限制性核酸内切酶分子手术刀
DNA重组技术的工具(公开课)
常用的载体： 常用的载体：质粒
质粒存在于许多细菌 以及酵母菌等生物细 胞中。是一种裸露的、 胞中。是一种裸露的、 结构简单、 结构简单、独立于细 菌拟核DNA DNA或细胞核之 菌拟核DNA或细胞核之 外自我复制的很小的 双链环状DNA DNA分子 双链环状DNA分子
有标记基因的 存在， 存在，可用含 氨苄青霉素的 培养基鉴别
陆丰龙山中学
DNA连接酶的种类 DNA连接酶的种类
E.coliDNA连接酶 E.coliDNA连接酶:黏性末端 连接酶:
T4DNA连接酶:黏性末端和平末端 DNA连接酶 连接酶:
陆丰龙山中学
基因进入受体细胞的载体－ 分子运输车” 基因进入受体细胞的载体－“分子运输车”
质粒 基因工程的载体种类： λ噬菌体的衍生物 动植物病毒 载体的作用：将外源基因送入受体细胞。 载体的作用：将外源基因送入受体细胞。
陆丰龙山中学
基因工程概念
基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。 基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。 基因拼接技术 重组技术 通俗的讲就是按照人们的意愿， 通俗的讲就是按照人们的意愿，把一种基因提取 出来，加以修饰改造，通过体外DNA重组和转基 出来，加以修饰改造，通过体外DNA重组和转基 DNA 因等技术，转入另一生物细胞内， 因等技术，转入另一生物细胞内，定向的改造生 物的遗传性状。 物的遗传性状。
陆丰龙山中学
抗虫棉的培育
苏云金杆菌
毒蛋白基因
毒蛋白 棉花植株细胞内
杀死害虫
陆丰龙山中学
DNA重组技术的基本工具 1.1 DNA重组技术的基本工具
基本工具： 基本工具： 限制性核酸内切酶—— 分子手术刀” ——“ （1）限制性核酸内切酶——“分子手术刀” DNA连接酶——“分子缝合针” 连接酶—— （2）DNA连接酶——“分子缝合针” 基因进入受体细胞的载体—— ——“ （3）基因进入受体细胞的载体——“分子 运输车” 运输车”
高中生物新课标必记知识归纳(选修3)
16、单克隆抗体的制备：骨髓瘤细胞和已免疫的小鼠脾脏中的B淋巴细胞融合，再用特定的选择培养基进行筛选，只有融合的杂种细胞才能生长。这种杂交细胞的特点是：既能迅速大量繁殖，又能产生专一的抗体。对上述经选择性培养的杂量的能分泌所需抗体的细胞。最后，将杂交瘤细胞在体外进行大规模培养或注射到小鼠腹腔内增殖，这样，从细胞培养液或小鼠腹水中，就可以提取大量的单克隆抗体了。
12、检测目的基因是否插入到受体细胞的基因组中，是否转录出mRNA的方法：DNA分子杂交技术（用目的基因做探针，如果显示出杂交带则成功）。
13、检测目的基因是否翻译成蛋白质的方法：抗原——抗体杂交。
14、除了分子检测外，有时还需要进行个体水平的鉴定，方法是：抗虫或抗病的接种实验。
15、目的基因的获取：从已有物种中直接分离，也可以人工合成。
2、受精：是精子与卵子结合形成合子的过程。包括受精前的准备阶段和受精阶段：准备阶段1——精子获能，准备阶段2——卵子的准备，受精阶段主要包括：精子穿越放射冠和透明带，进入卵黄膜，原核形成和配子结合（受精过程中，首先发生顶体反应；在精子触及卵黄膜的瞬间，发生透明带反应，这是防止多精入卵的第一道屏障；精子入卵后，发生卵黄膜封闭作用，这是防止多精入卵的第二道屏障。）
高中生物《选修3》
第一章
1、DNA重组技术，实现这一精确的操作过程至少需要三种工具，即准确切割DNA的“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）、将DNA片断再连接起来的“分子缝合针”——DNA连接酶、将体外重组好的DNA导入受体细胞的“运输工具”——运载体。
2、限制酶：主要从原核生物中分离纯化出来，能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。形成黏性末端和平末端两种。
限制性核酸内切酶——分子手术刀
1.能识别和切割DNA分子一小段特殊核苷酸序列；
限制性核酸内切酶的切பைடு நூலகம்方式
错切--黏性末端
平切--平末端
重播
DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏 性末端”。被同一种限制切断的几个DNA具有相 同的黏性末端，能够通过互补进行配对。
基因的针线──DNA连接酶
作用?对基因工程诞生的意义?
连接酶的作用是：将互补配对的两个 黏性末端连接起来，使之成为一个完整的 DNA分子。
DNA聚合酶和DNA连接酶有何 相同和不同点？
基因进入受体细胞的载体 要让一个从甲生物细胞内取出 来的基因在乙生物体内进行表达， 首先得将这个基因送到乙生物的细 胞内去！能将外源基因送入细胞的 工具就是载体。
作为基因工程的载体有哪些?最常用的 是什么?
大肠杆菌质粒的分子结构示意图
有标记基因的存 在，将来可用含 青霉素的培养基 鉴别。
知识平台：
DNA是遗传物质的发现 1、基因工程诞生的理论基础是-----------遗传信息传递方式的认定 DNA双螺旋结构的确立 -------------------- -------------------
2、---------- ------------------的 发现与应用，又为基因工程的创建提供了技术 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 上的保障。 ---------和--------为基因的分 载体 离和重组提供了必要的手段，而------能够将外源基因运送到受体细胞中，达到基因 工程的目的。
大肠杆菌的含卡那霉素
抗性基因的质粒
DNA连接酶
重组质粒 大肠杆菌 (抗四环素和卡那霉素)
限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
• 从哪里可以找到这种切割外来的 DNA而对自身不切割的物质？ • 这种酶具有什么作用？ • 这种酶如何识别和切割DNA分子?
基因工程的基本工具(一)
基因工程的基本工具（一）1．基因工程是指在______通过人工“______”和“____________”等方法，对生物的基因进行的______和重新组合，然后______受体细胞并使重组基因在受体细胞中______，产生人类需要的____________的技术，又称为________技术。
基因工程是在______水平上操作、改变生物的______________的技术，包括基因的______、____________、______以及在受体细胞内的______和______等过程。
2．限制性核酸内切酶（分子手术刀）(1)第一种限制酶从________________中分离并纯化。
(2)作用：每种限制性核酸内切酶只能识别DNA分子的________________，且在特定位点上切割DNA分子。
(3)切割结果：大部分限制性核酸内切酶在切开DNA双链时，切口处两个末端都带有由若干____________组成的单链，这种单链被称为______末端。
3．下列关于基因工程的叙述，不正确的是()A．基因工程的原理是基因重组B．运用基因工程技术，可使生物发生定向变异C．一种生物的基因转接到另一种生物的DNA分子上，属于基因工程的内容D．是非同源染色体上非等位基因的自由组合4．以下有关基因工程的叙述，正确的是()A．基因工程是细胞水平上的生物工程B．基因工程的目的是获得目的基因表达的蛋白质产物C．基因工程产生的变异属于人工诱变D．基因工程育种的优点之一是可以定向地使生物产生可遗传的变异5．下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。
请回答下列问题：图1图2(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前、后，分别含有________个游离的磷酸基团。
(2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越________。
(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。
现代生物科技专题应掌握的100个词句
《现代生物科技专题》应掌握的100个词句1、限制性核酸内切酶：基因工程的剪刀，分子手术刀。
具有特异性，只能识别特异序列，而且从特定位点加以切割。
切割后可能形成黏性末端或平末端。
2、DNA连接酶：基因工程的针线，分子缝合针，连接DNA双链片段，将骨架上的3，5—磷酸二酯键连接。
3、载体（运载体）：基因工程的运输工具。
包括噬菌体、质粒、动植物病毒等。
最常用的质粒为大肠杆菌质粒。
4、目的基因的获取：从供体细胞中分离、人工合成目的基因、从基因文库中获取目的基因、PCR技术扩增。
5、基因表达载体的构建：基因工程的核心步骤，包括启动子、目的基因、终止子、标记基因、复制原点。
构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在、遗传给下一代，而且使目的基因在受体细胞中表达和发挥作用。
6、将目的基因导入受体细胞：农杆菌转化法（最常用）、基因枪法、花粉管通道法（植物）；显微注射法（动物）；Ca2+处理使微生物细胞处于感受态。
7、目的基因检测与鉴定：DNA分子杂交法（检测目的基因是否整合到受体细胞基因组上）、分子杂交法（DNA-mRNA分子杂交法）（检测目的基因是否转录出mRNA）、抗原—抗体杂交法（检测目的基因是否翻译出蛋白质）、个体水平检测法<观察生物是否表现出特定性状如病原体（虫）感染法>8、植物组织培养：理论基础是植物细胞的全能性，核心步骤是脱分化和再分化，离体的植物组织、器官、细胞脱分化会形成愈伤组织，在植物组织培养过程中需要加入生长素和细胞分裂素等植物激素，在再分化过程中愈伤组织的发育方向主要有细胞分裂素和生长素的比值决定，比值高形成芽，比值低形成根（愈伤组织的是向根和芽发育还是向胚状体发育取决于该比值）。
要使高度分化的植物细胞恢复分裂能力应该采取离体、脱分化的措施。
植物组织培养的应用是快速繁殖、提取药物、获得人工种子、培养无病毒植物（根尖和茎尖没有病毒。
常用茎尖进行培养获得）等。
9、植物体细胞杂交：用酶解法去掉细胞壁，获得有活力的原生质体；原生质体融合（物理法如离心、振动、电刺激；化学法如聚乙二醇）；诱导出现新的细胞壁（质壁分离和复原法进行检查）；将杂种细胞培养成杂种植物。
DNA重组技术的基本工具定稿
形成两种末端 4、结果： 结果：
基因的针线──DNA连接酶 ──DNA 二、基因的针线──DNA连接酶
连接酶有两种： 连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得 到的，称之为E·coli连接酶。另一种是从 连接酶。 到的，称之为 连接酶 T4噬菌体中分离得到，称为 4连接酶。 噬菌体中分离得到， 噬菌体中分离得到 称为T 连接酶。
第三阶段
精子细胞
变形
精子
精子细胞变形中的主要变化： 精子细胞变形中的主要变化：
1.细胞核—— 1.细胞核—— 精子头的主要部分 细胞核 2.高尔基体—— 2.高尔基体—— 头部的顶体 高尔基体 3.中心体—— 3.中心体—— 精子的尾 中心体 4.线粒体—— 线粒体鞘膜(尾的基部) 4.线粒体—— 线粒体鞘膜(尾的基部) 线粒体 5.细胞内其他物质—— 原生质滴(球状, 5.细胞内其他物质—— 原生质滴(球状, 细胞内其他物质
二、基因表达载体的组成： 基因表达载体的组成：
a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因
三、将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入 植物细胞 方法 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
将目的基因导入 ——显微注射法 显微注射法 动物细胞 将目的基因导入 ——感受态细胞 感受态细胞 微生物细胞
(二)利用PCR技术扩增目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 PCR
聚合酶链式反应 概念：PCR全称为_______________， 全称为_______________ ① 概念：PCR全称为_______________，是一项 特定DNA DNA片段 体外 特定DNA片段 在生物____复制___________ ____复制___________的核酸合成技术 在生物____复制___________的核酸合成技术 DNA复制 ②原理：__________ 原理： DNA复制 已知基因的核苷酸序列 ③条件：_______________________、 条件：_______________________、 四种脱氧核苷酸 _______________、 一对引物 _______________、___________ 、 DNA聚合酶 DNA聚合酶 ___________. 指数 方式扩增， ____（ 方式： _____方式扩增 ④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 2n 环的次数） 环的次数） 结果： ⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
分子生物学第四章--基因工程常用工具酶
同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。
同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。
B．以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。
粘性末端：（Cohesive Ends）两个突出末端可退火互补— — DNA是分子重组的基础
15
同裂酶
又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别 序列。 在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平 头末端，称为同识同切； 切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端， 称为同识异切。
第四章 基因工程常用工具酶
1
Manipulating Genes
- Transferring Genes
Restriction Ligation Extract DNA
Transformation
Selection
Culturing
2
重组DNA实验中常见的主要工具酶
3
我们的基本目的是：把外源基因与载体 连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以 下两类工具酶：
23
如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，
产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的
DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。
24
限制性内切酶的剪切方式
25
Yu Zheng, et al. Using shotgun sequence data to find active restriction enzyme genes. Nucleic Acids Res., 2009, 37: e1. Whole genome shotgun sequence analysis has become the standard method for beginning to determine a genome sequence. The preparation of the shotgun sequence clones is, in fact, a biological experiment. It determines which segments of the genome can be cloned into Escherichia coli and which cannot. By analyzing the complete set of sequences from such an experiment, it is possible to identify genes lethal to E. coli.
DNA重组技术的基本工具
新课导入你敢吃这些“转基因”辣椒吗？角似鹿、鼻似狮、目似虎、唇似牛、爪似鹰、髭似马、鳞似鱼、身似蛇呼风唤雨腾云驾雾专题一基因工程1.1 DNA重组技术的基本工具教学目标知识目标简述DNA重组技术所需三种基本工具及其作用。
认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
能力目标情感态度与价值观1、关注基因工程的发展前景。
2、了解国内外科研成果，唤起学习积极性。
重点难点教学重难点DNA重组技术所需的三种基本工具的作用。
基因工程载体需要的条件。
基因工程需要哪些基本工具?基因工程的“专用工具”一“分子手术刀”——限制性核酸内切酶二“分子缝合针”——DNA连接酶三“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。
能将外来的DNA 切断，由于这种切割作用是在DNA 分子内部进行的，故名限制性内切酶。
4000种1、来源：2、种类：一、“分子手术刀”—限制性核酸内切酶3、限制酶切割DNA分子示意图A PC PG P T P APCPGPT4、限制酶切割的是哪个部位的键?在特定位点水解磷酸二酯键一5、限制酶的作用结果是什么？形成黏性末端或平末端当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的DNA 两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
特点：单链凸出G//CTTAA AATTC//G什么叫黏性末端？⑴当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA 两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
特点：没有单链凸出CCC GGG GGG CCC CCC GGG GGG CCC什么叫平末端？⑵6、内切酶与解旋酶的区别二、“分子缝合针”——DNA连接酶DNA 连接酶的作用是什么？分为哪两类？DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？G A A T T C C T T A A G G A A T T CC T T A A GG C T T A AA A T T CGG C T T A AA A T T C GG C T T A A A A T T CG Ecol Ⅰ切割在脱氧核糖与磷酸基之间形成磷酸二酯键1、种类①从大肠杆菌中分离得到：EcolⅠDNA连接酶，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接。
高中生物选修三必考知识点总结
高中生物选修三必考知识点总结专题1 基因工程基因工程：是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA 重组技术。
（一）基因工程的基本工具1. “分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2. “分子缝合针”——DNA连接酶（1）两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA 连接酶）的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
（2）与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。
DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3. “分子运输车”——载体（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
（2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
（3）其它载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。
（二）基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取1. 目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。
2. 原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。
人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。
3. PCR技术扩增目的基因（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。
基因工程的基本工具
中轴线
要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切点？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？
要切两个切点，产生四个黏性末端，两个。
如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性末端。
是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成 重组的DNA分子了?
E·coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
功能
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复磷酸二酯键
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和平末端(效率较低)
相同点
差别
DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同点和不同点？
DNA连接酶
DNA聚合酶
连接DNA链
ห้องสมุดไป่ตู้
连接部位
相同点
双链
单链
在两DNA片段之间形成磷酸二酯键
将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键
实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。
思考题：
2、ＤＮＡ连接酶——“分子缝合针”
种类：作用部位：
是磷酸二酯键，
将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 ,这样一个重组的DNA分子就形成了。
不是氢键。
E·coliDNA连接酶与T4DNA连接酶比较：
类型
《生物选修三》PPT课件
【解题关键】首先要明确不同的限制酶有特定的识别 序列，其次要分析切割下的黏性末端能否互补，另外要注意 互补序列的正确书写。
38
ppt课件
【典例3】(2010·江苏高考改造)下表中列出了几种限制酶 识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的 酶切位点。请回答下列问题：
39
ppt课件
(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有 ____个游离的磷酸基团。 (2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质 粒的热稳定性越_____。
36
ppt课件
3.载体的种类 (1)细菌质粒，它是细菌拟核DNA以外的小型环状DNA，有的 细菌只有一个，有的细菌有多个。 (2)λ噬菌体的衍生物和某些病毒的DNA。 一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人 们根据不同的目的和需求，对某些天然的载体进行人工改造。
37
ppt课件
①最常用的载体是质粒，它来源于细菌和酵母菌等 生物，其上的基因属于细胞质基因。它能自我复制，既可在 自身细胞、受体细胞复制，也可在体外复制。 ②主动运输中载体蛋白的化学本质是蛋白质，其作用是运输 离子、氨基酸、核苷酸等物质进出细胞。而基因工程中的载 体的化学本质是DNA，其作用是携带目的基因进入受体细胞。
40
ppt课件
(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ 切割，原因是_____________________________________。 (4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ 两种限制 酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_______。 (5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混 合，并加入_____酶。
基因工程知识点超全
基因工程一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的额，因此又叫做DNA重组技术。
二、基因工程的基本工具1、限制性核酸内切酶“分子手术刀”2、DNA连接酶-----"分子缝合针”3、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”1．“分子手术刀”计计限制性核酸内切酶（限制酶）（1）存在：主要存在于原核生物中。
（2）特性：特异性，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
（3）切割部位：磷酸二酯键（4）作用：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
（5）识别序列的特点：瓠腿沛外林蔚黔睫混日龄睫GC G C用处题挪班岫如」「肿第 CCCG 切割后末端的种类醐帆DNA 分子经限珊片段末端通常有两 种形式产产在它识别序列的条链分别切开时，和平末端。
当限制酶中轴线两侧将DNA的两产生的是黏性末端，当限制酶在它识别序列的 中轴线处切开时，产生的则是平末端。
£coRIGAA ｛在G与ACTT 之间切割）TTC AAG中轴线CCC ：GGG CTTAA黏性末端CCC AATTCGGG Sma I（在G 与C 之间切割）GGG|CCCGGGGCC3.分子运输车载体 ⑴载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA 片③具有标记基因，供重组DNA 的鉴定和选择。
(2)最常用的载体是质粒，它是能力的双链环状DNA 分子。
⑶其他载体：九噬菌体的衍生物、动植物病毒。
(4)载体的作用：①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。
②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
【解题技巧】(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
基因工程制药技术 基因工程常用工具
三、基因载体2、载体选择标准能自主复制具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定有克隆位点（外源DNA插入点）即多个单一酶切位点分子量小，以容纳较大的外源DNA3、常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA
Part2 基因工程操作工具
三、基因载体（1）质粒DNA存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子具有自我复制功能（松弛、严紧）带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。经改造后具有多克隆位点
Part2 基因工程操作工具
二、DNA连接酶2、不同的DNA连接酶对比
连接酶
底物
辅助因子和激活因子
温度
巯基试剂
黏性末端
平末端
DNA-RNA杂合体
RNA-RNA杂合体
大肠杆菌DNA连接酶
可行
可行
不行
不行
NAD+，Mg2+（1~3mmol/L）
黏性末端：10~15 ℃补平缺口：37 ℃
无
T4DNA连接酶
生化制药工艺
项目五 基因工程制药
1
基因工程的概念
2
基因工程操作工具
3
基因工程操作流程
目ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ录
CONTENTS
基因工程常用工具
02
Part2 基因工程操作工具
一、基因工程操作工具1、基因工程操作要求基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是无法进行的。2、基因工程操作工具“分子手术刀”----限制性核酸内切酶 “分子缝合针” ---- DNA连接酶 “分子运输车” ----载体
Part2 基因工程操作工具
二、限制性内切酶1、工具酶
工 具 酶
功 能
(完整版)人教版生物选修三【全】
(3)常用受体细胞
大肠杆菌（E.coli）
（四）目的基因的检测与鉴定
目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能 够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、 鉴定才能得知。
常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。
1.分子水平 （分子杂交技术） （1）检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因
C 离体棉花 诱导选择叶片组织
请据图回答：
（1）A过程需要的酶有______限__制__性__内__切__酶__和__D_N__A_连__接__酶_________。
（2）B过程及其结果体现了质粒作为运载体必须具备的两个条件是
___具__有__标__记__基__因__；__能__在__宿__主__细__胞___内__复__制__并__稳__定__保__存______。
抗虫基因 含kanr质粒
转基因 抗虫植株
A 构建
重组质粒
导入
土壤农杆菌 B 培养选择
含重组质粒 土壤农杆菌
侵染
D 检测
再生植株
分化
愈伤组织
C 离体棉花 诱导选择叶片组织
（5）科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德尔 遗传规律。
①将转基因植株与____非__转__基__因__植__株__________杂交，其后代中抗卡那 霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为1：1。
基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、 土壤农杆菌和动植物细胞等。
导入受体细胞的方法主要是借鉴细菌或病毒侵染细 胞的途径，且因受体细胞的不同而不同。
1.导入植物细胞 （1）农杆菌转化法
（2）其他方法
• 基因枪法 • 花粉管通道法
高考生物真题专项解析—转基因生物,从基因工程中溯源
高考生物真题专项解析—转基因生物，从基因工程中溯源考向一基因工程【母题来源】2022年全国乙卷【母题题文】(2022·全国·高考真题)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。
回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。
这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是______，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。
根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA 中的______来进行。
PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明______(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明______。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。
已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。
为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。
基因工程的基本操作流程是______。
[答案](1)逆转录酶##反转录酶(2) 特异性核苷酸序列退火##复性(3) 曾感染新冠病毒，已康复已感染新冠病毒，是患者(4)获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定(检测受体能否产生S蛋白)【试题解析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；过程：①高温变性：DNA解旋过程(PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开)；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
(1)分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT-PCR法需要先得到cDNA，由RNA 到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶(反转录酶)。
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物质
作用
解旋酶 DNA聚合酶
DNA连接酶
双链—单链 连接DNA单链
连接DNA双链
限制性内切酶 切割DNA双链
作用的 化学键
氢键 磷酸二 酯键
基因的载体——“分子运输车”
载体的作用： 1、将外源基因转移到受体细胞中去。
2、利用运载体在受体细胞内，对外源 基因进行大量复制并表达。 常用的载体有：（多为人工改造） 质粒，λ噬菌体的衍生物，动植物病
• （1）从人的淋巴细胞中取出干扰素基因，一般是
用
的方法，此基因在基因工程中称
为
。
• （2）此基因与细菌的质粒相结合要依靠
，
其作用部位是磷酸二酯键，然后将目的基因移植
D、切断b处的为限制性内切酶
基因工程的基本操作程序
❖目的基因的获取 ❖基因表达载体的构建（核心） ❖将目的基因导入受体 细胞 ❖目的基因的检测与鉴定
操作过程
一、目的基因的获取
1、目的基因的获取： 从已有物种中直接分离， 人工合成（基因比较小，序列已知增目的基因 （3）人工合成
毒等
载体必须具备的条件：
1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；
2、具有一个或多个限制酶切点，以便与外 源基因连接；
3、具有某些标记基因，便于进行筛选。 （如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色 反应的基因等 ）
4、对受体细胞无害。
例3、依右图有关基因工程的工具酶功能的 叙述，不正确的是
A、切断a处的酶为限制核酸性内切酶 B、连接a处的酶为DNA连接酶 C、切断b处的酶为解旋酶
• A．②③ B ①③ C ①③⑤ D①③④
• 5.下列育种所采用的生物技术或原理依次是 • 美国科学家将生长激素基因注入小白鼠的受精卵中，
得到了体型巨大的“超级小鼠”；
• “人鼠嵌合抗体”的合成；
• 荷兰科学家将人乳高铁蛋白基因移植到牛体内，牛产 出含高铁蛋白的牛奶；
• 遨游过太空的青椒种子培育的“太空椒”比正常青椒 大一倍
(三)将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法 导入植物细胞 基因枪法
花粉管通道法 方法 导入动物细胞 ——显微注射法
导入微生物细胞 —— 感受态细胞吸收 DNA分子
(四)目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法—— DNA分子杂交
杂交带有无 检测— ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原-抗体杂交 鉴定— 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
• ①基因工程 ②蛋白质工程 ③诱变育种 ④杂交育种 • A.②③②④ B.①①②③
• C.①②①③ D.①②①④
• 6．（10分）干扰素是治疗癌症的重要药物，它必 须从血中提取，每升人血只能提取0.5μg，所以 价格昂贵。现在美国加利福尼亚州的基因公司用 如下图的方式生产干扰素A
95OC
55OC
72OC
高温变性
绿色是引物
低温复性 中温延伸
(2)PCR技术—聚合酶链式反应
• 原理： DNA双链复制的基本原理
• 前提： 一段已知目的基因的核苷酸序列
• 条件：四种脱氧核苷酸
DNA重组技术的基本工具
限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
分布：主要在原核生物中 作用特点：
一种限制酶只能识别一种特定 的核苷酸序列,并在特定切点切 割
限制性核酸内切酶
EcoRI限 制酶
切点：磷酸二酯键
.切点：磷酸二 酯键
3.结果： 黏性末端和平末端
DNA连接酶——“分子缝合针”
DNA连接酶——“分子缝合针”
PCR扩增仪
DNA的两条链为模板
热稳定DNA聚合酶(Taq酶）
一对引物
温度控制
(二)基因表达载体的构建 —— 核心 切口
二、基因表达载 体的构建
1基因表达载体的组成
a、目的基因
b、启动子
c、终止子
d、标记基因
DUCK17Biblioteka 制作抗生素抗 性基因(三)将目的基因导入受体细胞
转化—— 目的基因进入_受__体__细__胞__内，并且在 受体细胞内维持__稳__定_和_表__达__的过程
使其凝血功能恢复正常，那么，后来她所
生的儿子中
A．全部正常
B.一半正常
C.全部有病
D.不能确定
• 4、下列技术依据DNA分子杂交原理的是： • ①用DNA分子探针诊断疾病
②B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的杂交
• ③用基因探针快速灵敏地检测水中病毒的 含量
④目的基因与运载体结合成重组DNA分子 ⑤利用单克隆抗体诊断疾病。
5.哪项不是基因表达载体的组成部分( )
A.启动子
B.终止密码
C.标记基因
D.目的基因
6.下列哪项不是将目的基因导入植物细 胞的方法( )
A．基因枪法
B．显微注射法
C.农杆菌转化法 D．花粉管通道法
基因工程硕果累累
转基因植物 转基因动物 基因工程药物 基因治疗
（三）用转基因的动物生产药物
药用蛋白基因 与乳腺蛋白基
导
入 受精卵
发育成 转基因动物
因的启动子重 组
分泌
乳汁
（含药用蛋白）
乳腺生物反应器
四、基因治疗曙光初照
1、基因治疗： 把正常基因导入病人体内，使该
基因的表达产物发挥功能，从而达到治 疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有 效的手段。
五、基因芯片（基因诊断 、基因测序等）
从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就 可以得出标准图谱；从病人的基因组中分离出DNA与 DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。
3、蛋白质工程的基本途径 预期的蛋白质功能
设计预期的蛋白质结构
推测应有的氨基酸序列
找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）
• 1．与“限制性内切酶”作用部位完全相 同的酶是
• A．反转录酶； B．RNA聚合酶； • C．DNA连接酶； D．解旋酶；
3.如果科学家通过转基因工程，成功地把
一位女性血友病患者的造血细胞进行改造，
通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的 DNA信息。
原理：DNA分子杂交技术
1、基因工程产物 基因工程在原则上只能生产自然界已存在
的蛋白质。
这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的, 它们的结构和功能符合特定物种生存的需要,却不一 定完全符合人类生产和生活的需要。
2、蛋白质工程产物： 是自然界原本不存在的新的蛋白质。