固相层析技术。
其中，液相称洗脱液，固相的惰性支持介质称离子交换剂。
在离子交换剂上具有带电基团，不同的交换剂所具有的带电基团的电荷性质不同，如交换剂上的带电基团带正电荷，则可结合溶液（液相）中的阴离子，这样的交换剂称为阴离子交换剂，如DEAE 纤维素（二乙胺基乙基-纤维素）、强碱型的离子交换树脂等。
反之，如交换剂上的带电基团带负电荷，则可结合溶液中的阳离子，这样的交换剂称为阳离子交换剂，如CM-纤维素、强酸性的离子交换树脂等。
离子与交换剂的静电结合作用具有如下特点：可逆性：在一定条件下，结合在交换剂上的离子可被其它离子取代而离开交换剂并随洗脱液流出层析柱。
选择性：离子所带的电荷越多，水合离子半径越小越易结合。
遵循质量作用定理：对某一特定离子，随离子浓度的增大，则遵循质量作用定理向与交 换剂结合方向进行。
蔗糖酶的提取和纯化步骤
色1小时。
10. 脱色：回收染色液，凝胶板先用水漂洗数次，再用脱色液脱色，直 到蛋白质区带清晰。确定目的蛋白条带位置，估算分子量，比较不
同纯化过程对杂蛋白去除状况。
※剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。
低分子量标准蛋白试剂盒:
•
低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B 牛血清白蛋白
MW=97,400 MW=66,200
②以1号管为参比调零，记录光密度值A650，以标准液的浓度为横坐 标， A650值为纵坐标，画出工作曲线。
蛋白含量测定的计算
Pr (mg/ml)=
A650值对应的µ g数(Pr)×10-3 ×稀释倍数 Pr溶液的ml数
BSA标准液 250 µ g/ml
SDS-PAGE电泳实验过程
1. 准备玻璃板：将玻璃板用蒸馏水洗净晾干(实验室前后的空调
蔗糖酶米氏常数的测定操作方法
1）将离子交换柱层析得的E3稀释(pH4.6 HAC缓冲液)至20U/mL，共16ml。 2）取试管8支，按0--7编号，0为对照管。 3）按表 1将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35℃水浴中保温（使 温度平衡，以下同）10min。
4）取约16ml酶液，放入同一水浴中保温约10min。
Buffer
10%SDS 10%Ap TEMED
6、样品预处理：
低分子量蛋白Mark,E1,E2,E3,E4,牛血清白蛋 白。 （1）低分子量蛋白Mark、牛血清白蛋白和E4的样品 由实验室提供。
（2）E1,E2,E3,E4分别取20µ l，再加入20µ l 2倍 (2X)样品缓冲液，在沸水中煮3分钟(本次实验1个 E3、E4-1和E4-2由实验室提供)，点动离心除沉淀。
线的时候，将电流改为20mA （如果同时电泳两块胶，电流恒定在
生物化学实验示范报告-蔗糖酶的提取与纯化(正确)
生物化学实验示范报告:实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化实验目的:1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。
实验原理：蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。
酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。
但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。
有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。
操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。
蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。
它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。
蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。
离子交换层析纯化蔗糖酶实验方法改进研究
X U P ei2y a, Q IU L e2quan (Co llege of B io log ica l and Environm en ta l Eng. , Zhejiang U n iv. of T echno logy, H angzhou 310032, Ch ina)
Sep h ro se 314. 8
2. 05
2. 87
110. 3
109. 7
98. 2
293. 4ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
0. 49
0. 92
200. 4
318. 9
43. 4
93. 2
浓缩倍数
2. 03
1. 82
2. 91
4 结 语
经 过 上 述 几 种 纯 化 方 法 的 比 较, 采 用 Q Sep ha ro se 纯化方法进行实验改进, 具有如下特点。
100m in 缩短到现在的 50m in, 减少不必要的实验重 复, 实验过程比较紧凑。
(3) 节约实验支出。离子交换介质D EA E2纤维素 由于流速慢, 柱床高度会随缓冲液浓度及 pH 改变, 不 能承受 0. 1M 以上 N aO H 清洗, 重生效果差, 寿命短。 琼脂糖介质在分辨率、回收率、流速等具有优越性。 且 其化学稳定性极高, 不易破碎, 可以承受 1M N aO H 的 清洗, 重生效果好, 可以使用数百至上千次, 因而降低 了成本。
采用 Pha rm acia 公司生产的琼脂糖为基质的弱阴 离子交换柱 D EA E Sep ha ro se 16×10 用起始缓冲液 0. 05M T ris2HCL pH 7. 3 缓冲液平衡, 加样, 先用0. 05 M T ris2HCL 缓冲液洗脱, 流速为每分钟 1mL , 然后盐 度 梯 度 洗 脱, 经 100m in 流 动 相 由 0. 05M T ris2HCL pH 7. 3 缓冲液到 1M N aCL 的 0. 05M T ris2HCL pH 7. 3 缓冲液, 每管收集 3mL , 进行紫外检测 (280nm ) 和酶活 力测定。
浙江大学生物化学丙实验报告
. . . . 实验报告课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：实验名称： 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 同组学生： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理；2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。
二、实验容和原理（1）实验原理 1、离子交换层析：以离子交换剂为固定相，液体为流动相进行。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
这些过程都是可逆的。
在某一pH 值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。
当洗脱液的pH 改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。
离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。
基质 电荷基团 反离子 电荷基团反离子电荷基团反离子基质基质—＋—＋＋可逆交换可逆交换＋＋溶液中的离子（交联纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖)— ——阳离子交阴离子交换剂专业： 农业资源与环境姓名： 李佳怡学号： 3130100246 日期： 2015.5.19地点： 生物实验中心310装订线由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂达到分离蔗糖酶的目的。
2、酶活力检测(定性检测）蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），能催化非还原性双糖（蔗糖）裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。
生化实验报告-离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶
实验报告一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法二、实验内容和原理1、离子交换层析由于蔗糖酶的pI 偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。
2、酶活力检测蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。
（50℃水解） 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。
（100℃显色）三、实验材料和主要仪器1、实验材料蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品Ⅲ） 2、实验试剂⑴ DEAE-Sepharose Fast Flow⑵ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液⑶ 20mmol/L Tris-HCl （1mol/L NaCl ）pH7.3缓冲液 ⑷ 0.2mol/L 乙酸缓冲液，pH4.5 ⑸ 5%蔗糖溶液⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂 3、实验仪器（1）高速冷冻离心机（2）层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组）（3）ÄKTA TM start（1套/组）（4）部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组）（5）－20℃冰箱（保存样品用）（6）微量移液枪 200ul、1000ul（7）1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用）（8）7ml离心管（留样品Ⅳ用）（9）恒温水浴（50℃、100℃）（10）试管、移液管、试管架等四、实验方法和步骤1、仪器连接（1）接通各仪器电源，将A,B泵头分别放置A，B两个溶液瓶中。
生物化学实验-离子交换层析
1、仪器连接
AB
开关
A、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓
冲液
B、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，（0.5
mol/L NaCl） pH7.3缓冲液 1.接通各仪器电源，将A,B泵头分别放置
A，B两个溶液瓶中。注意B为含NaCl溶
液。1：缓冲液阀（Buffer valve） 2. 点2：击混电和脑器桌（面M上ixUenri）corn软件图标，打 开软3：件样。品选阀择（SySsatemmplCeovnatrlovel ，）点击OK ，进4：入泵操（作P界u面m。p）点击Connect 3. 在5：操压作力界传面感的器工（具P栏re，ss点u击reMannual Rusne。n出so现r）FlowRate 窗口，调节flowrate 为 61：ml清/m洗in，阀确（定Wa。sh valve）
Wash valve Collector
（1）连接混和器及样品阀，流速调整为1.0ml/min （2）切换至BufferB，直至Conductivity到达40mS/cm （3）连通BufferA，直至Conductivity接近2并平稳 ，准备装柱
3、装柱和平衡： （1）检查层析柱的两端接头，底端有膜的置于下方。 （2）程序暂停。将层析柱放入卡槽，上端接头与混合器（mixer) 相连，下端接头与样品阀（sample valve)相连。
实验器材与仪器
1、高速冷冻离心机 2、层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组） 3、ÄKTATM start（1套/组） 4、部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组） 5、－20℃冰箱（保存样品用） 6、微量移液枪 200ul、1000ul 7、1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用） 8、7ml离心管（留样品Ⅳ用） 9、恒温水浴（50℃、100℃） 10、试管、移液管、试管架等
实验蔗糖酶的提取
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四．其他 １．上实验课请不要迟到早退，如有事请向任课老师事先请假或
事后说明。 ２．在实验室里上课时不要玩电脑游戏。
３．进入实验室要衣着整洁，要求穿实验服做实验，不能穿拖鞋
进实验室做实验。实验过程中不要随便串走，保持安静，不
6．严禁在实验室吸烟。
7．禁止在实验室用电炉或明火取暖。
8．实验时，应保持桌面的整洁不乱；实验结束后，应将自己的桌 面收拾干净方可离开实验室。
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9．在每次实验结束后，安排卫生值日的同学应自觉地完成以下
工作：
⑴ 收理实验用试剂、器材和仪器。
⑵ 将实验桌上的废液缸中的废物倒掉洗净，并把桌面擦干净。 ⑶ 把使用过的仪器及仪器桌面擦拭干净。 ⑷ 把实验室的地面扫清拖净。
第8页，本讲稿共25页
二．实验仪器使用
1．学生实验使用仪器前，应在教师讲解了使用方法后，或在已学会
如何使用的情况下，方可自己单独操作有关仪器；如违反操作规程， 将仪器损坏，应由当事人按规定处理。
2．仪器如果以小组为单位共同使用，某一同学如出现不当操作损坏 仪器，则以小组为单位共同赔偿损失。
3．如因教师没有讲解好仪器的使用方法等原因造成学生损坏仪器， 应由教师负全责，并按规定处理。
录。请保存好，实验结束后上交，作为实验报告成绩的一部分！
第5页，本讲稿共25页
实验成绩
1、实验报告成绩（纸质版） 70％ 2、实验平时成绩 30％
(1)到课情况（签到、迟到、早退和请假） (2)实验操作，器材、仪器使用 (3)值日情况 (4)实验预习、实验过程和实验记录（实验记录本）
浙江大学生物化学实验甲 酵母蔗糖酶的制备、纯化步骤-离子交换
酵母蔗糖酶的制备一、酵母蔗糖酶的制备1.缓冲液抽提称取10克干酵母粉，加3克石英砂，于研钵中研磨约2分钟；再加30毫升0.02 mol/L pH7.3的Tris-HCl缓冲液（以6毫升1份分次加），边加边研磨至成浆状，将匀浆转移到50ml 离心管中，于8000转/分离心20分钟，形成三层；用滴管插入取水层（中层）于50ml离心管中，于10000转/分离心10分钟，取上清到量筒中，量体积，记为F1。
留0.5毫升以测定酶活力和蛋白质含量（Fraction I），其余转入50ml离心管中用于加热纯化。
2. 加热纯化将上清液置于50℃水浴中保温30分钟，随时摇动；然后于冰—水浴中冷却，以10000转/分离心10分钟，取上清液到量筒中，量体积，记为F2。
留0.5毫升测酶活力及蛋白质含量（Fraction Ⅱ）。
其余用于醇分级分离。
3. 醇分级分离于上清液中加入等体积-20℃预冷的95%乙醇，冰上进行，慢慢滴加，边滴边摇（控制在6-8分钟加完）。
充分混匀后，于冰-水浴中放置20分钟；以10000转/分离心10分钟，取沉淀，用4-5毫升0.05mol/L、pH7.3的Tris-HCl缓冲液（含0.025mol/LNaCl）溶解沉淀，于10000转/分离心10分钟，取上清到量筒中量体积，记为F3。
留1毫升测酶活力及蛋白质含量（FractionⅢ），其余用于柱层析。
样品保存于冰箱中备用。
4.DEAE-Sepharose柱层析分离纯化柱规格：1×20（cm，直径）流速：3ml/10min上清（约3~4ml）加到DEAE-Sepharose柱上进一步分离纯化。
流速3ml/10min，洗脱液：0.02 mol/L pH7.4的Tris-HCl，在0～1mol/L NaCl下进行线性梯度洗脱，收集：3ml /管。
二、各步提取液蛋白质含量的测定1. 蛋白质含量标准曲线的制作项目试管号0 1 2 3 4 5蛋白质含量（μg）/ 50 100 150 200 250蛋白质标准液（ml）/ 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0无离子水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 /Follin酚甲液（ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0充分混匀，于室温（20~25℃）放置10分钟Follin酚乙液（ml）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5充分混匀，于30℃水浴保温30分钟OD650（nm）蛋白质标准液浓度：250ug/ml2. 各步提取液蛋白质含量测定(已预热到37℃)项 目 试管号空白 Fraction Ⅰ（1：10） Ⅱ（1：5） Ⅲ（1：2）1 2 3 4 5 6 7 稀释酶液（ml ） 0 0.1 0.2 0.1 0.2 0.1 0.2 无离子水（ml ） 1.0 0.9 0.8 0.9 0.8 0.9 0.8 Follin-酚甲液（ml ） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0充分混匀，于室温放置10分钟 Follin-酚乙液（ml ） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 充分混匀，于30℃水浴保温30分钟OD 650nm蛋白质含量（μg ） 平均值（μg ）提取液蛋白质总含量（mg ）三、各步提取液酶总活力及比活力测定1. 葡萄糖标准曲线的制作 项目 试管号0 12 3 4 5 6 8含糖量（）葡萄糖标准液（ml ） / 0.1 0.20.3 0.40.5 0.6 0.7无离子水（ml ） 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 DNS 试剂（ml ） 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8混匀，于100℃水浴中保温5分钟，取出经流动水冷却后，再加5ml 蒸馏水，混匀。
实验三 酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定
实验三酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定酶的纯化一、原理酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过破碎细胞、热处理、乙醇沉淀、离子交换柱层析等步骤，提取蔗糖酶，并用聚丙稀酰胺凝胶电泳对其纯度进行测定。
离子交换层析法(ion-exchange chromatogramphy,简称IEC)中常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素(CM-纤维素)，阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素)。
蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团相结合，结合力的大小取决于彼此之间相反电荷基团的静电引力，这又与溶液的pH值有关，因为pH值决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。
盐类的存在可以降低离子交换剂的解离基团与蛋白质的相反电荷之间的静电引力，因此被的蛋白质的洗脱可通过改变pH值或离子强度 (或两者同时改变)来实现。
与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。
梯度洗脱是在洗脱过程中，使洗脱液的pH值(或两者同时)发生连续的变化，从而使吸附在柱上的各组分在不同的梯度下被洗脱下来。
二、实验材料、仪器和试剂1、实验材料干酵母2、仪器(1)高速离心机 (2)恒温水浴锅 (3)层析柱(1.0cm×16cm)(4)梯度混合器(5)部分收集器3、试剂(1) 95% 乙醇溶液 (2) DEAE-Sepharose Fast Flow (3) 1mol/L醋酸溶液(5) 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)(6) 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(内含1mol/L NaCl溶液)pH值7.3三、操作步骤1、破碎细胞取15g 干酵母，加5~10g石英砂，置于预先冷却的研钵中，加30ml去离子水，研磨30min，在冰箱中冰冻约20~30min（研磨液面上刚出现冰结为宜），重复2次，加5ml去离子水，置离心管中，12000r/min离心15min，留0.5ml上清液为第一组分。
生物化学实验示范报告-蔗糖酶的提取与纯化(正确)
生物化学实验示范报告:实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化实验目的:1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。
实验原理：蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。
酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。
但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。
有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。
操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。
蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。
它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。
蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。
[生物学]酵母蔗糖酶的提取工艺
![[生物学]酵母蔗糖酶的提取工艺](https://img.taocdn.com/s3/m/98b79150680203d8cf2f242c.png)
酵母蔗糖酶的提取工艺摘要蔗糖酶是一种水解酶, 广泛存在于动物、植物、微生物等各种生物体内。
它可以不可逆的催化蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖，为微生物的生长提供碳源和能源。
采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶[1]，冻融法和SDS抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。
其中冻融法的效率最高（纯化倍数比活力与总活力），加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。
比较了乙醇分级沉淀、硫酸铵分级沉淀对于冻融法得到的粗提物的沉淀效果，结果表明：50%(w/w)乙醇分级沉淀效果较好（比活力与总活力），乙醇分级沉淀所得蔗糖酶经DEAE-Sepharose 离子交换层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶（比活力与总活力）。
纯化倍数为16.14倍，比活性为947.805U/mg，回收率为51.6%。
蔗糖酶的酶促动力学性质表明，蔗糖酶的最适PH值为4.5，最适温度为50℃，酶的特征米氏常数Km值为13.8mmol/L，最大反应速度Vmax为5.98ug/min。
关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化Study on Purification of Invertase from YeastAbstractSucrase is widespread in prokaryotes and eukaryotes .Sucrase catalyzes the irreversible hydrolysis of sucrose into glucose and fructose.the mainfroms 实用文档of carbon and energy supplies in microorganism growth and development.This paper used three methods to extract invertase from yeast,which included in this manuscript, three different extraction method breaking cells by adding methylbenzene,frost grinding,and adding SDS for extracting invertase from yeast were investigated.Then the purified invertase was obtained by precipitatation with 50% ethyl alcohol、sequential ammonium sulpate precipitation and DEAE-Sepharose lon-exchange chromatography.The purified sucrase was characterized by SDS-PAGE.The results showed all three methods had both advantages and disadvantages.The invertase extracted by adding SDS and frost grinding had much more total activity than that of extracted by adding methylbenzene.A highest total invertase activity was found in the forst grinding,and it was a convent and economical method for commercial production of invertase from yeast.The results of our study were followed:1、Purification of invertase from yeastThe specific activity was 947.805U/mg,purification fold was 32.28.The activity recovery of sucrase was 51.6%.2、Properties of sucrase实用文档The kinetic characters of the enzyme have been studied.The optimum PH and optimum temperature for the enzyme are PH4.5 and 50℃.Km is 21mmol/Land Vmax is 6.57ug/min.Key words : yeast;invertase;extraction;purification第一部分文献综述蔗糖酶（Sucrase,EC 3.2.1.26）又称转化酶（Invertase），是将蔗糖水解成D-葡萄糖和D-果糖的ß-D-果糖苷酶的一种。
蔗糖酶分离纯化与活力测定
蔗糖酶分离提取的原理
细胞破壁：就酶在生物体内的分布， 细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶 和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶 提取胞内酶时， 胞内酶。 和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要破 碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材 碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取， 料称为无细胞抽提液。 料称为无细胞抽提液。 材料不同，破壁也方法不同。 材料不同，破壁也方法不同。 酶的分离提纯步骤：选材、破壁、提取、分离、 酶的分离提纯步骤：选材、破壁、提取、分离、纯 测活、保存； 化、测活、保存；用测定酶活力的方法跟踪酶的去 衡量酶提纯的程度和得率。 向、衡量酶提纯的程度和得率。
酵母蔗糖酶的分离纯化和 活力测定
实验目的
一、学习酶蛋白分离提纯的原理； 二、掌握细胞破壁、提取、有机溶剂分级、 透 析和离子交换柱层析技术；
三、测定各级分蛋白含量及蔗糖酶的活力。
二、实验原理
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，可据酶蛋 酶是生物体内具有催化功能的蛋白质， 白的结构和性质选择分离提纯条件和含量测定方 法。 酶分离提纯的总目标是提高纯度（或比活力） 酶分离提纯的总目标是提高纯度（或比活力）及 纯度 收率；依据在溶液中的性质（分子大小、溶解度、 收率；依据在溶液中的性质（分子大小、溶解度、 电荷、吸附等）进行分离。 电荷、吸附等）进行分离。
蔗糖酶活力测定的原理
蔗糖酶催化的反应： 蔗糖酶催化的反应：蔗糖 D-果糖 + D-葡萄糖 果糖 葡萄糖
(U)＝ 条件下， 1mg葡萄糖所 1活力单位(U)＝酶在室温，pH＝4.6条件下，每分钟水解产生1mg葡萄糖所 活力单位(U) 酶在室温，pH＝4.6条件下 每分钟水解产生1mg 需酶量。 需酶量。
3，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。
本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。
在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulose 柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。
在实验过程中，虽然我们很努力, 但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。
关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离DEAE-Cellulose 柱层析分子筛层析Km 前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。
随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。
这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。
由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。
各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。
酶分离纯化成功与否的重要标志：一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。
就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。
其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。
一串红蔗糖酶的分离纯化、部分性质与功能基团研究和固定化条件优化的开题报告
一串红蔗糖酶的分离纯化、部分性质与功能基团研究和固定化条件优化的开题报告一、选题背景红蔗糖酶，又称蔗糖转移酶，是将蔗糖分解成葡萄糖和果糖的重要酶类。
该酶广泛应用于食品、医药和化工等领域。
目前大部分红蔗糖酶是从真菌、细菌及植物等自然来源中提取得到。
然而这些来源的红蔗糖酶的产量较低且易受环境等因素影响，因此需要开发一种高效的红蔗糖酶纯化方法。
二、选题目的本课题旨在研究红蔗糖酶的分离纯化方法和其分子水平的部分性质和功能基团研究，同时研究红蔗糖酶的固定化条件优化，以期得到高效、稳定的红蔗糖酶。
三、选题内容1. 红蔗糖酶的分离纯化方法研究：对红蔗糖酶进行萃取、离子交换、凝胶渗透等方法，筛选最佳的纯化方案，同时监测每一步纯化的纯度和活性。
2. 红蔗糖酶的部分性质和功能基团研究：对纯化后的红蔗糖酶进行酶学性质研究，例如pH和温度的反应条件、底物特异性和亚单位组成等，并且通过红外光谱和紫外光谱等方法研究红蔗糖酶的功能基团。
3. 红蔗糖酶的固定化条件优化：采用凝胶法、共价结合法等固定化方法，对红蔗糖酶固定化条件进行优化，获得较高的固定化效率和较好的稳定性，并分别对固定化酶催化活性和底物耐受性进行测试。
四、研究意义通过对红蔗糖酶的分离纯化和部分性质研究，可以对红蔗糖酶进行深入了解，指导其在工业上的生产和应用。
同时，通过固定化条件优化研究，可以降低生产成本，提高酶的稳定性和催化效率，进一步拓展红蔗糖酶的应用范围。
五、计划进度第一年：红蔗糖酶的分离纯化方法筛选和纯化酶学性质研究。
第二年：红蔗糖酶功能基团研究和固定化条件优化。
第三年：对分离纯化后的红蔗糖酶进行应用测试，并对研究结果进行总结和分析。
六、预计产出1. 红蔗糖酶的分离纯化方法——发表一篇SCI论文。
2. 红蔗糖酶的酶学性质和功能基团研究——发表一篇SCI论文。
3. 红蔗糖酶的固定化条件优化及应用测试——发表一篇或数篇SCI论文，并转化成实际应用。
离子交换层析分离纯化蔗糖酶
实验报告课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师： 成绩：__________________ 同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶一、实验目的和要求：1、学习离子交换层析的基本原理；2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。
二、实验内容和原理：1、离子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC ）离子交换层析是常用的层析方法之一。
它是以离子交换剂为固定相，根据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换剂与流动相中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
这些过程都是可逆的。
在某一pH 值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。
当洗脱液的pH 改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。
离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。
基质————电荷基团————反离子专业：姓名： 学号： 日期： 地点：装订线溶液中的离子或离子化合物阳离子交换剂基质—+ 《==可逆交换==》+阴离子交换剂基质+ —《==可逆交换==》—由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。
蔗糖酶的提取及活力
蔗糖酶的提取及活力、含量和相对分子质量测定摘要：本学期共做了六次生化实验。
.第一次是提取及纯化蔗糖酶，以为后续实验提供样品。
实验主要目的是要求学生掌握高速离心机的使用。
实验共得到不同纯化度的三种提取液，标记为A、B、C。
将三种提取液分别放入冰箱保存，做为后续实验样品。
也因此做此实验时必须保证各个操作无误，及准确，以免影响后续实验的结果。
第二次是有关蔗糖酶的柱层析法，主要目的是要求同学掌握离子交换层析的原理及柱层析的操作技术及紫外吸收的分析方法。
此次实验通过柱层析及紫外吸收法得到2~3管的活力最大的分离液合并为分离液D，放入冰箱作为后续实验样品。
第三次实验为蔗糖酶的活力测定，目的为掌握酶的活力测定方法，了解各个酶的纯化情况。
利用分光度计测出各个样品的OD值，再对照葡萄糖的标准曲线来得出剩余葡萄糖的含量，从而获得各个酶的活力大小，了解各个酶的纯化情况。
并得出结论酶的纯化度越高，活力越小。
第四次实验为蔗糖酶蛋白质的含量测定，目的为掌握学习Folin-酚测定蛋白质含量的原理及方法，制备标准曲线测定未知样品中蛋白质含量。
同样利用与标准曲线对照来得到试样的蛋白质含量，并测出酶的比活力。
测量蛋白质的方法有多种，我们必须根据所做实验的具体选择合适的方法来测定蛋白质。
第五次的实验是微量凯氏定氮测总蛋白。
目的是要求同学掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理及方法。
本实验除利用了凯氏定氮法外还加上了酸式滴定法最后得出了毫克级别的总蛋白含量。
其结果与上一实验所测得的总蛋白质含量有所不同，正证明了不同的方法测量蛋白质造成的误差不同，致所得结果不同。
最后一次实验为SDS-PAGE测定蛋白质分子质量，目的为掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和测定蛋白质分子量技术。
此实验操作复杂，需先制作凝胶再结果染色脱色，最后还要制作标准蛋白分子质量曲线图来进行试样对照。
最后得到蔗糖酶的分子量在5万左右及9万左右。
关键字：实验；提取液；比活；蛋白质；SDS-PAGE；OD正文：1，蔗糖酶的提取及提纯1.1，文献综述：蔗糖酶的分离利用的是细胞破壁法。
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实验报告课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师： 成绩：__________________ 同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶一、实验目的和要求：1、学习离子交换层析的基本原理；2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。
二、实验内容和原理：1、离子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC ）离子交换层析是常用的层析方法之一。
它是以离子交换剂为固定相，根据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换剂与流动相中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
这些过程都是可逆的。
在某一pH 值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。
当洗脱液的pH 改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。
离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。
基质————电荷基团————反离子专业：姓名： 学号： 日期： 地点：装订线溶液中的离子或离子化合物阳离子交换剂基质—+ 《==可逆交换==》+阴离子交换剂基质+ —《==可逆交换==》—由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。
2、酶活力检测(定性检测）蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。
它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。
因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。
还原糖的测定有多种方法，如采用3.5－二硝基水杨酸法，其原理是 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。
本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样品采用 3.5－二硝基水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。
三、实验材料与试剂：1、实验材料蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ2、实验试剂⑴DEAE-Sepharose Fast Flow (弱碱性阴离子交换剂)；⑵20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液；⑶20mmol/L Tris-HCl，（1mol/L NaCl）pH7.3缓冲液(学生自配）；⑷0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5 ；⑸5%蔗糖溶液；⑹3，5-二硝基水杨酸试剂甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。
四、实验器材与仪器：1、高速冷冻离心机；2、层析柱（φ1.0×20㎝）(1支/组）；3、恒流泵（流速0.8～1ml/min）(10rpm)（1台/组）；4、梯度混合器(100ml梯度杯)（1套/组）；5、核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A）（1台/组）；6、记录仪（纸速：0.5mm/min；灵敏度：50mV）（1台/组）；7、部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组）；8、铁架台、夹子（固定层析柱用）（1套/组）；9、－20℃冰箱（保存样品用）；10、微量移液枪200ul、1000ul；11、1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用）；12、7ml离心管（留样品Ⅳ用）；13、恒温水浴（100℃）；14、试管、移液管、试管架等。
五、操作方法和实验步骤：1、离子交换剂准备：(实验室已准备好）DEAE—Sephadex，取适量DEAE—Sephadex，加入0.5mol/L NaOH溶液，轻轻搅拌，浸泡0.5小时，用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加50ml 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸泡0.5小时，同上，用去离子水洗至近中性，（DEAE- Sepharose Fast Flow，用后务必回收）。
浸入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液中平衡备用。
2、样品处理：将乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白样品充分溶解于15ml 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液；4℃15000r/min, 离心10分钟，收集样品上清液（样品Ⅲ）测量总体积(ml数），留取1ml （样品Ⅲ）用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力的测定以及用于SDS-PAGE分析；将其余样品（样品Ⅲ）作离子交换柱层析进一步分离纯化蔗糖酶(可先取50ul酶液做酶活力检测）。
3、纯化检测仪器连接：将梯度混合器(100ml梯度杯)，层析柱（φ1.0×20㎝），恒流泵(10rpm) （流速0.8～1ml/min），核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A），记录仪（纸速：0.5mm/min，50mV）、部分收集器（4～5 ml/管/5min）等按下图连接并设置好。
纯化检测仪器连接示意图：1、50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓冲液2、50ml 20mmol/L Tris-HCl，（1mol/L NaCl）pH7.3缓冲液4、装柱(层析柱规格1×20cm)、平衡：装柱前先调好流速0.8ml～1ml/min，然后将柱下端的出水口关闭，加进5ml（约1/3柱床体积）20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液，然后将处理好的DEAE—Sepharose Fast Flow，轻轻搅匀（注意不能太稀，也不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续加进柱内至层析柱上端。
注意不能带进气泡，待凝胶自然沉积离柱管上端约1-2cm 后松开层析柱出口，控制流速0.8ml～1ml/min；待柱内DEAE —Sepharose Fast Flow 凝胶沉降至稳定高度并分出水层后，吸去水层，用玻棒将沉降界面搅匀，再补加处理好的DEAE—Sepharose Fast Flow凝胶，直到凝胶沉降至稳定高度距层析柱上端约3cm处为止（这时须保持DEAE—Sepharose Fast Flow凝胶柱面平整）。
用20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液连通层析柱，进行柱平衡，直到流出液与缓冲液的pH一致。
5、加样：停止加入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。
待缓冲液液面与胶体表面相切时，恒流泵停止工作。
用胶头滴管缓慢将蔗糖酶蛋白样品溶液（样品Ⅲ）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。
打开恒流泵，使样品溶液进入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入胶体后，再加洗脱缓冲液至一定高度。
6、洗脱：方法1——梯度洗脱法：加样后，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液进行平衡，洗脱流速为0.8ml～1ml/min，洗去未被DEAE —Sepharose Fast Flow凝胶吸附的杂蛋白，待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液NaCl梯度洗脱（浓度为0-1mol/L NaCl ），层析柱联上梯度混合器，混合器中分别为50ml 0.05mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液和50ml含1mol/L NaCl的0.05ml/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。
洗脱流速为0.8～1ml/min，每4ml接一管，洗脱至缓冲溶液流完为止。
跟踪测定各管的蔗糖酶活力，将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，测量总体积（ml数）（样品Ⅳ），并留样用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定、SDS-PAGE分析、酶的基本性质实验和用于“用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响”（半自主性设计实验），样品－20℃低温保存备用。
方法2、一步洗脱法：上样后，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液进行平衡，洗脱流速为0.8ml～1ml/min，洗去DEAE－Sepharose Fast Flow未吸附的杂蛋白，待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定。
用0.15mol/LNaCl 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液继续洗脱被吸附的蔗糖酶蛋白，洗脱流速为0.8ml～1ml/min，4ml/管/5min，直至待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定。
测定各接收管的蔗糖酶活力，将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，量出总体积（ml数）（样品Ⅳ），并留样用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析以及用于“用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响”（半自主性设计实验），样品－20℃低温保存备用。
7、蔗糖酶活力检测空白对照样品管0.2mol/L乙酸缓冲液，pH=4.5 0.5ml 0.5ml5%蔗糖溶液0.5ml 0.5ml蒸馏水 1.0ml 0.9ml分离纯化样品溶液/ 0.1ml50℃水浴10分钟3,5-二硝基水杨酸 1.0ml 1.0ml100℃水浴5分钟蒸馏水5ml 5ml观察颜色收集活力高的蔗糖酶液，测量总体积(ml数) （样品Ⅳ），-20℃保存备用，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析以及用于用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响（限定性设计实验）。
六、实验数据记录和处理：七、实验结果与分析：八、讨论、心得：1. 本实验所用的弱碱性阴离子交换剂（DEAE-Sepharose Fast Flow）价格昂贵，实验过程中要注意，不要外撒，不要浪费。
2. 在连接纯化检测仪器时要注意先后顺序，制作层析柱时柱下端的旋钮一定要有膜覆盖，否则在分离纯化的过程中交换剂也会流下来。
3. 在装柱前要先把DEAE—Sephadex搅拌均匀，装柱时要避免DEAE—Sephadex露出缓冲液液面，防止干胶。