米曲霉磷酸果糖激酶基因克隆及序列分析
米曲霉β呋喃果糖苷酶基因克隆及生物信息学分析
摘 要：Ｄ．呋喃果糖苷酶水解蔗糖和低聚果糖，酶法生产高纯度低聚果糖，必须抑制或消除Ｄ．呋喃果糖苷酶的 水解活性。本研究以工业生产低聚果糖的米曲霉菌株ＧＸ００１５为研究材料，采用ＲＴ．ＰＣＲ技术，克隆获得Ｄ．呋喃 果糖苷酶基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＥＵｌ３０９４４）。利用生物信息学手段对Ｄ．呋喃果糖苷酶基因进行分析得知：该酶为 ４５６个氨基酸组成的亲水性膜外蛋白；功能域分析结果显示：该酶从第５２个至第４５６个氨基酸残基之间序列属于糖 苷酶３２家族特征序列，并具有镛苷酶３２家族酶活性中心的（Ｎ／Ｇ）ＤＰ（Ｃ／Ｎ）Ｇ和ＲＤＰ保守序列；米曲霉Ｄ．呋喃果糖 苷酶在进化树上的位置处于酵母菌的转化酶和细菌的六磷酸蔗糖水解酶之间。 关键词：ｐ．呋喃果糖苷酶；克隆；生物信息学分析
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｏｒ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＦＯＳ ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｎｌｄｙ．ａ １３－ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ
ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｗｉｔｈ ＲＴ—ＰＣＲ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＧＸ００１５ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ａ ｋｅｙ ｓ廿ａｉｌＩ ｆｏｒＦＯＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｌｙ．Ｔｈｉｓ ｇｅｎｅ ｗａｓ
根据米曲霉ＲＩＢ４０菌株的１３．呋喃果糖苷酶基因 （ＧｅｎｅＢａｎｋ访问号：ＢＡＥ６１ ７９９）序列设计扩增米曲霉 ＧＸ００１５菌株中１３．呋喃果糖苷酶基因的引物。
上游引物：５’ＧＧＧＱ鱼！△￡￡ＡＴＡＡＴＧＧＴＧ ＡＴＧＣＣＡＧｒｒＩ［１℃ＧＣＡＧＧＡＴＧＣ ３’
下游引物：５‘ＧＧＧＱ△Ｑ￡Ｉ￡ＴＧＡＴＧＣＴＴＣ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ ｔｏ ＧｅｎＢａｎｋ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＥＵｌ３０９４４）．Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃａｌｌｙ．Ｔｈｅ
米曲霉基因表达研究进展及应用 (1)
专题论述中国酿造2008年第12期总第189期1米曲霉基因表达研究进展及应用李方方,潘 力(华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006)摘 要:米曲霉被广泛地用在同源基因和外源基因的表达系统,米曲霉在不同培养条件下的基因表达有很大不同,很多涉及重要酶系如蛋白酶、糖化酶的基因存在着不同的表达调控,对同源蛋白的表达调控的研究基础上,外源蛋白在米曲霉中的表达也有很大的进展,有研究正调节非折叠蛋白应答效应的基因对外源蛋白的表达有一定的促进作用,该文简要综述了米曲霉内源基因表达谱和重组蛋白表达系统的研究成果,开拓了米曲霉更为广阔的研究前景。
关 键 词:米曲霉;基因表达;外源蛋白中图分类号:T S201 3 文献标识码:A 文章编号:0254-5071(2008)12-0001-03The advance of ge ne expression of Aspergill u s oryzae and t he applicationL I F ang fang ,PAN L i(Colle ge of B ioscience an d E n g i neering ,Sout h China Universit y of T echnology,Guangzhou 510006,China )Abstract :The A spergillus oryzae has been used i n the production o f tradi ti onal fer mented foods f or more t han 1,000years A oryzae has t he abilit y t o s e crete large a m ounts o f a w i de range of different pro t e i ns i nt o its cult ure and it does n t secrete a ?a t oxi ns ,A oryzae i s listed asGRAS by the U S Food and D rug Ad m i nistra andW or l dH ea lt h O rganizati on ,Because of thi s ,A oryzae as recei ved i ncreasi ng attenti on as a host for ho mo l ogous and hetero l ogous gene expression The gene expressi on of A oryzae is different in different cult ure ,many gene code g l yco l ytic and proteol y tic enz y m es are regul ated i n differ ent environ m en,t on t he basi s of research about ho m ol ogous gene ,t he hetero l ogous gene expression has recei ved great devel op men,t so m e gene of up regul a ted UPR can promote t he level o fheterologous gene expressi on i n A oryzae ,but t o all hetero l ogous gene ,it i s not cert a i n ans wer ,t he current researches of ho mo l ogous and het ero l ogous gene expression were i ntrod uced i n t his paper ,t hese researches illu m i nate t he utili zati on of A oryzae i n i ndustry ,moreover ,expand t he pers pecti ve o f A oryzaeKey words :A s p ergillus oryzae ;gene expressi on ;hetero l ogous prote i n收稿日期:2008 03 24作者简介:李方方(1982 ),山东聊城人,在读研究生,研究方向为微生物学、生物化工及食品。
米曲霉6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(gnd)的克隆及生物信息学分析
Ｆ ｊａ ｏ ｒ ａ ｆ Ａ ｒｃ ｌ ｒ ｌ ｃｅ ｃｓ ｕ ｉｎＪ ｕ ｎ ｌ ｇ ｉ ｔ ａ ｉ ｅ ｏ ｕ ｕ Ｓ ｎ
文 章编 号 ： １ ０ ～０ ８ Ｉ ０ ２ ４ ３ ４ ６ ０ ８ ３ ４ １ ）０ — ９ —０ ２
中图 分 类 号 ：Ｓ ８ ２ ５ 文 献 标 识 码 ：Ａ
Ｃｌ ｎｉ ｇ ａ ｏ ｎｆ ｒ ａ ｉ ａ ｙ ｉ ｆ６ Ｐｈｏ ｌ ｃ ｎ ｔ ｈｙ ｒ ｇ ｎ ｓ ｎｅ ｆ ｏ ｏ ｎ ｎｄ Ｂｉ ｉ ｏ ｍ ｔｃ Ａｎ ｌ ｓｓｏ － ｇ ｕ ｏ ａ ｅ Ｄｅ ｄ ｏ ｅ ａ ｅ Ｇｅ ｒ ｍ
列与黄曲霉 ６ Ｇ Ｐ ＤＨ 基 因 的 同 源 性 为 ９ ，存 在 的 丝 氨 酸 、苏 氨 酸 和 酪 氨 酸 磷 酸 化 位 点 分 别 有 １ 、２和 ６个 ； ９ １
６Ｇ Ｐ ＤＨ 蛋 白分 子量 为 ５ ． Ｄ，等 电点 为 ５ ６ ；ｇ ｄ基 因 编码 蛋 白二 级 结 构 ａ螺 旋 区 域 占 ４． ７ ，Ｂ折叠 区域 ７ ３ｋ ．３ ｎ 一 ４５％ 一 占 １ ． ９ ，无 规 则 卷 曲 区域 占 ４ ． ４ ；氨 基 酸 残 基 １ ～１ ５位点 为 ＮＡ Ｐ ２ ７ ２ ６ １ ９ Ｄ 结 合 区域 。 关 键 词 ：米 曲 霉 ； － 酸 葡 萄糖 酸脱 氢 酶 ；克 隆 ；生 物 信 息 学 ６磷
Ａ ｓ ｒ ｉｌ ｒ ｚ ｅ ｐｅ ｇ ｌｕｓｏ ｙ ａ ｗ Ｕ ｉｇｊ ｇ Ｊｎ —ｉ 。ＨＯＮＧ ｈ— ｏ ｇ Ｈ ＡＮＧ ，ＣＨ Ｅ Ｈ ｏ ｇｗｅ ｎ Ｚ ｉ ｎ ，Ｚ ｈ Ｋａ Ｎ ｎ — ｎ
（ ｐ ｒｍｅ ｔ ｆ ｏｎ ｉｅ ｒｎ ＆ Ｂｉｔｃ ｎ ｌｇ Ｄｅ ａ ｔ ｎ Ｂｉｅ ｇ ｎ ｅ ｉｇ ｏ ｏｅ ｈ ｏｏ ｙ，Ｃｏｌｇｅ ｆ Ｃ ｅ ｃ ｌＥｎ ｉ ｅｒｎ ｌｅ ｈ ｍｉａ ｇ ｎ ｅ ｉｇ，Ｈｕ ａ ｉｅ ｓｔ ｏ ａＱｉｏＵｎ ｖ ｒｉｙ，
米曲霉木糖还原酶基因的克隆及序列分析
2013,42(3):187-192.Subtropical Plant Science米曲霉木糖还原酶基因的克隆及序列分析洪志宏，杜 钰，林 毅，陈宏文（华侨大学化工学院生物工程与技术系，福建厦门361021）摘 要：木糖还原酶（XR, E C 1.1.1.21）是真菌微生物代谢木糖的关键酶之一。
本文以米曲霉基因组DNA为模板，克隆木糖还原酶基因（xr，GenBank登录号：FJ957890.1），并对XR的序列、系统进化树、理化性质及蛋白结构等进行生物信息学分析。
结果表明：xr基因序列长1449 bp，其中开放阅读框长960 bp，编码319个氨基酸，蛋白质分子质量35.9 kDa，等电点为5.78；米曲霉XR与其他菌种XR有较高的同一性，含有醛酮还原酶家族的两个指纹结构和一个参与辅酶结合活性位点指纹结构，以及醛酮还原酶家族典型的（β/α）8 TIM 桶结构，说明米曲霉XR属于醛酮还原酶家族。
关键词：米曲霉；木糖还原酶；克隆；序列分析Doi: 10.3969/j.issn.1009-7791.2013.03.001中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2013)03-0187-06Cloning and Sequence Analysis of Xylose Reductase Gene fromAspergillus oryzaeHONG Zhi-hong, DU Y u, LIN Yi, CHEN Hong-wen(Department of B ioengineering & Biotechnology, C ollege o f C hemical E ngineering, H uaqiao University, X iamen 361021, Fujian China)Abstract：Xylose reductase (XR, EC 1.1.1.21) is one of the key enzymes of xylose metabolism for the eukaryotic microorganism. The XR gene (xr) from Aspergillus oryzae was amplified by PCR and cloned (GenBank a ccession num ber: FJ957890.1). T hen t he s imilarity of a mino a cid s equences, phylogenetic trees, physic-chemical property and protein structure were analyzed bioinformatically.Sequence analysis reveals that the length of xr is 1449 bp, which contains 960 bp open reading frame encoding 319 a mino a cids. A. oryzae XR ha s hi gh s equence i dentity w ith ot her strain X R. The presence of t wo aldo-keto reductase f amily s ignatures, a putative coe nzyme-binding active s ite signature and a typical parallel beta-8/alpha-8-barrel tertiary structure suggests that XR is a m ember of aldo-keto reductase superfamily. The obtained information lays the basis for the expression of XR and further research on xylose metabolic regulation and widely industrial application of A. oryzae.Key words：Aspergillus oryzae; xylose reductase; cloning; sequence analysis木质纤维素是目前世界上最丰富的生物质资源和可再生资源，其水解产物中的木糖是自然界中含量仅次于葡萄糖的第二大糖类，被广泛应用于乙醇和木糖醇等工业生产中。
《甜瓜CmPYL4、CmPYR1基因在果实成熟过程中功能的初步分析》范文
《甜瓜CmPYL4、CmPYR1基因在果实成熟过程中功能的初步分析》篇一一、引言随着植物分子生物学和遗传学的发展，果实成熟过程中的基因调控机制逐渐成为研究的热点。
甜瓜作为一种重要的经济作物，其果实成熟过程中的基因调控研究对于提高果实品质和延长货架期具有重要意义。
本文旨在初步分析甜瓜CmPYL4、CmPYR1基因在果实成熟过程中的功能，为进一步揭示甜瓜果实成熟机制提供理论依据。
二、材料与方法（一）材料实验所用材料为不同成熟阶段的甜瓜果实，采集自同一批次的甜瓜植株。
（二）方法1. 基因克隆与序列分析：根据已知的甜瓜基因组信息，克隆CmPYL4、CmPYR1基因的cDNA序列，进行序列分析。
2. 表达模式分析：利用实时荧光定量PCR技术，检测CmPYL4、CmPYR1基因在不同成熟阶段甜瓜果实中的表达水平。
3. 转基因技术：构建过表达和沉默CmPYL4、CmPYR1基因的转基因甜瓜植株，观察其果实成熟过程中的表型变化。
4. 生物信息学分析：利用生物信息学软件，预测CmPYL4、CmPYR1基因的功能及其与其他基因的互作关系。
三、结果与分析（一）基因克隆与序列分析成功克隆了甜瓜CmPYL4、CmPYR1基因的cDNA序列，经序列分析发现，这两个基因均具有典型的植物激素受体结构域，可能与果实成熟过程中的激素信号转导有关。
（二）表达模式分析实时荧光定量PCR结果显示，CmPYL4、CmPYR1基因在甜瓜果实成熟过程中呈现不同的表达模式。
其中，CmPYL4基因在果实成熟早期表达量较高，而CmPYR1基因则在果实成熟后期表达量增加。
这表明这两个基因可能在不同阶段参与果实成熟的调控。
（三）转基因技术过表达和沉默CmPYL4、CmPYR1基因的转基因甜瓜植株表明，这两个基因对果实成熟过程具有显著影响。
过表达CmPYL4基因的转基因甜瓜果实提前进入成熟阶段，果肉变软、色泽更鲜艳；而沉默CmPYR1基因的转基因甜瓜果实在成熟过程中出现延迟现象，果肉保持硬挺、色泽暗淡。
米曲霉6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因gsdA的克隆及生物信息学分析
ＬＵ ｉＷＵ ｎ －ｎ ， Ｈ Ｎ Ｈｏ ｇｗ ｎ Ｉ Ｗｅ， Ｊ ｇ ｉｇ Ｃ Ｅ ｎ — ｅ ｉ ｊ
（ ｅ ａ ｏａｏｙｏ Ｉｄ ｓｉｌ ｉｔ ｈ ｏｏ ｙＦ ｊ ｎＰ ｏｉｃ， ａｉｏ ｉｅｓｙＸｉ ｎ３ １２ ， ｕｉ ｈｎ） Ｋ ｙＬ ｂ ｒｔｒ ｆｎ ｕｔａ Ｂｏｅ ｎ ｌｇ， ｕｉ ｒｖｎｅ Ｈｕｑａ ｖｒｉ ， ａ ６ ０ １Ｆ ｊ ｎＣ ｉａ ｒ ｃ ａ Ｕｎ ｔ ｍｅ ａ
ｈ ｄ ｏ ｈｌ ｎ ｙ ｏ ｓｓ ｎ ｆ ２ ｍｉｏａ ｉｓ Ｔ ｅｓ ｑ ｅ ｃ ｒ ｍ ２ ｏ １ ４ ＤＨＹ ｙ ｒ ｐ ｉ ｅ ｚ ｍｅｃ ｎ ｉｔ ｇｏ ２ａ ｎ ｃｄ ． ｈ ｅ ｕ ｎ ｅｆｏ １ ８ｔ （ ｉ ｃ ｉ ２ ３ ＩＧＫＥ） ｓｔｅ ｆ ｉ ｈ
巫 带柱 热 辫孝 ２２（ｌ５ １１：１ ０．３１。 ４）—
米 曲霉 ６磷酸葡萄糖脱氢酶基因 ｇｄ ． ｓＡ的克隆及
生物信息学分析
刘 薇 ，吴 晶 晶 ，陈宏 文
（ 华侨大学 工业生物技术福建省高等学校重点实验室 ，福建 厦 门 ３ １２ ） ６０１ 摘 要 ： ． 酸葡萄糖脱 氢酶催化６ 酸葡萄糖 生成６ 酸葡萄糖酸 ， ６ 磷 ． 磷 一 磷 并生成Ｎ Ｄ Ｈ， Ａ Ｐ 是微生物胞 内 酸戊糖 磷
Ｄｏ： ０３ ６￣ｉ ｎ１０ －７ １ ０ ２０ ．０ ｉ１ ． ９ ．ｓ． ９７ ９ ． １． ０ ３ ９ ｓ ０ ２ ３ 中图分类号 ：￥ ５ ８２ 文献标识码 ：Ａ 文章编号 ：１０ —７ １ ０ ２０ －０ １０ ０ ９７ ９ （ １）３０ １—５ ２
Ｃｌ ｎ ｎ ｎ ｏ ｎ ｏ ｍ ａ ｉ ａｙ ｉ ｆＧｌ ｏ ｅ ６ ｐ ｏ ｐ ａ ｅ１ ｄ ｈ ｄ ｏ ｅ ａ ｅ ｏ ｉ ｇａ ｄ Ｂｉ ｉ ｆ ｒ ｔｃＡｎ ｌ ｓｓｏ ｕｃ ｓ － 一 ｈ ｓ ｈ ｔ － ｅ ｙ ｒ ｇ ｎ ｓ
米曲霉pyrG基因克隆及其同源转化系统的建立
米曲霉pyrG基因克隆及其同源转化系统的建立王金良;陈宏文【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2010(031)011【摘要】建立以乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因(pyrG)为选择标志,以米曲霉为宿主菌的同源转化系统.以米曲霉基因组为模板,通过PCR扩增获得pyrG基因,将该片段与表达载体pMD18-T相连,转化大肠杆菌DH 5α,经蓝白斑筛选、PCR快速筛选、酶切和测序验证,获得重组质粒pMD-pyrG,完成pyrG基因的克隆.序列分析表明该基因与米曲霉KBN616的pyrG基因编码序列的同源性为99.9%,两者经推导的氨基酸的同源性为99.6%.以米曲霉pyrG营养缺陷株为受体菌,通过PEG/CaCl2诱导的原生质体转化方法,将重组质粒导入该受体菌,使米曲霉pyrG缺陷株发生基因转化,成为pyrG+,由此成功建立了以pyrG为筛选标记基因、同型米曲霉pyrG 基因缺陷株为受体菌的基因转化系统.【总页数】4页(P202-205)【作者】王金良;陈宏文【作者单位】华侨大学,工业生物技术福建省高等学校重点实验室,福建,泉州,362021;华侨大学,工业生物技术福建省高等学校重点实验室,福建,泉州,362021【正文语种】中文【中图分类】Q785【相关文献】1.米曲霉磷酸果糖激酶基因克隆及序列分析 [J], 张卡;杜钰;陈宏文2.米曲霉β-呋喃果糖苷酶基因克隆及生物信息学分析 [J], 唐江涛;覃益民;杨梅;姚评佳;魏远安;唐尹萍3.黑曲霉菌PyrG缺陷株的建立 [J], 刘钟滨;DavidJ.Jeenes;等4.米曲霉GX0015蔗糖酶基因克隆及生物信息学分析 [J], 杨梅;唐江涛;唐尹萍;覃益民;姚评佳;魏远安5.黑曲霉pyrG遗传转化系统的构建及应用 [J], 胡江峰;刘舒雯;杨焱;李林霖;李迎凯;张健因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
《甜瓜CmPYL4、CmPYR1基因在果实成熟过程中功能的初步分析》范文
《甜瓜CmPYL4、CmPYR1基因在果实成熟过程中功能的初步分析》篇一摘要：本研究初步分析了甜瓜（Cucumis melo）中的CmPYL4和CmPYR1基因在果实成熟过程中的功能。
通过生物信息学分析、基因表达模式研究以及转基因实验，揭示了这两个基因在甜瓜果实成熟过程中的潜在作用。
本文为进一步了解甜瓜果实成熟机制及遗传改良提供了理论依据。
一、引言甜瓜作为一种重要的经济作物，其果实的成熟过程直接关系到果实的品质和经济效益。
近年来，植物激素信号转导途径在果实成熟过程中的作用受到了广泛关注。
PYL（Pyrabactin-like）和PYR（Pyrabactin resistance）基因作为植物激素信号的关键调控因子，对果实成熟具有重要的影响。
因此，本研究选取甜瓜的CmPYL4和CmPYR1基因，探讨其在果实成熟过程中的功能。
二、材料与方法1. 材料实验材料为不同成熟阶段的甜瓜果实，以及相应的转基因植物材料。
2. 方法（1）生物信息学分析：利用生物信息学软件对CmPYL4和CmPYR1基因进行序列分析、表达模式预测等。
（2）基因表达模式研究：采用实时荧光定量PCR技术，分析不同成熟阶段甜瓜果实中这两个基因的表达情况。
（3）转基因实验：构建转基因植物，研究CmPYL4和CmPYR1基因过表达或敲除对果实成熟的影响。
三、结果与分析1. 生物信息学分析结果CmPYL4和CmPYR1基因具有典型的PYL/PYR基因特征，其序列保守性高，可能与植物激素信号转导密切相关。
表达模式预测显示，这两个基因在果实成熟过程中表达量发生变化。
2. 基因表达模式研究结果实时荧光定量PCR结果显示，CmPYL4和CmPYR1基因在甜瓜果实成熟过程中表达量呈现明显变化，与果实的成熟度呈正相关。
这表明这两个基因可能参与调控甜瓜果实的成熟过程。
3. 转基因实验结果（1）过表达实验：过表达CmPYL4和CmPYR1基因的转基因甜瓜果实表现出提前成熟的趋势，果实的糖分、风味等品质得到改善。
米曲霉碱性蛋白酶基因的克隆表达及水解特性
米曲霉碱性蛋白酶基因的克隆表达及水解特性柯野;陈丹;李家洲;谢明权;罗晓春【摘要】Alkaline proteases from Aspergillus oryzae are of efficient hydrolysis ability and preferable debittering effect to plant protein. In order to obtain a large amount of alkaline proteases for industrial applications, the alkaline protease gene from A. oryzae was cloned by using RT-PCR technique, and was transformed into Pichia pastoris KM71 strain, thus being successfully expressed. Then, the protease was used in the hydrolysis experiments of bovine insulin B-chain, soy protein and peanut protein. The results show that ( 1 ) when the protease is induced to express in a 10-L fermentor, the protease activity of the fermentation broth is up to 4100U/mL; (2) the optimum pH value and temperature of the protease are respectively 8.5 -9.5 and 50X. , and the protease is stable at a pH value of 6.0 to 10.0 below 40℃ ; (3) the protease is of extensive peptide-bond selectivity; and (4) the protease displays higher hydrolysis activity to soy and peanut protein than some commercial proteases. The above-mentioned results indicate that the recombinant protease is of potential application prospects.%米曲霉碱性蛋白酶对植物蛋白具有高效的水解能力和较好的脱苦作用.为了便于大量获得该酶以利于工业上的应用,文中通过RT-PCR克隆获得米曲霉碱性蛋白酶基因,将之转化到毕赤酵母KM71菌株中并成功表达,之后用该酶进行牛胰岛素氧化链B链及大豆和花生蛋白的水解试验.结果显示:在10L发酵罐中诱导表达时,发酵液中重组碱性蛋白酶的酶活达4100U/mL;该蛋白酶最适反应pH值和温度分别为8.5 ～9.5和50℃,在pH值为6.0 ～10.0和温度低于40℃时具有较好的稳定性；该酶具有广泛的肽键选择性；该酶对大豆和花生蛋白显示出了强于部分商品化蛋白酶的水解能力.以上结果表明:该重组蛋白酶具有较大的开发利用潜力.【期刊名称】《华南理工大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(040)008【总页数】7页(P88-94)【关键词】米曲霉;重组碱性蛋白酶;毕赤酵母;克隆;表达;水解特性【作者】柯野;陈丹;李家洲;谢明权;罗晓春【作者单位】华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;广东轻工职业技术学院食品与生物工程系,广东广州510300;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】Q814.9;TS201.2蛋白酶是一类重要的工业用酶，占整个工业用酶量的60%以上;其中，碱性蛋白酶约占蛋白酶总量的一半，广泛应用于食品加工、皮革、医药和化工等行业［1］.目前商业化的碱性蛋白酶主要来源于芽孢杆菌，来源于真菌的极少［2］.米曲霉(Aspergillus oryzae)是一种能产生多种蛋白酶的真菌，据2007年对该菌的全基因组序列报道，通过对该基因组的分析预测，发现该菌共有134个蛋白酶基因，其中69个为外肽酶、65个为内肽酶，但只有少数蛋白酶的功能与性质被解释清楚［3］.该菌广泛应用于豆酱、酱油和酒类酿造等发酵工业.在酿造工业中，米曲霉产生的酸性蛋白酶活力较低(主要以产生碱性蛋白酶和中性蛋白酶为主)，尤其是碱性蛋白酶对底物蛋白的水解程度对水解物产生的独特风味和脱苦味起着关键作用［1，4-5］.目前，国内外学者对米曲霉的研究主要集中于通过优化固体(或者液体)发酵来提高米曲霉蛋白酶的产量或通过分离纯化其产生的部分酶进行性质研究［1，6］.优化发酵条件很难大幅度提高碱性蛋白酶产量，且发酵过程易受多种因素(如易污染或菌株生长状态)影响.另外，米曲霉产生的蛋白酶种类较多，这增加了碱性蛋白酶的纯化难度，阻碍了其进一步的开发利用［7］.有关该酶的酶学性质、异源表达和水解特性等的研究目前鲜见报道.毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是目前表达异源蛋白性能较好的系统之一，其操作工艺简单，表达量高.该系统能对表达的蛋白进行折叠和翻译后修饰，获得具有活性的目的蛋白，此目的蛋白能直接分泌至发酵液中便于分离与纯化.目前已有较多外源基因在该系统中成功表达的报道［8］.文中主要通过克隆获得米曲霉碱性蛋白酶基因，以期能在毕赤酵母表达系统中进行异源表达，提高其产量，并对其酶学性质和水解性质进行初步研究，为该重组碱性蛋白酶在相关产业中的推广应用奠定基础，改变目前商业碱性蛋白酶主要来源于芽孢杆菌的局面，并为开发利用来源于真菌的碱性蛋白酶提供理论参考.1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 菌株与质粒米曲霉沪酿3.042菌株购自上海迪发酿造生物制品有限公司，毕赤酵母KM71菌株和表达载体pPIC9K试剂购自Invitrogen公司.1.1.2 工具酶和试剂各种工具酶购自Takara(大连)公司，PCR扩增引物和Trizol试剂购自Invitrogen(广州)公司，蛋白质分子质量标准物购自Fermentas公司，牛胰岛素氧化B链购自Sigma公司，其他试剂均为进口或国产分析纯.1.2 试验方法1.2.1 米曲霉碱性蛋白酶基因的克隆将米曲霉菌株接种在装有麸皮的固体培养基(96.41% 麸皮、0.23% 麦芽糖、1.56% 蛋白胨、0.74%KH2PO4、0.06%FeSO4·7H2O，培养基起始含水量为每克麸皮含1.00 mL水)中，25.0℃恒温培养48 h.收集菌丝体，用液氮研磨，按Trizol试剂操作手册提取和鉴定RNA，-70℃保存备用.利用Takara(大连)公司反转录试剂盒合成第一链cDNA.据Genbank数据库报道的米曲霉碱性蛋白酶(Alp)基因序列(登录号:XM_001820092)设计引物.P1引物:5'ATGCAGTCCATCAAGCGTACCT3';P2引物:5'TTAAGCGTTACCGTTGTAGGCAAG3'.以 cDNA为模板，采用P1和P2引物进行50 μL体系的PCR反应.反应程序:94℃变性2min;98℃变性10s，55℃退火15 s，72℃延伸2 min;30个循环后72℃延伸5min.纯化回收PCR产物，克隆至载体 pSIMPLE-18EcoR V/BAP上，转化至大肠杆菌GT116中，筛选阳性克隆测序确认.1.2.2 酵母重组表达载体的构建设计碱性蛋白酶基因的P3和P4引物(该引物扩增的PCR产物不包括碱性蛋白酶基因的信号肽编码序列).P3引物:5'CCGGAATTCCCTGTGCAGGAAACCCGC3';P4引物:5'CTAGTTTAGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGCGTTACCGTTG TAGGCAAG3'.P3和P4引物下划线部分的序列上分别带有EcoR I和Not I限制性内切酶位点，斜体加粗序列表示增加6个编码组氨酸标签的序列.以测序确认后的克隆质粒载体作为模板，以P3和P4为引物进行50μL的PCR反应，反应程序同第1.2.1节;纯化回收PCR产物，然后分别对PCR产物与载体pPIC9K进行EcoR I和Not I双酶切，回收，对酶切产物进行连接，转化至大肠杆菌GT116中，筛选阳性克隆，测序鉴定，重组质粒命名为pPIC9K/Alp.1.2.3 重组毕赤酵母的转化与筛选将重组质粒pPIC9K/Alp采用限制性内切酶Sac I线性化，电击转化至毕赤酵母KM71菌株中，然后涂布于MD平板上培养，挑取培养出的酵母菌落，参照《分子克隆实验指南》［9］中酵母DNA的快速分离法提取酵母基因组，以酵母基因组为模板，以P3和P4为引物进行PCR扩增验证.1.2.4 重组酵母在三角瓶和10 L发酵罐中的诱导表达将筛选得到的阳性重组酵母菌株接种于装有25 mL BMGY培养基(pH=6.0)的250 mL三角瓶中，30℃振荡培养直至在600 nm波长下的吸光值D(600)约为5～6;然后离心收集菌体，转接至装有50mL BMMY培养基(pH=6.0)的500mL三角瓶中，每24h添加1%(体积分数)的甲醇进行诱导表达.诱导结束后，离心收集发酵上清液，采用Folin酚法测定发酵上清液中蛋白酶的酶活［10］.酶活定义如下:在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸为1个蛋白酶活力单位.通过SDS-PAGE凝胶电泳以及Invitrogen公司的InVisionTMHis-tag In-gel Stain分析鉴定重组表达蛋白酶.将重组酵母菌株接种于700mL YPD培养基中，30℃振荡培养至D(600)约为8～10，将培养物接种于装有6.3 L BSM发酵培养基的10 L发酵罐中培养.培养过程分为3个阶段:(1)甘油培养阶段，该阶段是为了让接种后的酵母菌利用发酵罐中的培养基迅速生长，提高发酵罐中的菌体浓度，该阶段溶解氧含量控制在40%水平，pH=5.0，30℃，培养至发酵罐中的溶解氧含量陡然上升接近100%;(2)添加甘油阶段，该阶段添加甘油是为菌体补充碳源，使其菌体浓度进一步增加，来达到酵母菌的高密度发酵，该阶段以12 mL/(L·h)的流速添加50%(质量分数)甘油(混有微量元素)到发酵罐中，维持数小时，通过控制搅拌速率、通气量和罐压方式维持发酵罐中的溶解氧含量在20%～35%之间，停止补加甘油后，待发酵罐中的溶解氧含量升至接近100%，继续维持菌体“甘油饥饿”状态1h;(3)甲醇诱导表达阶段，即甲醇流加进行诱导，重组蛋白酶基因位于AOX启动子下游，因此添加甲醇可紧密调节、诱导AOX启动子启动，促进外源的碱性蛋白酶基因的表达，并且由于KM71菌株中含有AOX2基因，因此KM71菌株也利用甲醇作为碳源，利于自身的生长，该阶段诱导条件为pH=6.0，28.3℃，发酵罐中的溶解氧含量维持在25% ～30%之间，甲醇流加速度逐渐提高至终速为5mL/(L·h)，定时测定发酵液的酶活和酵母菌体湿重.1.2.5 重组碱性蛋白酶的纯化将发酵上清液置于截留分子质量为6000～8000u的透析袋中，将透析袋置于饱和的PEG 10000水溶液中，4℃静置至发酵液浓缩至原来体积的30%左右.将浓缩后的发酵液pH值调至7.4～8.0后，首先用Ni柱对重组蛋白酶进行亲和层析，层析过程中利用缓冲液A(20mmol/L磷酸钠、0.5mol/L氯化钠、20～40mmol/L咪唑，pH=7.4)和缓冲液 B(20 mmol/L磷酸钠、0.5 mol/L 氯化钠、0.5 mol/L 咪唑，pH=7.4)对Ni柱进行梯度洗脱，收集洗脱液.接着，用超滤离心管浓缩洗脱液，然后加样于SephadexTMG-75凝胶柱中，采用0.05mol/L磷酸缓冲液洗脱，收集主要蛋白峰的洗脱液，再用超滤离心管浓缩收集，得到纯化的蛋白酶溶液，保存备用.1.2.6 重组碱性蛋白酶的酶谱试验参考Till等［11］的方法进行酶谱试验.在酶谱试验中，采用12.0%(质量分数)的分离胶(分离胶中含有0.3%酪蛋白)和5.0%(质量分数)的浓缩胶.蛋白酶样品与上样缓冲液混合后直接上样，4℃电泳.电泳后用超纯水浸洗凝胶两次，然后置于0.05mol/L甘氨酸-NaOH(pH 值为 10.0)缓冲液中，40℃酶解30min.采用考马斯亮蓝R-250染色的方法对酶解后的凝胶进行染色及脱色.1.2.7 pH值和温度对重组碱性蛋白酶活性及稳定性的影响将纯化的重组碱性蛋白酶置于0.02 mol/L pH缓冲液中(乙酸缓冲盐pH值为3.0～5.0，磷酸缓冲盐 pH 值为6.0 ～7.0，Tris-HCl pH 值为 8.0 ～9.0，硼砂-氢氧化钠pH值为9.0～11.0)，然后分别测定其酶活，以确定最适反应pH值.将酶液置于不同的缓冲液中，25℃静置1 h，然后于pH=10.0条件下测定其酶活，考察不同pH值对酶稳定性的影响.在不同的温度(40～70℃)下进行重组碱性蛋白酶的酶活测定，以此确定其最适反应温度.并在其稳定的pH条件下，将酶液分别置于不同温度中保温10、20、40、60、80 和 120 min，然后测定不同温度处理后余下的酶活，以考察温度对重组碱性蛋白酶稳定性的影响.1.2.8 重组碱性蛋白酶对牛胰岛素氧化B链的水解试验参考Bakhtiar等［12］的方法，取牛胰岛素氧化B链100μg溶解于1mL 0.02 mol/L(pH 值为9.0)乙醇胺-盐酸缓冲液中，加入一定量酶液(约30U)，混合后放置于40℃水浴中酶解1h，沸水浴5min灭酶活.利用质谱鉴定在胰岛素B链上的酶切位点.1.2.9 重组碱性蛋白酶对大豆蛋白和花生蛋白的水解试验大豆蛋白和花生蛋白的水解试验参考潘进权等［13］的方法，分别用 pH 值为8.0 的0.05mol/L 磷酸盐缓冲液配制5%(质量分数)的大豆分离蛋白和花生分离蛋白，然后在沸水浴中热处理15 min.冷却后加入酶，50℃酶解4 h，将酶解液在4000r/min下离心10min，取上清液，采用甲醛滴定法测定其水解度.采用相同的水解试验方法分别测定木瓜蛋白酶和Alcalase碱性蛋白酶对大豆分离蛋白和花生分离蛋白的水解效率.2 结果与分析2.1 碱性蛋白酶基因的克隆和表达载体的构建结果通过提取米曲霉的总RNA，反转录为cDNA，利用P1和P2引物进行PCR扩增出目的条带;将PCR产物与克隆载体相连接，转化至大肠杆菌中，挑取阳性克隆测序.测序结果表明克隆的碱性蛋白酶(Alp)基因序列与Genbank数据库中报道序列(登录号:XM_001820092)完全一致，未见任何突变.以P3和P4为引物扩增的PCR产物经过酶切克隆至表达载体pPIC9K上，再分别以AOX引物(5'AOX:5'GACTGGTTCCAATTGACAAGC3'和3'AOX:5'GGCAAATGGCATTCTGACATCC3')和 P3、P4 引物进行菌落PCR，筛选出阳性克隆，测序结果表明重组质粒pPIC9K/Alp构建成功，其示意图见图1.图1 重组表达质粒pPIC9K/Alp的构建示意图Fig.1 Sketch of construction of recombinant expression plasmid pPIC9K/Alp2.2 重组酵母的筛选和鉴定结果将限制性内切酶Sac I线性化后的重组表达质粒pPIC9K/Alp电转至毕赤酵母KM71中，挑取在MD培养基上生长出的单菌落，利用G418抗生素筛选出高拷贝菌株;然后对其培养，提取基因组，以P3和P4引物进行PCR，扩增出目的条带(见图2).图2表明米曲霉碱性蛋白酶基因已成功整合至酵母基因组中.图2 酵母转化子的PCR鉴定结果Fig.2 PCR identification of yeast transformants M—DNA 标准物，DL1000;1，2—PCR 产物2.3 重组酵母在三角瓶和发酵罐中的诱导表达结果外源基因在毕赤酵母中表达的优点在于重组蛋白表达量大，分泌至胞外直接进入发酵液，便于分离纯化.本试验的重组酵母菌株在三角瓶和发酵罐中诱导表达时，其发酵液在SDS-PAGE凝胶电泳图谱的35ku处均有一明显的蛋白条带(见图3(a)).采用Invitrogen公司的InVisionTMHis-tag In-gel Stain试剂对发酵液的SDS-PAGE凝胶染色曝光，明显可见在考马斯亮蓝染色的35 ku处具有一白斑(见图3(b)).该试剂只能与带有组氨酸标签的蛋白结合，在紫外线的照射下激发产生荧光，形成可见的白斑.在构建重组表达质粒时，在碱性蛋白酶的C端设计增加了6个组氨酸标签，该重组蛋白酶在紫外线照射下可形成白斑.根据核苷酸序列推导的重组碱性蛋白酶的分子质量接近35ku;而对于整合了未带外源基因的空表达载体pPIC9K的KM71菌株而言，其发酵液在SDS-PAGE电泳图谱的35 ku处未见明显的蛋白条带(见图3(a)).此结果表明重组碱性蛋白酶在KM71中表达成功，电泳图谱上的35ku处的蛋白条带是重组碱性蛋白酶条带.图3 重组碱性蛋白酶的电泳图谱Fig.3 Electrophoretic patterns of recombinant alkaline proteaseM—蛋白质分子质量标准物;1—重组pPIC9K的酵母发酵液;2—重组pPIC9K/Alp的酵母发酵液;3—凝胶层析洗脱液;4—Ni柱亲和层析洗脱液图4 重组酵母菌产酶及生长曲线图Fig.4 Curves of protease activities and growth versus time for recombinant P.pastoris strain重组酵母菌产酶及生长曲线如图4所示.由图4可知，在三角瓶中诱导表达时，诱导至96h后酵母菌湿重达到最高(约45g/L)，然后基本保持稳定;诱导至120h时，发酵液的酶活最高(700U/mL).在发酵罐中诱导表达时，酵母菌菌体湿重可达约250g/L，显著高于三角瓶中的湿重，诱导至108 h时，发酵液酶活达到4100U/mL，显著高于三角瓶中发酵液的酶活.酵母菌是好氧微生物，特别是在高密度发酵生长时耗氧量更大;由于发酵罐具备供氧和搅拌装置，这为酵母菌的高密度生长提供了条件，因此发酵罐中的菌体浓度高于三角瓶.重组碱性蛋白酶是重组酵母菌自身分泌的胞外蛋白，酵母菌菌体越多，分泌的蛋白酶量越大，因此发酵罐中发酵液的酶活高于三角瓶中发酵液的酶活.工业上通常以麦麸或稻麸等作为培养基原料，采用固体发酵米曲霉生产碱性蛋白酶.固体发酵产酶量一般最高能达到1200U/g ［6］，而且发酵场所大，存在易污染、菌体生长难控制、产生酶种类多且不便于分离纯化等不足［7］，因此，采用基因工程手段，构建重组菌株进行液体发酵来生产重组米曲霉碱性蛋白酶是一种较佳的途径.2.4 重组碱性蛋白酶的纯化及酶谱试验结果重组碱性蛋白酶仅需要几种纯化方式相结合就能从发酵液中得到纯化.首先，将发酵上清液置于饱和的PEG 10000水溶液中透析，这主要是对重组碱性蛋白酶进行浓缩以及降低发酵液的黏度，从而为层析做准备.接着，通过Ni柱层析将重组蛋白酶吸附于Ni柱上，而其他大部分杂蛋白通过穿过液被分离掉;然后，对Ni柱进行梯度洗脱，洗脱液中缓冲液B含量为30%时，重组碱性蛋白酶含量最高;最后，利用SephadexTMG-75凝胶层析柱的分子筛排阻效应，对不同分子质量的蛋白进行分离，得到纯化的重组碱性蛋白酶.采用SDS-PAGE电泳图谱对分离纯化的样品纯度进行比较分析(见图3(c))，发现经凝胶层析后，纯化的蛋白酶在SDS-PAGE 电泳图谱中仅具有单一条带，表明该酶已经纯化至电泳纯.将纯化后的重组碱性蛋白酶进行酶谱试验，电泳图谱上清晰地显示一条透明的水解条带(见图3(d))，这进一步表明分离纯化得到的蛋白是重组碱性蛋白酶.该条带比SDS-PAGE电泳中的条带靠后，主要是由于上样缓冲液和凝胶中均未加SDS以及未对重组碱性蛋白酶进行煮沸的变性处理过程，这使得该酶的表面带电荷较少以及空间结构未发生较大改变，因此其电泳速率较慢，水解条带靠后.2.5 不同pH值和温度下重组碱性蛋白酶的活性和稳定性图5给出了pH值对重组碱性蛋白酶活性及稳定性的影响.由图5结果可知:重组碱性蛋白酶的最适反应pH值为8.5～9.5;重组碱性蛋白酶经pH值为6.0～10.0的缓冲液处理后，pH值对其酶活影响不显著，这表明该酶具有较好的pH稳定性;当pH值高于10.0或者低于5.0后，酶稳定性明显下降.图5 pH值对重组碱性蛋白酶活性及稳定性的影响Fig.5 Effects of pH value on activity and stability of recombinant alkaline protease图6所示为温度对重组碱性蛋白酶活性和稳定性的影响.由图6(a)可知，重组碱性蛋白酶的最适反应温度为50℃.由图6(b)可见，该酶在低于40℃的条件下具有良好的稳定性，当超过45℃时，该酶会缓慢失活，一旦温度超过55℃则极不稳定，放置20min后活性几乎完全丧失.图6 温度对重组碱性蛋白酶活性和稳定性的影响Fig.6 Effects of temperature on activity and stability of recombinant alkaline protease2.6 重组碱性蛋白酶对牛胰岛素氧化B链的水解作用图7给出了重组碱性蛋白酶Alp在胰岛素B链上的切割位点.由图7可知，重组碱性蛋白酶对牛胰岛素氧化B链有8个酶切位点，且均比商业化的3种同家族酶(Subtilisin Novo［12］，Subtilisin BPN'［12］和枯草杆菌蛋白酶［14］)的酶切位点多.对酶切位点而言，除了在之间有共同的酶切位点，其余酶切位点均不相同.根据Tanford报道的氨基酸残基的疏水度值计算，发现不同酶切位点末端氨基酸残基的疏水度小于3种商品化酶的疏水度［15］，而疏水度越大的氨基酸出现于肽端时，对该多肽的苦味贡献越大［16］.这表明了重组碱性蛋白酶广泛的肽键选择和脱苦作用.图7 重组碱性蛋白酶Alp在胰岛素B链上的切割位点Fig.7 Cleavage points of recombinant alkaline protease on oxidized insulin B-chain2.7 重组碱性蛋白酶对大豆蛋白和花生蛋白的水解试验结果不同蛋白酶对大豆蛋白和花生蛋白的水解结果如表1所示.由表1可知，重组碱性蛋白酶对大豆蛋白和花生蛋白的水解程度均高于木瓜蛋白酶，而对花生蛋白的水解程度均高于两种商业用酶，这表明重组碱性蛋白酶在实际工业生产中具有较大的开发利用价值.表1 不同蛋白酶对大豆蛋白和花生蛋白的水解结果Table 1 Hydrolysis results of different proteases to soy protein and peanut protein?3 结语文中探讨了米曲霉碱性蛋白酶基因的克隆，并将其在毕赤酵母KM71中成功诱导表达，对表达的蛋白分离纯化，并对其酶学性质以及其对大豆和花生蛋白水解特性进行了初步研究.以往文献发现，对于霉菌产生蛋白酶而言，固体发酵产生的酶量高于液体发酵;对于米曲霉而言，固体发酵产酶量一般最高能达到1200U/g，在本试验中，重组碱性蛋白酶在10L发酵罐中的发酵液酶活达到4100 U/mL，这表明该重组碱性蛋白酶的表达量高于米曲霉中的表达量;并且该重组蛋白酶直接分泌至发酵液中，利于该酶的分离和纯化.该酶具有较宽泛的pH稳定性和较高的热稳定性，对大豆蛋白和花生蛋白的水解能力比商业化木瓜蛋白酶强，对花生蛋白的水解能力比Alcalase碱性蛋白酶强.以上结果显示该重组碱性蛋白酶在工业生产中具有较大的开发潜力.参考文献:［1］Sumantha Alagarsamy，Larroche Christian，PandeyAshok.Microbiology and industrial biotechnology of food-grade proteases:a perspective［J］.Food Technology and Biotechnology，2006，44(2):211-220.［2］Tunga Rashbehari，Shrivastava Binita，Banerjee Rintu.Purification and characterization of a protease from solid state cultures of Aspergillus parasiticus［J］.Process Biochemistry，2003，38(11):1553-1558.［3］Yoon 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代谢工程改造米曲霉生产L-苹果酸
代谢工程改造米曲霉生产L-苹果酸L-苹果酸作为重要的平台化合物已经被广泛的应用于食品、医药和化妆品等领域。
近年来,生物法生产L-苹果酸已经成为了最具前景和高效性的苹果酸生产方法,包括酶转化法和微生物发酵法等。
相较与酶转化法,微生物发酵法具有底物选择性更多、生产成本更低、产酸效率更高等优势。
目前,发酵法生产L-苹果酸已经取得了显著的进展,但仍然存在食品安全性菌株选择性少、得率或生产强度较低、廉价原料利用不充分、杂酸水平较高等问题亟待解决。
本研究以丝状真菌米曲霉作为生产菌株,利用代谢工程手段分别调控了L-苹果酸的胞质合成和转运途径、玉米淀粉的底物利用途径、L-苹果酸的线粒体合成途径、杂酸的合成和转运途径等,实现了苹果酸的高效合成。
主要研究结果如下:(1)以米曲霉NRRL 3488作为出发菌株,以葡萄糖为发酵底物,通过强化L-苹果酸的胞质合成途径,提高了L-苹果酸的生产强度。
通过过表达丙酮酸羧化酶PYC和苹果酸脱氢酶MDH的编码基因,L-苹果酸的摇瓶产量由26.1 g/L提高至42.3 g/L。
为了平衡rTCA途径,引入细菌中草酰乙酸回补途径,通过共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶,L-苹果酸的产量提高至58.5 g/L,生产强度为0.65 g/L/h。
(2)通过过表达米曲霉自身的四碳二羧酸转运蛋白C4T318和粟酒裂殖酵母的苹果酸转运子SpMAEI,增强L-苹果酸向胞外的转运,L-苹果酸的产量显著提升至89.5 g/L。
将C4T318分别定位至线粒体内膜和线粒体基质中,细胞干重(DCW)、菌球直径和L-苹果酸的产量均明显下降。
经基因转录水平分析,6-磷酸果糖激酶的编码基因pfk受到了高浓度代谢产物的反馈阻遏。
使用组成型强启动子过表达pfk基因,L-苹果酸的摇瓶产量提高至93.2 g/L,生产强度为1.17 g/L/h。
(3)通过碳氮源优化,米曲霉MT2-P可直接发酵100 g/L玉米淀粉生产56.6 g/L L-苹果酸。
米曲霉木聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达
米曲霉β-呋喃果糖苷酶基因克隆及生物信息学分析
米曲霉β-呋喃果糖苷酶基因克隆及生物信息学分析唐江涛;覃益民;杨梅;姚评佳;魏远安;唐尹萍【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2008(029)006【摘要】β-呋喃果糖苷酶水解蔗糖和低聚果糖,酶法生产高纯度低聚果糖,必须抑制或消除β-呋喃果糖苷酶的水解活性.本研究以工业生产低聚果糖的米曲霉菌株GX0015为研究材料,采用RT-PCR技术,克隆获得β-呋喃果糖苷酶基因(GenBank 登录号:EU130944).利用生物信息学手段对β-呋喃果糖苷酶基因进行分析得知:该酶为456个氨基酸组成的亲水性膜外蛋白;功能域分析结果显示:该酶从第52个至第456个氨基酸残基之间序列属于糖苷酶32家族特征序列,并具有糖苷酶32家族酶活性中心的(N/G)DP(C/N)G和RDP保守序列;米曲霉β-呋喃果糖苷酶在进化树上的位置处于酵母菌的转化酶和细菌的六磷酸蔗糖水解酶之间.【总页数】4页(P208-211)【作者】唐江涛;覃益民;杨梅;姚评佳;魏远安;唐尹萍【作者单位】广西大学化学化工学院,广西,南宁,530004;广西大学化学化工学院,广西,南宁,530004;广西大学化学化工学院,广西,南宁,530004;广西大学牛命科学与技术学院,广西,南宁,530004;广西大学亚热带生物资源保护利用重点实验室,广西,南宁,530004;湖北中医学院药学院,湖北,武汉,430065【正文语种】中文【中图分类】Q785;Q811.4【相关文献】1.米曲霉6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(gnd)的克隆及生物信息学分析 [J], 吴晶晶;洪志宏;张卡;陈宏文2.节杆菌10137β-呋喃果糖苷酶基因克隆及在大肠杆菌表达 [J], 彭端;蓝东明;王永华3.日本曲霉β-呋喃果糖苷酶基因克隆及在酿酒酵母中的表达 [J], 王立梅;齐斌;周惠明4.不同米曲霉降解草甘膦能力及其甘氨酸氧化酶的生物信息学分析 [J], 李浩;高斌;袁小强;胡明;刘成梅;万茵;付桂明5.米曲霉GX0015蔗糖酶基因克隆及生物信息学分析 [J], 杨梅;唐江涛;唐尹萍;覃益民;姚评佳;魏远安因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
《甜瓜CmPYL4、CmPYR1基因在果实成熟过程中功能的初步分析》范文
《甜瓜CmPYL4、CmPYR1基因在果实成熟过程中功能的初步分析》篇一一、引言随着现代农业技术的快速发展，植物分子生物学逐渐成为农业科学研究的热点领域。
基因在果实成熟过程中的功能分析是这一领域的重要组成部分。
本篇论文以甜瓜为研究对象，主要针对CmPYL4和CmPYR1基因在甜瓜果实成熟过程中的功能进行初步分析。
通过对这些基因的表达模式和功能的研究，有助于我们更深入地理解果实成熟过程中的分子机制。
二、材料与方法2.1 材料本实验选取的甜瓜品种为优质高产的品种，其果实成熟过程中具有明显的生理生化变化。
实验所用的基因序列为CmPYL4和CmPYR1，通过生物信息学方法进行预测和分析。
2.2 方法（1）样品采集：在甜瓜果实成熟的不同阶段，采集果实的样本。
（2）RNA提取及cDNA合成：使用相关试剂盒提取样本中的RNA，然后通过反转录酶合成cDNA。
（3）基因表达分析：利用实时荧光定量PCR技术，对CmPYL4和CmPYR1基因在不同成熟阶段的表达量进行检测。
（4）生物信息学分析：利用生物信息学软件，对CmPYL4和CmPYR1基因的序列进行分析，预测其功能和结构。
三、结果与分析3.1 基因表达模式分析通过实时荧光定量PCR技术，我们检测了CmPYL4和CmPYR1基因在甜瓜果实成熟过程中的表达模式。
结果表明，这两个基因的表达量随着果实的成熟呈现出不同的变化趋势。
CmPYL4基因在果实成熟早期表达量较高，而CmPYR1基因则在果实成熟后期表达量升高。
这表明这两个基因在果实成熟过程中可能具有不同的功能。
3.2 生物信息学分析通过生物信息学软件对CmPYL4和CmPYR1基因的序列进行分析，我们发现这两个基因均具有典型的植物激素响应元件，可能参与植物激素的信号转导过程。
此外，这两个基因还具有一些保守的结构域，这些结构域可能与它们的功能密切相关。
3.3 功能初步分析根据基因表达模式和生物信息学分析结果，我们初步推测CmPYL4和CmPYR1基因在甜瓜果实成熟过程中可能具有以下功能：（1）CmPYL4基因可能参与果实成熟的早期阶段，调控果实的生长和发育。
米曲霉中果胶甲酯酶基因在番茄植株中表达的具体实验操作步骤
米曲霉中果胶甲酯酶基因在番茄植株中表达的具体实
验操作步骤
1.采用RT-PCR法:将樱桃蕃茄果胶酯酶的mRNA反转录成为cDNA 第一链并设计特异性引物进行PCR扩增，获得櫻桃蕃茄果胶酯酶基因片断。
2.构建测序载体PT-PEM,提取质粒经过酶切及PCR分析和序列测定，证明樱桃蕃茄果胶酯酶基因提取成功。
3.构建.pPICZaA-PME重组质粒，转化毕赤酵母GS-115，在含有ZeocinTM的选择性YEPD平板中筛选到重组酵母,并提取重组酵母的DNA进行PCR反应，.确定重组酵母基因中含有果胶酯酶基因片断。
5.对毕赤酵母中外源基因进行甲醇诱导表达，对发酵上清液的果胶酯酶活性进行测定。
在樱桃蕃茄果胶酯酶基因克隆和在毕赤酵母中表达的试验中，我们得到了一条长为1942bp的果胶酯酶基因，酶切、电泳、测序，将所得基因序列提交美国国家生物技术信息中心(National Center for BitechnologyInformation,NCBI)中的Nr(核酸数据库)做BLAST同源性检索与参照序列BT013364.1和X74638.1序列一致，将此基因片段与质粒pPICZaA链接构建了重组质粒pPICZaA-PME,并转化毕赤酵母中得到重组酵母，对重组毕赤酵母进行甲醛诱导表达，对发酵上清液进行果胶酯酶活性测定，发现我们表达出来的蕃茄果胶酯酶并不具有果胶酯酶的活性。
米曲霉Asp.m21产果胶酶酶学性质及初步应用.
米曲霉Asp.m21产果胶酶酶学性质及初步应用果胶(pectin)物质是存在于高等植物初生壁和细胞间隙中的一组多糖,是非淀粉多糖(NSP)中化学组成和分子结构变化最大的一类结构性多糖,主要由α-D-半乳糖醛酸经α-1,4-糖苷键连接成的直链状聚合物。
果胶酶是一类分解果胶质的酶的总称,是含有多种组分的复合酶。
聚半乳糖醛酸酶(简称PG)是复合酶系中一个具有代表性的酶种,其作用于果胶质中的D-半乳糖醛酸残基之间的α-1,4-糖苷键,使高分子聚半乳糖醛酸降解为小分子物质,导致粘度降低,它在食品、纺织等方面有重要的应用价值。
目前果胶酶已被广泛应用于食品工业,酿酒行业,是澄清果汁、果酒、饮料十分有效的澄清剂,在饲料行业也正成为重要的添加剂。
本论文进行了以下三个方面的研究工作:1.果胶酶产生菌的分离纯化及液体发酵培养基的优化实验;2.对PG的酶学性质及其动力学的研究;3.对具有应用价值的果胶酶进行橙汁和芒果的澄清应用实验研究。
本论文主要研究结果和结论如下:1.酸性果胶酶产生菌的分离纯化本研究对退化菌株米曲霉进行分离、纯化、复壮,经筛选分离培养基的初步筛选得到21株透明圈较大的菌株,其中菌株Asp.m21经液体摇瓶发酵培养复筛,在pH3.60、50.0℃条件下测定果胶酶酶活,酶活最高,达2.80IU/ml,综合以上结果,选定菌株Asp.m21作为研究对象,做进一步的研究和探讨。
2.酸性果胶酶产生菌Asp.m21液体发酵条件的研究菌株Asp.m21是本实验室保藏的一株产PG的米曲霉菌株,通过单因素发酵条件的实验和正交实验的方法获得了实验室条件下的最佳发酵条件:麸皮2g、柚皮1g,硫酸铵1g,磷酸氢二钠1g,KC1 0.05克,MgSO_4 0.05克,FeSO_4 0.01克,水100ml,pH为4.50。
使用优化后的发酵条件,菌株所产的PG酶活由优化前的2.80IU/ml提高到3.57IU/ml。
3.菌株Asp.m21产PG粗酶性质及其酶动力学的研究本章以产PG菌株Asp.m21为研究对象,对该菌株产生的PG粗酶进行酶学性质的研究,结论如下:此酶属于酸性果胶酶,该酶在pH 3.20～4.00范围内有稳定较高酶活,其中最适pH值为3.60左右。
米曲霉菌AFLR基因启动子序列的克隆
米曲霉菌AFLR基因启动子序列的克隆刘钟滨;谢艳辉;刘洋【期刊名称】《同济大学学报（医学版）》【年(卷),期】2000(021)009【摘要】目的从米曲霉菌中克隆AFLR基因启动子序列,为进一步开展有关研究以深入阐明曲霉菌产生黄曲霉毒素的机制打下基础.方法应用分子生物学手段从基因文库中克隆目的基因,对克隆基因进行了限制性酶谱分析,再对启动子序列进行亚克隆并进行了序列测定.结果从米曲霉茵ATCC14895基因文库中克隆获得含AFLR 基因的8.3kbDNA片段.对该基因片段进行了限制性酶谱分析并绘制了限制性酶切图谱.根据酶谱分析结果,将其中420bp片段亚克隆至pBSⅡ质粒中,获得重组质粒pAP1.1.结论序列分析结果表明我们成功地从米曲霉菌中克隆了AFLR基因启动子序列.【总页数】3页(P4-5,21)【作者】刘钟滨;谢艳辉;刘洋【作者单位】上海铁道大学医学院微生物与免疫学教研室,上海,200331;上海铁道大学医学院微生物与免疫学教研室,上海,200331;上海铁道大学医学院微生物与免疫学教研室,上海,200331【正文语种】中文【中图分类】R379.6【相关文献】1.绵羊Oct4基因启动子序列的克隆及其与猪和牛序列的比较分析 [J], 李昊;郭虎;王春生;宋红卫;朴善花;安铁洙2.米曲霉磷酸果糖激酶基因克隆及序列分析 [J], 张卡;杜钰;陈宏文3.西农萨能羊脂肪酸合酶(FASN)基因启动子序列的克隆与序列分析 [J], 王海滨;韩雪峰;祁昱;罗军4.黄曲霉菌aflR基因启动子序列变异与黄曲霉毒素产生相关联 [J], 陈茹;刘钟滨5.大肠癌组织CEA基因启动子序列克隆及与正常组织相应序列的比较 [J], 曹广文;杜平;崔龙;高军;潘欣;戚中田因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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米 曲霉 磷 酸 果糖 激 酶 基 因克 隆及 序 列 分析
张 卡 ，杜 钰 ，陈 宏 文
厦 门 ３ ６ １ ０ ２ １ ）
（ 华 侨 大 学 化 工 学 院 生 物 工 程 与 技 术 系 ，福 建 摘
Ｚ Ｈ ＡＮＧ Ｋａ 。ＤＵ Ｙｕ 。ＣＨＥＮ Ｈｏ ｎ ｇ — ｗｅ ｎ
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要 ：磷 酸 果 糖 激 酶 （ Ｐ Ｆ Ｋ）是 糖 酵 解 途 径 的重 要 调 控 酶 。 以酿 酒 米 曲 霉 Ｃ Ｉ Ｃ Ｃ ２ ０ １ ２为 材 料 ， 克 隆 获 得 Ｐ Ｆ Ｋ
基因ｐ ｆ ｋ Ａ （ Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ登 录 号 ：Ｋ Ｃｌ １ ３ ５ ０ ３ ． １ ） 。序 列 分 析 表 明 ：ｐ ｆ ｋ Ａ 序列 长 度 为 ２ ７ ２ ２ ｂ ｐ ，含 有 ２ 个 内含 子 ，开
Ｘｉ ａ ｍｅ ｎ， Ｆｕ ｊ ｉ ａ ｎ ３ ６ １ ０ ２ １ ，Ｃｈ ｉ ｎ ａ ）
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｐ ｈ ｏ ｓ ｐ ｈ ｏ ｆ ｒ ｕ ｃ ｔ ｏ ｋ ｉ ｎ ａ ｓ ｅ（ ＰＦ Ｋ） ｉ ｓ ｏ ｎ ｅ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｉ ｍｐ ｏ ｒ ｔ ａ ｎ ｔ ｒ ｅ ｇ ｕ ｌ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅ ｓ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ Ｅ ｍｂ ｄ ｅ ｎ Ｍｅ ｙ ｅ ｒ ｈ ｏ ｆ Ｐ ａ ｒ ｎ ａ ｓ
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放 阅读 框 长 ２ ３ ５ ８ ｂ ｐ ；Ｐ Ｆ Ｋ为 ７ ８ ５ 个 氨基 酸组 成 的 亲 水 蛋 白 ，分 子 量 ８ ６ ． ０ ｋ Ｄａ ，等 电 点 ６ ． ３ ８ ，含 有 ２ 个Ｐ Ｆ Ｋ 家 族 指 纹 结 构 ；二 级 结 构 包 含 ４ ２ ． ６ ８ 的ａ 一 螺 旋 ，１ ４ ． ２ ７ 的 折 叠 和 ４ ３ ． Ｏ ６ 的 无 规 则 卷 曲 ； 同 源 建 模 三 级 结 构 Ｐ Ｆ Ｋ 含 有 Ｎ 端 和 Ｃ端 的 ２ 个 结 构 域 ，底 物 果糖 一 ６ 一 磷 酸 结 合 于 Ｎ 端 结 构 域 。采 用 进 化 树 分 析 ，发 现 米 曲霉 Ｐ Ｆ Ｋ
福 建农 业学报 ２ ８ （ ６ ） ： ５ ８ ４ ￣５ ８ ８ ， ２ ０ １ ３
Ｆ ｕ ｊ ｉ ａ ｎ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ
文 章 编 号 ：１ Ｏ ０ ８ —０ ３ ８ ４（ ２ ０ １ ３ ）Ｏ ６ —５ ８ ４ 一Ｏ ５
张 卡 ，杜钰 ，陈宏 文 ． 米 曲霉 磷 酸 果 糖 激 酶 基 因 克 隆 及 序列 分 析 口］ ． 福 建农 业 学 报 ，２ ０ １ ３ ，２ ８（ ６ ） ：５ ８ ４ —５ ８ ８ ． Ｚ ＨＡＮＧ Ｋ，ＤＵ Ｙ，ＣＨＥＮ Ｈ— Ｗ ，ｅ ｔ ａ １ ． Ｃｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ ａ ｎ ｄ Ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｇ Ｐ ｈ ０ ｓ ｐ ｈ ｏ ｆ ｒ ｕ ｃ ｔ ｏ ｋ ｉ ｎ ａ ｓ ｅ Ｇｅ ｎ ｅ ｆ ｒ ｏ ｍ Ａｓ ｐ ｅ ｒ ｇ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｏ ｒ ｙ ｚ ａ ｅ［ Ｊ ］ ． Ｆ ｕ ｊ ｉ ａ ｎ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ
与丝 状 真 菌 Ｐ Ｆ Ｋ 亲缘 性较 近 。
关 键 词 ：磷 酸 果 糖 激 酶 ；米 曲霉 ；克 隆 ；序 列 分 析
中 图分 类 号 ：Ｑ ７ ８ ５ 文 献 标 识 码 ：Ａ
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