美国TA仪器——等温滴定量热技术在生物领域之应用
等温滴定量热仪(ITC)在分子相互作用中的应用
非特异性结合
ITC 技术的应用领域
分子相互作用：
溶液中的几乎所有天然状态分子： 包括蛋白质、核酸、多肽、药物分子、 脂类、金属离子、小分子等等；
工艺过程的开发和控制
酶动力学 药物研发 非生物系统
抗生素抗性的菌种为什么能更好的 消灭抗生素
Tobromycin binding to aminoglycoside nucleotidyltransferase(2”)
量热池
样品池
对照池
∆T1：样品池温度反馈
神奇的微量热控制—功率补偿
SR
The DP is a measured power differential between the reference and sample cells to maintain a zero temperature between the cells
酶反应动力学的研究 (不一般的ITC曲线）
Kcat：催化速率常数 KM：米氏常数
酶反应动力学应用
测量PP1-γ磷酸酶水解PNPP
ITC测量PP1-γ磷酸酶水解 PNPP速度的原始数据
PP1-γ磷酸酶水解PNPP的MichaelisMenten曲线
ITC Applications Enzyme Kinetics
研究所
中科院生化细胞所 中科院生物物理所 北京生命科学研究所 诺华制药研发中心……
Thanks!
陈雍硕
E-mail: Yongshuo.chen@ Mobile: 13918729620
令人郁闷的公式说明了什么？
1. 相同的KD有着相同的∆G； 2. 相同的∆G却有着不同的∆H与∆S组合。
TAMAIR等温量热仪-TAInstruments
tam air
水泥和混凝土的水化 研究水泥和混凝土水化过程的强大工具
测定水泥和混凝土的水化热是非常重要的。传统方法一般是藉由测量溶解热来测定水化热(ASTM C186)。但是近年来，采用TAM Air进行等温量热测试日益受到亲睐，因为这种 方法不仅能够准确可靠地测量水化热(ASTM C1702)，同时还能预测多种水泥混合料的固化行为。TAM Air测试的样品通常为浆状样品，它可连续跟踪水泥在一段时间内的水化过 程；除水泥测试外，砂浆或混凝土最终混合料的测试也同样非常重要，因为测试最终混合料有助于检测材料间的相容性。即使是相同的水泥，在水泥浆和混凝土混合料中的混合效 果也不尽相同，因为聚集物会导致剪切力增大。
< 80 µW* <± 20 µW <± 45 µW
* 基线漂移指标基于24小时的室温循环，且可持续数日甚至数周有效
八通道 标准体积 量热计
8 5 ºC to 90 ºC
空气 ± 0.02 ºC
20 mL
4 µW <± 2.5 µW ± 20 µW
< 40 µW* <± 10 µW &g)
5 41
3 3
2
1
2 0
0
10
水泥和混凝土标准化测试的首选仪器
4
20
30
40
50
60
time (h)
第一阶段： 快速初始过程 — 离子溶解和初始水化 第二阶段： 诱导期 — 产热低，硅酸盐溶解慢 第三阶段： 加速期 — 硅酸盐水化 第四阶段： 减速反应期 — 硫酸盐耗尽，硅酸盐水化过程减速
2
可靠、耐用、通用性强
八通道标准体积TAM Air非常适合用于测量均质浆状样品，而三通道大体积量热计还可用于测量异质性较高的混凝土样品。热流曲线的形状将反映水泥的水化过程，从中可以确定 复杂水化过程的不同阶段。
等温滴定量热仪(ITC)在分子相互作用中的应用
HO
O
O
O
O
N H
N
NH
OH
S
Kd = 0.5 nM ∆H = -5.5 kcal/mol
∆∆H = -4.3 kcal/mol -T∆∆S = 2.2 kcal/mol
Freire, Drug Disc. Today, 13 869 (2008)
酶反应动力学的研究
令人郁闷的公式说明了什么？
1. 相同的KD有着相同的∆G； 2. 相同的∆G却有着不同的∆H与∆S组合。
引发焓变和熵变的主要因素
Enthalpy (-∆H) 焓变
Hydrogen bonds 氢键
Ionic interactions 离子作用
特异性结合
Entropy (+∆S) 熵变
Hydrophobic interactions 疏水作用
抗疟疾新药就这样放弃吗？
Optimize Enthalpy, Minimize Entropy Compensation
O
O
O
O
N H
N
N
H
OH
S
Kd = 16 nM ∆H = -1.2 kcal/mol
HO
O
O
O
O
N H
N
NH
OH
S
Kd = 76 nM ∆H = -6.0 kcal/mol
PlmII Inhibitor Optimization ∆∆H = -4.8 kcal/mol
Conformational freedom 构象自由度
非特异性结合
ITC 技术的应用领域
分子相互作用：
等温滴定微量热仪(ITC)简介
等温滴定微量热仪(ITC)简介等温滴定量热法在生命科学研究中应用申明：本资料来源于网络，版权归原作者所有！等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。
微量热法具有许多独特之处。
它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 0C - 80 0C，滴定池体积1.43 ml)。
实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin 软件分析ITC得到的数据)。
测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
ITC的用途获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、摩尔结合熵、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)。
ITC的应用范围蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用；……加样体积：（实际体积）cell：1.43 ml，syringe：300 μl准备样品体积（最少量）cell：2 ml，syringe：500 μl样品浓度cell：几十μM到几mMsyringe：几百μM到几十mM测量Kb范围102-1012 M-1滴定实验前恒温30-60 min等温滴定量热实验所需时间，一般1.5-4 hrSample Preparation Guidelines (ITC).Proper sample preparation is essential for successful ITC testing. In particular, the minimal guidelines below must be strictly followed to insure an accurate estimate of stoichiometry (n), heat of binding (H), and binding constant (Kb) (or dissociation constant Kd = 1/Kb).1.) The macromolecule solution (the sample to be placed in the reaction cell) must have a volume of at least2.1 ml. The lowest concentration which can be studied is 3 M and this is adequate only for tight binding where Kd is smaller than 1 M. For weaker interactions, the macromolecule concentration should be 5 times Kd, or higher if possible. Preferably, the macromolecule solution should be dialyzed exhaustively against buffer for final equilibration.2.) The ligand solution (the sample to be placed in the injection syringe) must have a volume of at least 0.7 ml. Its concentration should be at least 10 times higher than the concentration of macromolecule (if the macromolecule has multiple binding sites for ligand, then the ligand concentration must be increased accordingly). The buffer solution in which the ligand is dissolved should be exactly the same buffer against which the macromolecule has been equilibrated.3.) After both solutions have been prepared, the pH of each should be checked carefully. If they are different by more that 0.05 pH units, then one of the solutions must be back-titrated so they are within the limit of 0.05 pH units. If any particles are visible in either solution, they should be filtered out.4.) If possible, the concentrations of both solutions should be accurately determined after final preparation. Accurate determination of binding parameters is only possible if concentrations of binding components are known precisely.5.) At least 20 ml of buffer must be sent along with the two samples, since this is used for rinsing the cell and for dilution if necessary.6.) If possible, DTT should be avoided as a disulfide reagent and replaced by -mercaptoethanol or TCEP.等温滴定微量热仪（ITC）基本介绍等温滴定微量热仪（ITC）基本介绍（美国MicroCal ，美国微量热公司）仪器设备名称：等温滴定微量热仪制造国别：美国制造厂商：美国微量热公司规格型号：VP-ITC品牌：MicroCal总代理商：华嘉（香港）有限公司技术指标：短期噪音水平：0.5纳卡/秒(2 纳瓦)。
等温滴定微量热仪Nano ITC注意事项
TA仪器等温滴定微量热仪Nano ITC是专为来源有限的、纯的、释释的生物样品的结合与动力学研究设计的。
使用Nano ITC，可以在1纳摩尔或更少量的生物聚合物中检测到低至120纳焦耳的热量。
Nano ITC采用一个固态的热电加热和冷却系统来精确地控制温度，并用独特的抽取式注射器来有效精确的进行滴定。
Nano ITC内置且准确的等温功率补偿设计，能在最快的响应时间（12秒）内进行及时的补偿。
Nano ITC等温滴定微量热仪的高灵敏度测量池是采用99.999%的黄金或哈司特镍碳合金制成，以适应绝大多数化学试剂。
圆锤形的设计不仅使清洗变得容易，而且也使溶液的搅拌更为有效。
Nano ITC等温滴定微量热仪的绝热板封装在密闭真空室中，使得仪器不易受环境变化的影响，温度稳定性可达±0.005℃。
独特的、可移动的抽取式注射器其末端包含一个桨状机械搅拌器，搅拌速度极容易调节，以适应样品的物理性质。
纳瓦ITC的这种整体组装的搅拌装置能够保证样品快速充满、样品清理及精确的滴定。
等温滴定微量热仪性能参数：
最低可检测热量0.1微焦耳
最高可检测热量10,000微焦耳
低噪音水平0.004微瓦
基线稳定性0.04微瓦/小时
温度稳定性25℃时0.005℃
工作温度2～80℃
测量池类型固定圆锥形
样品体积 1.0毫升
响应时间12秒。
等温滴定量热仪和差示扫描量热仪在生物制剂研发中的应用
等温滴定量热仪和差示扫描量热仪在生物制剂研发中的应用液剂中蛋白药物的稳定的一个重要因素是适当的辅料的选择，适宜的辅料浓度能够在延长药物保质期的同时确保患者的最高的用药安全。
尽管过去十年间的文献报道了维持稳定性的一般准则，但是在存储期间辅料如何提升蛋白药物的稳定性，其机制尚未完全明晰。
为能合理优化蛋白制剂，掌握有关蛋白-辅料相互作用机理的知识十分重要。
通过微量热技术来研究来探索蛋白-辅料的相互作用，因而被越来越多的应用于生物制剂的研发和优化。
通过使用等温滴定量热仪（ITC）和差示扫描量热仪（DSC）等技术，评估与相互作用有关的热力学参数，例如辅料-蛋白的结合，辅料参与下蛋白质伸展等，揭示研发最优制剂所需的重要机理信息。
这里我们列举两个ITC和DSC是怎样辅助蛋白制剂研发的例子。
在第一个例子中，使用ITC揭示了聚山梨酯80（常用表面活性剂，通过降低蛋白表面吸附和聚集以稳定蛋白性质）与蛋白X（ProX）之间的相互作用。
使用单位点模型拟合ITC数据计算得出结合亲和常数（K A）=1430±260 M-1，结合焓（△H）=-6.3±1.1 kcal/mol，每个ProX 分子结合位点数（n）=2.6±0.3。
另外一个例子中，使用DSC和ITC产生的数据集显示在抗菌防腐剂，苯酚存在的条件下，ProX在pH5.7时结构最稳定。
因而在上述两个研究中，来自于GE Healthcare生命科学部的等温滴定量热仪ITC200 和差示扫描量热仪VP-Capillary DSC在探寻制备ProX最佳制剂方法方面提供了非常重要的信息。
由于蛋白质分子内在的不稳定性，包括物理不稳定性（伸展、聚集、吸附）和化学降解性（氧化、脱酰胺、断裂），以基于蛋白质的治疗发展面临着巨大的挑战。
蛋白的不稳定可以导致蛋白活性降低甚至可能产生潜在的免疫原性。
为增加蛋白的稳定性，可以尝试改变蛋白所在溶剂的性质，包括选择缓冲液系统，调节pH值，添加辅料/添加剂，即研发最佳剂型。
等温滴定量热法对镇痛药与止吐药术后联合应用的相互作用研究
等温滴定量热法对镇痛药与止吐药术后联合应用的相互作用研究龚丽娜;李天佐【摘要】目的:采用等温滴定量热法探讨镇痛药与止吐药术后联合应用的相互作用,并明确可否同一装置给药.方法:根据临床用药习惯把试验样品分成四组,采用等温滴定量热法观察临床常用的术后镇痛药舒芬太尼、曲马多、羟考酮、氟比洛芬酯、右美托咪定及止吐药昂丹司琼的相容性.模拟手术室温度为25℃,测定各药物的热力学参数吉布斯自由能ΔG和结合常数焓变ΔH和熵变ΔS,得到相应的反应活性图谱,通过比较|ΔH|与T|ΔS|,结合数据绘图定性分析来判断溶合反应类型.结果:四组试验样品两两溶合过程中均为|ΔH|<T|ΔS|,反应活性谱热量变化(<0.05μJ)为熵驱动反应,未发生质变.结论:舒芬太尼、曲马多、羟考酮、氟比洛芬酯、右美托咪定及昂丹司琼结合未发生化学反应,临床上的联合应用是安全可靠的,可在同一给药装置配泵给药.【期刊名称】《中国医院用药评价与分析》【年(卷),期】2019(019)004【总页数】7页(P393-398,402)【关键词】术后镇痛药;同一装置给药;相容性;等温滴定量热法【作者】龚丽娜;李天佐【作者单位】首都医科大学附属世纪坛医院麻醉科,北京 100089;首都医科大学附属世纪坛医院麻醉科,北京 100089【正文语种】中文【中图分类】R969.2随着外科手术量的逐年增长、快速康复外科理念的影响及人们对术后舒适度的要求不断提高，术后镇痛泵的应用越来越多，应用的药物种类也在增加，多模式镇痛和联合用药已成为趋势[1-2]。
目前主要使用阿片类药物[3]、非甾体药及止吐药等。
理论上，根据不同药物的作用靶点不同的机制可使镇痛更加完善，减少各药物的不良反应[4]。
但临床实际应用中，各药物之间是否发生成分的改变尚不清楚，特别是术后镇痛泵中经常加入4种甚至更多药物在同一装置给药。
联合用药在具有优势的同时[5-7],也存在着风险和危害[8-9]。
等温滴定量热法探究金属离子与生物小分子相互作用方法[发明专利]
![等温滴定量热法探究金属离子与生物小分子相互作用方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/03b90152f4335a8102d276a20029bd64783e629b.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011008921.4(22)申请日 2020.09.23(71)申请人 上海理工大学地址 200093 上海市杨浦区军工路516号(72)发明人 徐斐 张坤 阴凤琴 袁敏 曹慧 叶泰 吴秀秀 (74)专利代理机构 上海德昭知识产权代理有限公司 31204代理人 郁旦蓉(51)Int.Cl.G01N 25/48(2006.01)G01N 24/08(2006.01)G01N 31/16(2006.01)(54)发明名称等温滴定量热法探究金属离子与生物小分子相互作用方法(57)摘要本发明提供一种等温滴定量热法探究金属离子与生物小分子相互作用方法，用于测定金属离子与生物小分子结合过程中的热力学参数和具体结合位点，包括：S1，配制缓冲溶液；S2，采用缓冲溶液分别配制一定浓度的金属离子溶液以及功能单体溶液，而后进行超声处理、冷冻离心，得到处理后的金属离子溶液以及处理后的功能单体溶液；S3，将处理后的金属离子溶液以及处理后的功能单体溶液分别加入等温滴定量热仪的滴定针和样品池中，并设置相关试验参数，而后测定处理后的金属离子溶液中的金属离子与处理后的功能单体溶液中的生物小分子之间结合的热力学参数；S4，利用核磁共振光谱仪测定金属离子与生物小分子之间结合的具体结合位点。
权利要求书2页 说明书4页 附图2页CN 112113998 A 2020.12.22C N 112113998A1.一种等温滴定量热法探究金属离子与生物小分子相互作用方法，用于测定金属离子与生物小分子结合过程中的热力学参数和具体结合位点，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1，配制一定浓度的缓冲溶液；步骤S2，采用所述缓冲溶液分别配制一定浓度的金属离子和功能单体溶液，而后进行超声处理、冷冻离心，得到处理后的金属离子溶液以及处理后的功能单体溶液；步骤S3，将处理后的所述金属离子溶液以及处理后的所述功能单体溶液分别加入等温滴定量热仪的滴定针和样品池中，并设置相关试验参数，而后测定处理后的所述金属离子溶液中的金属离子与处理后的所述功能单体溶液中的生物小分子之间结合的热力学参数；步骤S4，利用核磁共振光谱仪测定所述金属离子与所述生物小分子之间结合的具体结合位点。
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• Blue: integration of heats over time (J vs. mole ratio)
• Ka = 1.4 x 107 M-1, enthalpy = 135 KJ mol-1, stoichiometry = 1.15
→
Enthalpy / Entropy Compensation
Nano ITC Standard Volume
0.10 5,000 ± 0.02 ± 0.0025 1.0 1.6 150-400 rpm
a – Stirring = 0 rpm b - Maximum signal in linear range. Nano ITC LV: >3,000 J is achievable with proper chemical calibration Nano ITC SV: >5000 J is achievable with proper chemical calibration c - Averaged Standard Deviation without stirring, 3-minute window and no slope correction
2 1.5
Estimate:
Kd, ΔG, ΔS, stoichiometry ΔCp, Δ[H+], Km, kcat, Ki
time (seconds)
Rationalize: Δ (biomolecular structure)
Lead optimization Δ (Mutant Activities) Metal/Proton affinities
Kawasaki & Freire Drug Discolications using ITC
Binding between macromolecules:
binding constant stoichiometry enthalpy entropy free energy
New Nano ITC Low Volume
Available with • 1 mL • Cylindrical • Gold/ Hastolley Sample Cells
• Reliable • Flexible • Minimum Sample Consumption
• Maximum Sensitivity
Experimental approaches are applicable to all biological macromolecules, not just proteins
Protein/Protein Interactions
• ITC
is ideal for characterizing heterodimer association and
Twisted stirrer paddle
Standard Volume (1 mL) – 100 L and 250 L syringe Low Volume (190 L) – 50 L syringe
Nano ITC Ready for Titration
Guide the buret with injection
Nano ITC Specifications
Nano ITC Low Volume
Min detectable heat (J)a Max detectable heat (J)b Baseline stability (W/hr)a Short term noise (W)c Active Cell volume (mL) Sample Fill Volume (mL) User- selectable stirring speeds 0.05 3,000 ± 0.02 ± 0.0014 0.190 0.300 150-400 rpm
dissociation, homodimer dissociation • Titrate porcine pancreatic trypsin (440 M, 100 L, 20 x 5 L aliquots) into soybean trypsin inhibitor (2.1 M, 1.0 mL), pH 4.5 • Red: heat produced from each injection
Favorable hydrogen bonds Dominated by hydrophobic interactions Favorable hydrogen bonds Hydrophobic interactions
10 5 0
dG dH -TdS
kcal/mole
-5 -10 -15 -20
Entropy Hydrophobic interactions Solvation entropy due to release of water (favorable)
Enthalpy Directly associated to number and strength of H-bonds broken or formed Choice of solvent important
Nano ITC Design
Choice of Sample Cell Volume
190 µL
1.0 mL
Nano ITC - Burette and Titration Syringe
Embedded linear actuator
Threaded syringe mount Spring loaded electronic connections for wire free operation
(258 µM 2'CMP, 70 µM RNAseA, 5 µL injections, 250 rpm stirring)
3.5 0.8 3 2.5 K = 1.9 x 106 mol-1 DH = -57.5 kJ/mol n = 1.00 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 1 0.2 0.5 0 -0.5 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 0.1 0 -0.1 7000
ITC measures the production and absorption of heat
Direct measure of Enthalpy
Provides information on thermodynamics of the reaction
Technique of choice for affinity measurements
Isothermal Titration Calorimetry (ITC)
Why use Nano ITC?
ITC is recognized as “Gold Std” technique for measuring molecular binding reactions Completely general technique
Figure Courtesy of TA Consultant Phil Synder, Harvard University
heat rate (µcal/s)
heat rate (µJ/s)
ITC Data
Thermodynamic Signature Reflects the Magnitude of Different Contributions to Binding
Etc. – Any interacting molecules
Protein-Protein Interaction
The affinity of an interaction is a basic chemical property of the interaction. Researchers identify the affinity of an interaction, so they can then try and block/strengthen the interaction to influence a therapeutic-cellular response. Drug discovery, Enthalpy and stoichiometry provide additional information Type of binding (hydophobic/H-bonding) Ratio of binding
The Basics of ITC
1. Mix two solutions 2. Measure the Heat (ΔH) 3. Analyze heat changes using an assumed model
DG = -RTlnKa = DH-TDS
2'CMP titrated into RNAseA
Binding to complex macromoleculer targets (e.g., higher order complexes/liposomes) Nanomaterial association Competition experiments Enzyme kinetics
Natural, unmodified ligands and substrates can be used Requires neither immobilization or labeling
Equally useful for macromolecules and small molecules Compatible with essentially any buffer or additive
等温滴定量热技术在生物领域之应用