HPLC法测定咸蛋_皮蛋黄中的四种苏丹红染料

苏丹红（Ｓｕｄａｎ ｄｙｅｓ）是一种人工合成的偶氮类、油溶 性的化工染料，被广泛用于溶剂、油、蜡和汽油的增 色以及鞋、地板的增光，其中本研究所指苏丹红Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ已被国际癌症研究机构列为三类致癌物之 一，禁止作为色素添加剂在食品和饲料中使用，而其 残留在动物体内对食用者的健康和生命安全都存在潜在 的威胁。苏丹红的分析主要采用高效液相色谱法［１－２］、气 质联用法［３］、液质联用法［４］、酶联免疫吸附法［５］、薄层 色谱法［６］等，这些方法有的前处理过程复杂、检测时间 长、检测费用高、仪器设备贵，有的灵敏度低、有 的检测组分单一。
提取：称取 １０ｇ（精确至 ０．００１ｇ）试样，置匀浆杯中 匀浆，加 １０ｇ 无水硫酸钠混匀后，再加 ６０ｍｌ 正己烷匀 浆 ５ｍｉｎ，滤出清液，再以 ２０ｍｌ 正己烷分两次匀浆，过 滤，合并三次滤液于旋转蒸发仪上蒸至 ５ｍｌ 以下。
净化：ＢＥＳＥＰ Ａｌｍｉｎｕｍ Ｎ 固相萃取小柱先用 １０ｍｌ 正 己烷预淋洗。再将上述的提取液慢慢加入氧化铝小柱 中。为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为 ２ｍｍ 左右时上样。在全程的层析过程中不应使柱干涸，用 正己烷少量多次淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱中，控 制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 ０．５ｃｍ，待样液全 部流出后，用 ２０ｍｌ 正己烷洗柱，直至流出的溶液无色， 弃去全部的正己烷洗液，用含 １０％ 丙酮的正己烷液 ２０ｍｌ 洗脱、收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至 ５ ｍ ｌ ，经 ０．４５μｍ 有机滤膜过滤后供高效液相色谱分析。
一些液相方法中苏丹红的标准工作液熔剂是正己 烷，这样出来的峰的形状不正常，而改用丙酮做溶剂， 所测出的苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ峰形尖锐、对称， 而且所作的校正曲线相关系数为 ０．９９９５～０．９９９９。样品前 处理过程中，样品加入一定量的无水硫酸钠混匀，再 加正己烷匀浆，所得的回收率较高。标准中使用自己 装填的净化小柱，由于每个人的加工水平、填料的烘 烤时间、温度、活化时加入水分的均匀性等的差异， 容易造成小柱的净化效率的不同，为提高净化效率、回 收率和样品重复性，本实验用 ＢＥＳＥＰ Ａｌｍｉｎｕｍ Ｎ 小柱， １０％ 的丙酮 － 正己烷洗脱液，对市售咸蛋和皮蛋黄中的 四种苏丹红染料进行测定。
样品前处理过程中，咸蛋样品先加入一定量的无水 硫酸钠混匀，再加正己烷匀浆，所得的回收率较高。 因为咸蛋和皮蛋中含有一定量的水分，如果直接加入正
※分析检测
食品科学
2009, Vol. 30, No. 02 195
己烷，苏丹红染料的提取效率不高，而加入无水硫酸 钠吸取水分，再加入正己烷提取，大大提高提取效率。 皮蛋样品因碱性强，如果提取后过中性氧化小柱，回 收率仅 ４０％ 左右。而在提取时加入一定量的醋酸，使 其显中性，再同咸蛋样品的提取净化法，则可大大提 高其回收率。
１．６ 回归方程、相关系数及检测限 取 １ ． ３ 中系列浓度的苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准
工作溶液，按 １．２ 的色谱条件每种浓度进样 １０μｌ，以峰 面积 Ｙ 对标准溶液质量浓度 Ｘ（ｇ／Ｌ）进行线性回归分析， 得苏丹红回归方程和相关系数，见表 １ ，苏丹红在 ０ ～ ０．５ｍｇ／Ｌ 质量浓度范围内均与峰面积呈良好线性关系。 根据国际纯粹与应用化学联合会议（ＩＵＰＡＣ） 定义，本方 法的检出限为产生响应于 ３ 倍背景噪音的标准偏差分析 信号的分析物浓度值。由此可得，苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ的最小检出限均为 １０μｇ／ｋｇ。
Table 1
表 １ 回归方程和相关系数 Regress equations and correlation coeffients for Sudan
Ⅰ to Ⅳ determination
组分 苏丹红Ⅰ 苏丹红Ⅱ 苏丹红Ⅲ 苏丹红Ⅳ
回归方程 Ｙ＝６．３３ × １０４Ｘ － １．９１ × １０３ Ｙ＝４．５５ × １０４Ｘ － ２．９４ × １０３ Ｙ＝１．０２ × １０４Ｘ － ４．４２ × １０３ Ｙ＝７．８０ × １０４Ｘ － ２．３８ × １０３
色谱柱：Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８（２５０ｍｍ × ４．６ｍｍ，５μｍ）； 流动相：溶剂 Ａ：０．１％ 甲酸水溶液 － 乙腈（８５：１５，Ｖ／Ｖ）； 溶剂 Ｂ：０．１％ 甲酸水溶液 － 丙酮（８０：２０，Ｖ／Ｖ）；梯度洗 脱：前 １０ｍｉｎ Ａ 载液比例为 ２５％，从 １０ｍｉｎ 到 １２ｍｉｎ Ａ 载液比例由 ２５％ 逐渐降低到 ０，最后 ７ｍｉｎ 以 １００％ Ｂ 载 液洗脱。使用前过 ０ ． ４ ５μｍ 滤膜；流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ； 紫外检测波长：４ ７ ８ ｎ ｍ 和 ５ ２ ０ ｎ ｍ ；进样量：２ ０μｌ 。 １．３ 标准溶液的配制
乙腈、丙酮为色谱纯；甲酸、乙醚、正己烷、无水 硫酸钠为分析纯；１０％丙酮的正己烷液；ＢＥＳＥＰ Ａｌｍｉｎｕｍ Ｎ 固相萃取小柱（３ｍｌ），水为超纯水；流动相经 ０．４５μｍ 微孔滤膜减压过滤。
高效液相色谱仪（配 １５２５ 泵、７１７ ＋自动进样器、２４８７ 紫外检测器、ＥＭＰＯＷＥＲ 色谱工作站） Ｗａｔｅｒｓ 公司。 １．２ 色谱条件
苏丹红Ⅰ
苏丹红Ⅳ 苏丹红Ⅱ 苏丹红Ⅲ
６ ８ １０ １２ １４ １６ １８ ２０ ２２ ２４ ２６ ２８ 时间（ｍｉｎ）
Ａ．溶剂为正己烷
苏丹红Ⅰ 苏丹红Ⅲ 苏丹红Ⅳ
苏丹红Ⅱ
Fig.2
４ ６ ８ １０ １２ １４ １６ １８ ２０ ２２ ２４ ２６ ２８ 时间（ｍｉｎ）
Ｂ．溶剂为丙酮 图 ２ 溶剂的选择对于苏丹红峰形的影响
※分析检测
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2009, Vol. 30, No. 02 193
Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ 法测定咸蛋、皮蛋黄中的 四种苏丹红染料
王明月 １，桂卫星 ２，袁宏球 １
（１．中国热带农业科学院分析测试中心，海南 海口 ５７１１０１；２．南昌市蔬菜科学研究所，江西 南昌 ３３０００１）
摘 要：采用高效液相色谱（ＨＰＬＣ） 法测定咸蛋、皮蛋中的四种苏丹红染料。测定结果表明，苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ在 ０～０．５ｍｇ／Ｌ 时其峰面积与进样质量浓度呈良好的线性关系，其线性相关系数为 ０．９９９９、０．９９９５、０．９９９９ 和 ０．９９９９（ｎ＝６），加标样品测定的相对标准偏差（ＲＳＤ）为 １．１％、２．２％、１．９％ 和 ２．４％（ｎ＝６）。苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 的最小检出限均为 １０μｇ ／ ｋ ｇ 。苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ回收率均为 ９０％～１０５％。结果显示：该方法快速、灵敏、 可靠，具有简便、重现性好的特点。 关键词：咸蛋；皮蛋；苏丹红Ⅰ；苏丹红Ⅱ；苏丹红Ⅲ；苏丹红Ⅳ；高效液相色谱（ Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ ）
２． Ｎａｎｃｈａｎｇ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３０００１， Ｃｈｉｎａ）
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｄａｎ ｄｙｅｓ ｉｎ ｓａｌｔｅｄ ｅｇｇ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｅｇｇ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｕｓｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｓｕｄａｎ ｄｙｅｓ ｈａｖｅ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｆｒｏｍ ０ ｔｏ ０．５ ｍｇ／Ｌ， ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ａｒｅ ０．９９９９， ０．９９９５， ０．９９９９ ａｎｄ ０．９９９９ （ｎ＝６） ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｆｏｒ ｆｏｕｒ Ｓｕｄａｎ ｄｙｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｐｉｋｅｄ ｓａｍｐｌｅ ａｒｅ １．１％， ２．２％， １．９％ ａｎｄ ２．４％ （ｎ＝６）． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ ａｌｌ ｆｏｕｒ Ｓｕｄａｎ ｄｙｅｓ ａｒｅ １０ μｇ／ ｋｇ． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｆｏｕｒ Ｓｕｄａｎ ｄｙｅｓ ｉｓ ９５％ ｔｏ １０５％． Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ， ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｒａｐｉｄ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ｓｉｍｐｌｅ， ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ． Ｋ ｅ ｙ ｗ ｏ ｒ ｄ ｓ ：ｓａｌｔｅｄ ｅｇｇ；ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｅｇｇ；Ｓｕｄａｎ ｄｙｅ Ⅰ；Ｓｕｄａｎ ｄｙｅ Ⅱ；Ｓｕｄａｎ ｄｙｅ Ⅲ；Ｓｕｄａｎ ｄｙｅ Ⅳ； ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ （ＨＰＬＣ） 中图分类号：Ｏ６５７．３１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００９）０２－０１９３－０３
１．５ 苏丹红标准品谱图 标准品谱图见图 １。苏丹红Ⅰ～Ⅳ的保留时间分别
为 ６．５、１１．５、１７．５、２３．５ｍｉｎ 左右。
１
３４２来自４ ６ ８ １０ １２１４ １６ １８ ２０ ２２ ２４ ２６２８ 时间（ｍｉｎ）
１ ． 苏丹红Ⅰ；２ ． 苏丹红Ⅱ；３ ． 苏丹红Ⅲ，；４ ． 苏丹红Ⅳ。
图 １ 苏丹红标准品谱图 Fig.1 HPLC chromatogram of Sudan Ⅰ to Ⅳ
High Performance Liquid Chromatography for Determination of Sudan Dyes in Salted and Preserved Eggs
ＷＡＮＧ Ｍｉｎｇ－ｙｕｅ１，ＧＵＩ Ｗｅｉ－ｘｉｎｇ２，ＹＵＡＮ Ｈｏｎｇ－ｑｉｕ１ （１． Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈａｉｋｏｕ ５７１１０１， Ｃｈｉｎａ ；
苏丹红标准储备液：准确称苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ对照品各 １０ｍｇ，用乙醚溶解并用正己烷稀释成浓度 为 １ｍｇ／ｍｌ 的储备液。