2015-适于转录组测序的枣不同器官总RNA提取方法筛选_魏琦琦

合集下载

适于转录组测序的枣不同器官总RNA提取方法筛选

ｈｔｔｐ：／／ｑｋｓ．ｃｓｕｆｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
适于转录组测序的枣不同器官总ＲＮＡ提取方法筛选
魏琦琦ｌａ－ｃ冯延芝，林青ｌａ－ｃ，贾宝光ｌａ－ｃ张琳ｈ
（１．中南林业科技大学ａ．经济林育种与栽培国家林业局重点实验室；ｂ．经济林培育与保护省部共建教育部重点
ＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒＮｏｎ．ＷｏＯｄＦｏｒｅｓｔＴｒｅｅｓｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎＭｉｎｉｓｔｒｙ；Ｃ．２０１１ＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｏｆＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｒｆＮｏｎ — ＷｏｏｄＦｏｒｅｓｔＴｒｅｅｓｏｆＨｕｎｎａＰｒｏｖｉｎｃｅ．ＣｅｎｒｔａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０００４，Ｈｕｎｎ，ａＣｈｉｎａ；２．ＴｈｅＣｅｎｔｅｒｏｆＲｅｓｅａｒｃｈｎｄａＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｆｏｒＮｏｎ－ｗｏｏｄＦｏｒｅｓｔＴｒｅｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆ
了Ａｍｂｉｏｇｅｎ和Ａｕｔｏｌａｂ２种总ＲＮＡ提取试剂盒和基于Ａｕｔｏｌａｂ试剂盒改良的ＣＴＡＢ法的总ＲＮＡ的提取效果。

适用于转录组测序的灰毡毛忍冬体胚总RNA提取方法筛选

（ＨｕｎａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ。Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０００４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｉｆｎｄｏｕｔｍｉｃｒｏ－ｓｐｏｒｅｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｔｒａｎｅｒｓｉｐｔｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｔｏｏｋｓｏ．
适用于转录组测序的灰毡毛忍冬体胚总ＲＮＡ
提取方法筛选
乔中全，王晓明，陈建军，曾慧杰，李永欣，蔡能
（湖南省林业科学院，湖南长沙４１０００４）
摘
要：为了找到适用于转录组测序要求的灰毡毛忍冬体胚总ＲＮＡ的提取方法，以体胚发育过程中的球形胚、
ｍｅｔｈｏｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｅｗｈｅｄｔｈａｔＲＮＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｉｔｏｎｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｉｍｐｒｏｖｅｄＣＴＡＢｍｅｈｏｔｄｗｅｅｒｌｏｗｅｒ，ａｎｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ－
第４２卷，第６期
２０ｌ５年１２月 Nhomakorabea湖南林业科技
ＨｕｎａｎＦｏｒｅｓｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

适合转录组测序的葡萄叶片总RNA试剂盒提取法的改进

适合转录组测序的葡萄叶片总RNA试剂盒提取法的改进杨晓燕;张波;黄方爱;颜欢;李月荣;郑秋生【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2013(000)006【摘要】RNA试剂盒法是获取植物高质量RNA样品的常用技术,针对3种常见RNA提取试剂盒在红地球葡萄叶样品RNA提取效果进行评估和优化,以期找到适合红地球葡萄叶片RNA表达谱测序需求的高质量RNA提取策略.试验依据3种试剂盒推荐时间和条件进行RNA提取,并对时间等条件进行优化,比对了优化前后RNA质量.结果显示,试剂盒经优化后的方法提取的RNA收率高,完整性好,OD260/OD280在1.8-2.2之间,OD260/OD230大于2,28S与18S条带清晰完整,RNA-Seq测序质量及基因覆盖度符合要求.在红地球葡萄叶片上的RNA提取结果表明,延长提取试剂与样品的接触时间操作可以显著提高RNA提取质量(纯度/完整性).【总页数】6页(P215-220)【作者】杨晓燕;张波;黄方爱;颜欢;李月荣;郑秋生【作者单位】石河子大学药学院,石河子832002;石河子大学药学院,石河子832002;省部共建新疆特种资源植物药重点实验室,石河子832002;石河子大学药学院,石河子832002;石河子大学药学院,石河子832002;石河子大学药学院,石河子832002;省部共建新疆特种资源植物药重点实验室,石河子832002【正文语种】中文【相关文献】1.适用于转录组测序的大豆根总RNA的提取方法研究 [J], 谢钰珍;覃鸿妮;张宇;梅啸;吴凡2.适合软枣猕猴桃花蕾转录组测序的总 RNA 提取方法研究 [J], 李晓艳;张庆田;王振兴;秦红艳;艾军3.葡萄叶片中提取总RNA的三种方法比较 [J], 杨晓燕;张波;黄方爱;颜欢;李月荣4.适合转录组测序的芒果不同组织\rRNA试剂盒提取方法研究 [J], 张宇;黄国弟;莫永龙;龙凌云;张继;唐玉娟5.适用于转录组测序的大蒜花器官总RNA的提取方法 [J], 陈雅楠; 尚云涛; 范宝莉; 刘晓颖; 曹宝鑫; 王振英因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

rna测序思路

rna测序思路RNA测序是一种基于高通量测序技术研究转录组的方法，可以快速获取一个基因组中RNA的种类和数量。

以下是RNA测序的基本思路：1. 样品准备：选择适当的生物样品，如细胞、组织或血液等，根据研究目的和问题来选择。

样品需要经过适当处理以提取出RNA。

2. RNA提取：这是RNA测序的第一步，目的是从样品中提取出RNA分子。

常用的方法有酚-氯仿法、磁珠法、柱子法等。

这一步的目的是去除样品中的DNA、蛋白质和其他杂质，以便进行后续的测序。

3. RNA纯化：提取到的RNA可能会伴随着DNA、蛋白质和其他杂质，需要进行纯化以去除这些杂质。

常用的方法有RNA酶消化、硅胶柱纯化等。

纯化后的RNA 质量对后续的测序结果有很大影响。

4. cDNA合成：由于RNA是单链分子，为了进行测序，需要将其转录成双链DNA，即合成互补DNA（cDNA）。

这一步通常使用反转录酶将RNA作为模板合成cDNA。

5. 文库构建：将cDNA片段连接到测序载体上，构建测序文库。

这一步需要进行末端修复、连接接头、PCR扩增等处理，最终构建成文库。

6. 测序：构建好的文库通过高通量测序技术进行测序。

常用的测序方法有第一代测序技术（Sanger测序）和第二代测序技术（如Illumina测序）。

测序过程会产生大量的原始数据，需要进行后续的数据分析。

7. 数据分析：测序得到的数据需要进行质控、序列比对、注释和差异表达分析等一系列的数据分析步骤。

这些分析可以帮助研究者了解RNA的组成、表达水平和功能等信息。

数据分析是RNA测序的关键步骤，涉及多个复杂的过程和技术。

通过以上步骤，研究人员可以获得基因组中RNA的种类和数量信息，进一步了解基因的表达水平和功能状态。

这有助于揭示基因的表达模式、基因融合、突变和差异表达等方面的信息，为深入探究生命过程和疾病机制提供有力支持。

干种子高质量总RNA的快速提取方法

植物遗传资 பைடு நூலகம் 学报２１，１３：６ —６００１（）３０３３
ＪｕａｆＰｌｎｎｔｅＲｅｏｒｅｏｍｌｏａｔＧｅｅｉｓｕｃｓ
干种子高质量总ＲＡ的快速提取方法Ｎ
胡群文，晓玲张志娥辛霞卢新雄刘旭陈，，，，
表达研究，为从具相似成分的其他物种干种子提取总ＲＡ提供参考方法。并Ｎ
关键词：子；Ｒ种总ＮＡ提取；Ｄ异硫氰酸胍；Ａ反转录；Ｔ— ＣＲＳＳ；ＲＮＲＰ
ＡＲｐｄＥｔａｔｎＭｅｈｄｏｇａｉｏａＮｒｍｒｅｄａｉｘｒｃｉｔｏｆＨｉｈＱｕｌｙＴｔｌＡｆｏＤｙＳｅｓｏｔＲ
（中国农业科学院作物科学研究所／农业部作物种质资源与生物技术重点开放实验室，京１０８北００１
安徽省安庆市种植业管理局，庆安２６０）４０１
摘要：效快速提取高质量的种子ＲＡ是种子分子生物学研究的基础。现有的提取方法难以高效快速地从种子中得到高Ｎ
ＨＵＱｕ．ｅＣｎｗｎ＇ＨＥＮＸｉｏｌｇ，ＨＡＮＧＺｉｅＸＮＸｉＬｎｘｏｇ，Ｉ，ａ —ｉＺｎｈ— ，ＩａＵＸｉ — ｉｎＬＵＸｕ，
（ＫｅａｏａｏｙｏｒｐＧｒｐａｍｓｕｃｓ＆ＢｉｔｈｏｏｙｙＬｂｒｔｒｆＣｏｅｍｌｓＲｅｏｒｅｏｅｎｌｇ。ｃ

大麦不同器官总RNA提取方法研究

大麦不同器官总RNA提取方法研究作者：郭萍李晓江冯紫洲等来源：《安徽农业科学》2015年第17期摘要 [目的] 探索出一套较好的大麦总RNA提取方法。

[方法]以大麦的叶片、茎秆和子粒为试验材料，探索各器官总RNA提取方法。

[结果]所得产物的检验结果表明，总RNA具有整齐且清晰的28S rRNA、18S rRNA条带，A260/A280均介于1.8～2.0。

将提取的叶片总RNA反转录成cDNA，RT.PCR检测PCR产物在1 500 bp处。

[结论]用此方法提取的大麦各器官总RNA质量较好，纯度较高，完整性较好，可用于进一步的分子生物学研究。

关键词大麦；总RNA；提取中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）17-033-02Abstract [Objective] The aim was to explore total RNA extraction methods for different organs of barley. [Method] Using barley leaves， stems and grains as the experimental materials ， the total RNA extraction method of these organs were explored. [Result]The detected results of these products showed that the total RNA had clear and neat stripes of 28S rRNA and 18S rRNA in the RNA electrophoresis. The ratios of A260/A280 were between 1.8 to 2.0. Leaves total RNA isolated by these methods were reverse transcribed and high quality cDNA were obtained. RT.PCR detected the product of PCR was in the 1 500 bp.[Conclusion]These results showed that the quality of the extracted barley total RNA were good， high purity， good integrity， and were suitable for further research in molecular biology.Key words Barley； Total RNA； Extraction大麦（Hordeum vulgare L.）属于禾本科小麦族大麦属普通大麦种，因营养价值高，兼有食用、饲用和酿造用等多种用途，在农业生产和国民经济发展中具有重要意义[1] 。

转录测序技术在筛选枣缩果病抗病基因中的应用[发明专利]

专利名称：转录测序技术在筛选枣缩果病抗病基因中的应用专利类型：发明专利
发明人：宋晓斌,焦小利,黄建,杨卉心
申请号：CN201910189047.X
申请日：20190313
公开号：CN109929923A
公开日：
20190625
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种转录测序技术在筛选枣缩果病抗病基因中的应用，涉及生物基因技术领域。

本发明的枣缩果病由细交链孢菌浸染引起。

枣的品种为抗缩果病的蜂蜜罐和感缩果病的七月鲜。

转录测序技术包括预处理、转录组测序及数据处理。

预处理包括：提取枣总RNA、检测总RNA质量、合成cDNA文库及实时荧光定量PCR验证。

本发明以枣抗缩果病‘蜂蜜罐’、感缩果病‘七月鲜’及其清水处理对照材料，以细交链孢菌(A.altrenata)为诱导条件，通过利用转录组测序技术及qPCR等技术从分子水平研究枣果实在细交链孢菌(A.altrenata)诱导下的应答机制，以便筛选枣缩果病抗病基因，为枣育种工作提供一定的理论基础。

申请人：西北农林科技大学
地址：712100 陕西省咸阳市杨凌.邰城路3号林学院
国籍：CN
代理机构：北京方圆嘉禾知识产权代理有限公司
代理人：董芙蓉
更多信息请下载全文后查看。

番茄果实总RNA提取方法的定量比较分析

番茄果实总RNA提取方法的定量比较分析王爽;吴梦诗;郭润姿;孟楠;寇晓虹【摘要】番茄果实富含多糖和酚类等次级代谢物质,RNA提取难度较大.为了获取高质量的RNA进行分子生物学研究,分别采用改进CTAB法和4种植物RNA抽提试剂盒提取总RNA进行比较分析.结果表明,柱式试剂盒提取的RNA质量和产量较高,且操作简便,但需进一步纯化.利用RT-PCR技术,采用试验提取的RNA,成功克隆出NAC15基因片段并进行定量分析,进一步表明RNA品质可以满足定性定量分子生物学研究.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2012(021)012【总页数】4页(P112-115)【关键词】番茄果实;RNA提取;改良CTAB法;RNA试剂盒【作者】王爽;吴梦诗;郭润姿;孟楠;寇晓虹【作者单位】天津大学化工学院,天津300072;天津大学化工学院,天津300072;天津大学化工学院,天津300072;天津大学化工学院,天津300072;天津大学化工学院,天津300072【正文语种】中文【中图分类】Q311;S641.2番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是富含营养的呼吸跃变型果实，也是现代分子生物学研究中一种重要的模式植物，许多基因调控番茄果实的成熟和衰老［1］。

NAC家族转录因子是植物特有的一类转录因子，与植物的生长发育过程密切相关［2］，是目前果实生理和生物技术研究的一个热点［3－5］。

快速高效地从番茄果实中提取RNA是进行NAC基因克隆和表达分析等研究的基础。

但番茄果实含水量大，且酚类、多糖等物质和RNase广泛存在，导致提取高质量的RNA难度较大［6］。

目前，番茄总RNA提取方法有CTAB法、SDS法、热硼酸法、高氯酸盐法、异硫氰酸胍法、Trizol法及试剂盒法，不同提取方法对于同一组织材料提取的差异较大［7－9］。

该试验采用改进CTAB法和4种试剂盒方法提取红熟期番茄果实的总RNA，并筛选最优提取方法，为后续研究奠定基础。

一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选方法及应用[发明专利]

专利名称：一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选方法及应用
专利类型：发明专利
发明人：孙道阳,毛雁翔
申请号：CN202210063849.8
申请日：20220120
公开号：CN114480486A
公开日：
20220513
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选方法及应用，以植物矮牵牛作为研究对象，采用转录组测序和VIGS相结合的技术，首先构建TRV病毒侵染的差异表达基因数据库，从中选择极显著差异表达转录因子作为候选基因；分别构建至TRV‑GFP‑PhPDS载体，利用双报告基因分别监测病毒积累与RNA沉默过程；接种矮牵牛后，以绿色荧光和光漂白表型作为筛选依据，在上调表达转录因子中，导致绿色荧光增强、光漂白表型受到抑制的基因认定为正调控转录因子，在下调表达转录因子中，造成绿色荧光减弱、光漂白表型受到促进的基因认定为负调控转录因子。

本发明为研究植物抗病毒RNA沉默转录调控机理提供了一种简单、快速、有效的基因筛选方法。

申请人：西北农林科技大学
地址：712100 陕西省西安市杨凌示范区邰城路3号
国籍：CN
更多信息请下载全文后查看。

微囊藻群体总RNA提取方法的比较

微囊藻群体总RNA提取方法的比较高胜玲;黄亚新;卢亚萍;施丽梅;孔繁翔;张小倩【摘要】Microcystis colonies are rich in polysaccharide materials which are the key factors influencing RNA extraction.In order to obtain high-quality total RNA from Microcystis colonies,comparative study of several methods including Method 1 PGTX-bead,Method 2 CTAB-bead,Method 3 FastRNA(R) Pro Blue Kit and Method 4 RNeasy Mini Kit was conducted.All these methods were suitable for polysaccharide-rich materials.The integrity of RNA was analyzed by agarose gel electrophoresis,RNA concentration and purity were detected by Nanodrop ND1000 spectrophotometer,and DNA contamination was determined by qPCR.The results demonstrated that all the four methods were able to extract RNA from Microcystis colonies,and they were able to be used for down-stream experiments,such as RT-PCR,after the contaminated DNA was removed.Method 1 (PGTX-bead extraction) yielded RNA of highest concentration,good purity,low DNA contamination and it was low cost;Method 2 (CTAB-bead extraction) also yielded RNA of high concentration,but with heavy DNA contamination.This method was suitable for samples that need simultaneous isolation of RNA and DNA.Method 3 (FastRNA(R) Pro Blue Kit) and Method 4 (RNeasy Mini Kit) extraction yielded RNA of low concentration,but Method 4 had simpler protocol,less time consuming,higher relative expression of the detected function gene,thus was suitable for extracting total RNA from small amount of Microcystiscolonies.%微囊藻群体富含多糖类物质是影响微囊藻RNA提取的关键因素.为了获得高质量的微囊藻群体总RNA,对比分析4种针对多糖含量较高的方法——方法1 PGTX-bead法、方法2 CTAB-bead法、方法3 FastRNA(R) Pro Blue Kit和方法4RNeasy Mini Kit对微囊藻群体总RNA的提取效果.采用琼脂糖凝胶电泳检测微囊藻群体RNA的完整性,NanodropND1000分光光度计检测RNA纯度及浓度,并采用qPCR检测DNA污染情况.结果表明,4种方法都能从微囊藻群体中提取获得RNA,并在去除DNA后都可以进行RT-PCR等后续实验.方法1 PCTX-bead提取的RNA产量最高,纯度好,DNA污染小,成本低,适合从微囊藻群体中大量提取RNA;方法2 CTAB-bead提取的RNA样品产量也较高,但DNA污染严重,适合需要同时提取DNA和RNA的样本;方法3 FastRNA(R)Pro Blue Kit和方法4 RNeasy Mini Kit提取的RNA产量都较低,但方法4操作简单,耗时短,所检测目的基因的相对表达量较高,更适合从少量的微囊藻群体中提取总RNA.【期刊名称】《湖泊科学》【年(卷),期】2018(030)002【总页数】8页(P441-448)【关键词】微囊藻群体;RNA提取;qPCR;多糖【作者】高胜玲;黄亚新;卢亚萍;施丽梅;孔繁翔;张小倩【作者单位】南京农业大学生命科学学院,南京210095;中国科学院南京地理与湖泊研究所湖泊与环境国家重点实验室,南京210008;南京农业大学生命科学学院,南京210095;南京农业大学生命科学学院,南京210095;中国科学院南京地理与湖泊研究所湖泊与环境国家重点实验室,南京210008;中国科学院南京地理与湖泊研究所湖泊与环境国家重点实验室,南京210008;南京农业大学生命科学学院,南京210095【正文语种】中文蓝藻水华在富营养化湖泊中广泛存在，微囊藻(Microcystis)是形成水华的优势类群，从而受到高度重视，是水华藻类中研究最多的一种[1]. 它们繁殖快，产生毒素，给生态环境带来了很大的危害[2]. 微囊藻具有与革兰氏阴性细菌相似的细胞壁[3]，具有较强的暗适应和低温适应等生理特点[4]，并具有不同的形态种，存在群落结构的演替[4]，这些都引起了科学家们越来越多的关注，但是目前其形成水华的机理仍在进一步探索中[5]. 而从RNA分子水平上研究微囊藻应对环境的响应机制，有助于从微囊藻自身生理特性以及从转录水平上研究揭示水华发生机理[6].微囊藻大多以群体形式存在于自然水体中，从微囊藻群体中提取高质量的RNA是微囊藻分子生物学研究的重要前提. 任何RNA基础分析的技术，如Northern杂交、mRNA纯化、PCR扩增、cDNA合成和文库构建等研究都需要纯度高和完整性好的RNA[7-9]. 然而，不同的RNA提取方法能够产生不同质量的RNA[10-11]. 微囊藻群体细胞壁外层的胶鞘较厚，影响RNA提取的物质如蛋白质、酚类等的含量较高，RNase的活性也比较高，导致微囊藻群体RNA的提取困难. 同时，微囊藻群体中含有丰富的胞外多糖，使RNA的提取更加困难[12-14]，因此是否能够去除多糖等杂质是影响RNA提取质量的关键因素. 目前，有许多种方法能够从多糖丰富的样品中提取RNA[13,15-16]. 为了选择一个最适合囊藻群体RNA提取的方法，本研究以室内培养的微囊藻群体为材料，对比分析4种针对多糖含量较高的RNA提取方法对微囊藻群体总RNA提取的效果，以期筛选出最适合微囊藻群体RNA的提取方法.1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 藻种及培养采用本实验室自野外分离纯化的铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)群体D2(由蔡元锋博士在2011年从太湖分离得到)，作为RNA提取的样本. 采用BG-11培养基[17]在光照培养箱中进行微囊藻群体的培养. 光照培养箱温度设为25℃，光暗比为12 h∶12 h，光照强度为27 μmol/(m2·s). 待藻群体生长到对数生长期，叶绿素a浓度为28.47±2.12 μg/L时，取相同体积(40 ml)藻液若干份，用孔径为3 μm的聚碳酸酯膜(millipore)收集藻群体，-80℃保存，用于RNA提取.1.1.2 主要仪器与试剂光照培养箱(GZL-P380B，合肥华德利科学器材有限公司)，超净工作台(SW-CJ-1FD，苏州安泰)，小型高速冷冻离心机(Centrifuge 5415R，Eppendorf公司)，电泳仪(DYCP-32B，北京六一仪器厂)，实时荧光定量PCR仪(Mastercycler ep Realplex, Eppendorf, Germany)，凝胶成像仪(ChemiDoc MP,BIO-RAD)，快速核酸提取仪(美国MP FastPrep-24).FastRNA®Pro Blue Kit试剂盒(美国Mpbio公司)、Qiagen RNeasy Mini Kit试剂盒、溴化乙锭(EB)、琼脂糖、无水乙醇、75%乙醇、DEPC-treated ddH2O、氯仿、西曲溴铵(CTAB)、β-巯基乙醇(β-ME)和琼脂粉，其它均为分析纯试剂. 1.2 实验方法选取4种针对多糖含量丰富的样品中提取总RNA的方法，分别从含有微囊藻群体的3 μm的聚碳酸酯膜中提取RNA，FastRNA®Pro Blue Kit和Qiagen RNeasy Mini Kit 2种试剂盒法本身包含机械破碎过程，PGTX和CTAB法增加机械破碎过程如下：将样品转移到2 ml裂解管E(Lysing Matrix E, MP Biomedicals，美国)中，反复颠倒混匀，将裂解管E放置于FastPrep-24样品处理仪器中，6 m/s条件下破碎30 s.1.2.1 方法1 PGTX-bead 参考Pinto等[13]方法提取RNA，并作出适当改进. 具体过程如下：①向样品中加入PGTX(苯酚19.8 g，甘油3.45 ml，8-羟基喹啉0.05 g，乙二胺四乙酸(EDTA)0.29 g，乙酸钠0.4 g，异硫氰酸胍4.75 g，盐酸胍2.3 g，1 ml Triton-X 100，用灭菌的DEPC水定容到50 ml)缓冲液后，使用机械破碎过程和95℃水浴5 min相结合的方法裂解细胞，然后立即冰浴5 min，加入1-溴-3氯丙烷，剧烈涡旋混匀，室温下放置10 min；②离心后转移上清液到新的离心管中，加入等体积的异丙醇沉淀，室温放置10 min后弃上清液；③加入无菌DEPC水配置的75%的乙醇洗涤，离心后倒掉液体，无菌操作台干燥；④用无菌DEPC水溶解沉淀.1.2.2 方法2 CTAB-bead 参考Wang等[15]的方法，并作出适当改进. 具体过程如下：①用预热的CTAB(2% CTAB，2% PVP，1.4 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)，20 mmol/L EDTA，1% β-巯基乙醇(β-ME))缓冲液悬浮样品，涡旋；②进行机械破碎；③裂解液用氯仿/异戊醇(24∶1)抽提2次；④吸取上层水相，加入等体积的异丙醇沉淀RNA；⑤用75%的冷乙醇洗涤沉淀；⑥沉淀在无菌操作台干燥，最后用无菌DEPC水溶解沉淀.1.2.3 方法3 FastRNA®Pro Blue kit 主要按照说明书的步骤进行，并做如下改进，具体过程：①用RNApro溶液悬浮收集的藻体，并进行涡旋；②将涡旋后的样品进行机械破碎；③在4℃条件下进行全速离心，转移上清液到新的离心管中；④加入氯仿涡旋10 s，室温静置5 min，再离心，转移上清液到新的离心管中；⑤用氯仿/异戊醇(24∶1)进行抽提，转移上清到新的离心管中；⑥加入冷的无水乙醇沉淀RNA，上下颠倒混匀，离心后弃上清；之后用75%的乙醇洗涤沉淀，最后用无酶无菌水(RNase-free water)溶解沉淀，-80℃条件下保存.1.2.4 方法4 Qiagen RNeasy mini kit 主要按照说明书的步骤进行，并做如下改进：①用缓冲液RLT悬浮收集到的藻细胞，涡旋；②进行机械破碎；③在13000转/min、4℃条件下离心15 s，上清液用等体积的70%乙醇混合，然后将混合物转移到柱子上；④用RW1和RPE 2种缓冲液各冲洗2次；⑤用50 μl无酶无菌水(RNase-free water)溶解沉淀，-80℃条件下保存.1.2.5 RNA完整性及质量检测取2 μl RNA样品，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测完整性. Nanodrop ND1000分光光度计测定RNA浓度，并测定D260/D280和D260/D230的比值以确定RNA纯度.1.2.6 荧光定量PCR 为验证4种方法提取的RNA样品中DNA污染情况，扩增光合作用相关基因：核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco，Rbcl)，引物序列：上游为5′-CGTTTCCCCGTCGCTTT-3′，下游为5′-CCGAGTTTGGGTTTGATGGT-3′，扩增片段长度128 bp[13,18]，分别对上述4种方法提取的RNA和用DNase 处理后的RNA用Mastercycler ep Realplex(Eppendorf, Germany)荧光定量PCR仪和SYBR Premix Ex Taq II kit(TaKaRa)进行荧光定量PCR，反应总体积为25 μl，包含1×SYBR Premix Ex TaqTM，0.4 μmol/L的上下游引物和模板. 扩增程序：95℃预变性1 min；95℃变性15 s，60℃复性1 min，72℃延伸30 s，共40个循环.1.2.7 RNA中的污染DNA去除用RNase-free DNaseⅠ(TaKaRa)去除DNA，操作按照说明书的步骤进行，具体过程：①反应体系：RNA 20～50 μg，5 μl10×DNaseⅠ缓冲液，2 μl DNaseⅠ(RNase-free，5 U/μl)，0.5 μl RNase抑制剂(40 U/μl)，补水至总体积50 μl；②37℃反应20～30 min；③加入50 μl灭菌的DEPC水，再加入100 μl的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀；④离心，将上层(水层)移至另一微量离心管，加入100 μl的氯仿/异戊醇(24∶1)，充分混匀；⑤离心，取上层(水层)移至另一微量离心管，加入10 μl的3 mol/L的乙酸钠(pH5.2)和250 μl的冷无水乙醇，-20℃条件下放置30～60 min；⑥离心回收沉淀，用70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥，用适量无菌DEPC水溶解.1.2.8 反转录荧光定量PCR 去除DNA污染后，根据不同方法提取的RNA浓度不同，计算400 ng所需体积进行反转录. 按照Transciptor First Strand cDNA Synthesis Kit说明书的要求进行反转录：加入1 μl Anchored-oligo(dT)和2 μl随机六聚物引物，400 ng RNA和适量PCR级别的水，使总体积为13 μl，混合之后在PCR仪中65℃温浴10 min. 温浴之后再依次加入4 μl transcriptor reverse transcriptase reaction缓冲液、0.5 μl RNA抑制剂、2 μl脱氧核苷酸混合剂和0.5 μl transcriptor reverse transcriptase，混匀之后放在PCR仪上反应，设置PCR仪的程序为25℃ 10 min，55℃ 30 min以及85℃ 5 min. 将反应完之后的PCR管立即放置冰上，将得到的cDNA保存在-20℃中备用.PCR过程中以微囊藻特异16S rRNA为内参基因，引物序列为：上游为5′-GCCGCRAGGTGAAAMCTAA-3′，下游为5′-AATCCAAARACCTTCCTCCC-3′，PCR反应条件：95℃预变性10 min; 95℃变性10 s，55℃复性10 s，72℃延伸30 s，共45个循环[19]. 目的基因为Rbcl，以cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体系和扩增程序如上所述(1.2.6). 每个样品的内参基因Ct值与目的基因Ct值之差即为ΔCt，用2ΔCt法计算出各个样品相对于内参基因的目的基因的相对表达量[16]，然后再进行样品间相对表达量的比较.2 结果与分析2.1 PGTX和CTAB法增加机械破碎前、后的RNA提取效果比较为了阐明加入机械破碎对提取微囊藻群体总RNA效果的影响，本文采用FastPrep-24快速核酸提取仪对PGTX和CTAB 2种方法进行机械破碎前后的RNA提取效果比较. PGTX和CTAB 2种方法提取RNA的D260/D280和D260/D230的比值变化不大，表明机械破碎前、后对RNA的纯度影响不大；但PGTX法增加机械破碎后产量大约是破碎前的3倍，CTAB法增加机械破碎后产量大约是破碎前的2倍，表明机械破碎能够显著增加微囊藻群体总RNA的提取产量(图1).图1 PGTX和CTAB法增加机械破碎前后提取的RNA产量和纯度Fig.1 Yield and purity of RNA extracted before and after the addition of mechanical disruption of the PGTX and CTAB methods2.2 RNA完整性检测采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，结果表明4种方法都能够从微囊藻群体中提取到总RNA(图2)，方法1和方法2电泳条带(23S/16S)清晰明亮，RNA完整性好，但方法2能观察到清晰的DNA条带，DNA污染严重；方法3和方法4电泳条带微弱，结合表1可知，这2种方法提取的RNA完整性较好，但产量低.图2 4种方法提取的微囊藻群体RNA琼脂糖凝胶电泳图谱(1～2：方法1提取的总RNA；3～4：方法2提取的总RNA；5～6：方法3提取的总RNA；7～8：方法4提取的总RNA；M：DL2000 Marker)Fig.2 Agarose gel electrophoresis for RNA extracted from Microcystis colonies by the four methods(1～2：RNA extracted from Method 1；3～4：RNA extracted from Method 2；5～6：RNA extracted from Method 3；7～8：RNA extracted from Method 4；M：DL2000 Marker)2.3 RNA的产量和纯度分析方法1和方法2从微囊藻群体中提取的RNA浓度分别为77.3和15.4 ng/μl，而方法3和方法4提取的RNA浓度仅分别为8.9和7.4 ng/μl(表1). 方法1提取的RNA浓度明显高于其他3种方法(P<0.05)，大约是方法4的10倍. Nanodrop ND1000分光光度计检测结果表明，4种方法获得的RNA样品D260/D280的比值都接近2.0，表明RNA样品中没有蛋白质等杂质的污染；而D260/D230的比值都小于2.2，说明存在酚类和糖类等杂质污染，方法1提取的RNA酚类和糖类等污染较小，方法3污染最严重.表1 4种方法提取的RNA的产量和纯度比较Tab.1 Comparison of RNA yield and purity obtained by the four methods提取方法RNA产量/(ng/μl)D260/D280D260/D230PGTX-bead77.3±15.61.95±0.131.53±0.16CTAB-bead15.4±3.41.98±0.340.90±0.06FastRNAProBlueKit8.9±1.91.86±0.100.84±0.15RNeasyMiniKit7.4±1.21.92±0.130.96±0.10图3 4种方法提取的微囊藻群体总RNA用DNase处理前、后qPCR分析Fig.3 qPCR analysis of total RNA extracted from Microcystis colonies using the four methods before and after DNase treatment2.4 qPCR检测基因组DNA污染qPCR结果(图3)可知，方法2提取的RNA样品直接进行荧光定量PCR，Ct值仅为14.34±0.05，DNA污染最严重；方法1和方法4提取的RNA样品直接进行荧光定量PCR，Ct值分别为20.9±0.06和22.92±0.02，DNA污染较小；用DNase处理后，4种方法提取的RNA样品进行荧光定量PCR，Ct值都在30.0左右，与未加模板的阴性对照的荧光定量PCR Ct值接近(30.52±0.24)，表明RNA 样品中的基因组DNA基本被去除.2.5 反转录荧光定量PCR检测Rbcl基因的mRNA水平qPCR结果表明不同RNA提取方法之间存在差异(表2). 因为16S rRNA更加丰富和稳定，所以qPCR结果受到特定信使RNA检测的高度影响. 方法4提取的RNA 的Rbcl基因相对表达水平最高，为7.88×10-4，方法1次之，为6.18×10-4，而方法3和方法2提取的RNA的Rbcl基因表达水平都较低(表2).表2 4种方法提取RNA的Rbcl基因相对表达量Tab.2 Relative expression of Rbcl gene using RNA extracted from the four methods提取方法16SrRNACtRbclCtRbcl表达PGTX-bead13.58±0.2324.24±0.156.18×10-4CTAB-bead13.56±0.1724.99±0.283.62×10-4FastRNAProBluekit11.69±0.4726.16±0.494.41×10-5RNeasyMiniKit12.81±0.2823.12±0.197.88×10-43 讨论铜绿微囊藻群体中含有丰富的胞外多糖，通常情况下，胞外多糖以粘液层或胶鞘的形式围绕在群体周围，其粘度值相当于甚至高于黄原胶[20]，不仅难以实现完全的细胞溶解，还干扰大多数核酸净化过程[21-22]；同时，铜绿微囊藻细胞也含有丰富的核酸内切酶、核酸外切酶和光合色素，它们可以抑制酶促反应，尤其是逆转录[23-24]和PCR[25-26]. 这些因素的存在使RNA的提取更加困难，严重地降低了RNA的提取产量和纯度. RNA的提取方法有很多，提取过程大致可分为3个部分：细胞裂解、从周围基质中提取RNA和纯化，细胞裂解在提取过程中最为重要[27]. 提取RNA的基本原理都是将细胞裂解后，把RNA与蛋白质、糖类和DNA等杂质分离开. RNA的纯度和提取量是评价核酸提取方法的一个重要指标，因为提取产量高、纯度好的RNA是进行各种后续研究的前提. 因此，根据所用微囊藻群体自身理化性质的不同，选择最适合从微囊藻群体中提取总RNA的方法至关重要.方法1 PGTX-bead法是一种强变性剂法，PGTX缓冲液能够迅速抑制RNase的活性. 苯酚和胍盐是非常有效的蛋白质变性剂，他们的结合使核糖核酸酶快速变性[28-29]. 同时加入8-羟基喹啉，它既是苯酚稳定剂又是核糖核酸酶抑制剂[30]. 该方法的优点是蛋白变性剂的存在，能够强烈抑制RNase的活性，可用于大量细菌总RNA的提取. 与改进前[13]相比，使用机械破碎和95℃水浴5 min相结合的方法裂解细胞，总RNA提取量明显增加. 在4种方法中，方法1提取的RNA质量和产量最高，且成本较低，目的基因表达水平较高，最适合从微囊藻群体中提取总RNA.方法2 CTAB-bead法，浓度较高的CTAB可沉淀核酸和酸性多聚糖，有效地裂解细菌细胞壁，与β-巯基乙醇共同作用使蛋白变性[31]. 因此，在含有大量多聚糖的有机体中提取核酸时，可以利用CTAB作为裂解液[32]. 再与机械破碎法相结合，在FastPrep均质破碎仪中激烈振荡使微囊藻细胞壁及其外层的胶鞘充分裂解，从而有效地提取总RNA. 方法2提取的RNA样品凝胶电泳图像(图1)和qPCR(图2)结果可知，此方法提取的微囊藻群体总RNA中DNA污染严重，适合需要同时提取DNA和RNA的样本.方法3 FastRNA®Pro Blue Kit法，是一种能够从革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌中快速有效的提取总RNA的试剂盒法. RNApro溶液在细胞裂解过程中使RNase失活，防止RNA降解. 从表1和图2结果可知，方法3 FastRNA®Pro Blue Kit法提取的微囊藻群体总RNA浓度低，DNA污染较严重，目的基因表达水平很低，而且成本较高，不适合从微囊藻群体中提取RNA.方法4 Qiagen RNeasy Mini Kit是一种应用比较广泛的RNA提取试剂盒，使用硫氰酸胍盐缓冲液溶解样品，用硅胶膜核酸纯化柱净化RNA. 此种试剂盒法提取的微囊藻群体总RNA浓度较低，但DNA污染小，RNA完整性好，目的基因表达水平最高，且操作简单，可以用于从少量微囊藻群体中提取总RNA.此外，在实验初期，我们也使用了trizol法进行微囊藻群体总RNA提取，但实验结果并不理想. 本研究所采用的4种方法中，对PGTX和CTAB 2种方法机械破碎增加前后RNA产量及纯度进行了对比，结果表明，机械破碎能够显著增加RNA产量，同时，另外2种试剂盒在提取步骤中也自带对样品进行机械破碎这一步，说明机械破碎能够使细胞充分裂解，降低微囊藻群体RNA提取难度，增加提取产量，对提取RNA是非常必要的步骤. Nanodrop ND1000分光光度计测定总RNA的D260/D280和D260/D230比值，来衡量RNA纯度. 一般D260/D280的比值大约为2.0，表明RNA样品中不存在蛋白质等污染；D260/D230的比值在2.2左右，表明RNA样品中不存在酚类和糖类等污染[15]. 从实验结果可以看出，4种方法提取的微囊藻群体总RNA都不存在蛋白质等污染，但D260/D230比值都小于2.2，说明存在酚类和糖类等污染. 结合微囊藻群体的特点，我们推测，之所以所有方法的D260/D230比值都比较小，可能是因为微囊藻群体中大量胞外多糖的存在，它不仅影响细胞裂解过程，也有极少部分随RNA一起被提取出来.此外，在凝胶电泳图谱中，CTAB-bead法有明显的DNA条带，说明存在DNA污染，其他3种方法电泳图谱检测不到DNA条带，因此本研究采用了更加灵敏的qPCR方法检测4种方法提取的RNA样品中基因组DNA污染情况及基因组DNA 去除情况[11]. 同时，对去除DNA后的样品进行反转录荧光定量PCR，检测提取的RNA中Rbcl基因的表达水平，结果表明方法1 PGTX-bead法提取的RNA不仅产量高，目的基因表达水平也高；方法4 Qiagen RNeasy Mini Kit法虽然产量低，但目的基因表达水平最高；而方法3 FastRNA®Pro Blue Kit法目的基因表达水平较低. 类似不同的RNA提取方法导致目的基因表达水平不同的结果在其他微生物RNA提取过程中也有相关报道[16,33-34]. 由此可见，选择合适、统一的RNA提取方法对系统研究微生物的功能的重要性.4 结论本研究的4种方法，都能够从微囊藻群体中提取到RNA. 方法1提取量高、纯度好、成本低，且适合大量提取，是最适合从微囊藻群体中提取RNA的方法. 方法2适合于需要同时提取DNA和RNA的样本. 方法4是试剂盒提取法，成本高、产量低，但RNA质量较好，且操作简单、耗时短，所检测目的基因的相对表达量高，可用于从少量的微囊藻群体中提取总RNA. 由于不同提取方法可能导致目的基因相对表达水平的不同，因此，在同批生物样本的研究中，建议选择统一的RNA提取方法，以减少方法的偏好性带来的误差.5 参考文献【相关文献】[1] Kong FX, Gao G. Hypothesis on cyanobacteria bloom-forming mechanism in large shallow eutrophic lakes. Acta Ecologica Sinica, 2005, 25(3): 589-595. [孔繁翔, 高光. 大型浅水富营养化湖泊中蓝藻水华形成机理的思考. 生态学报, 2005, 25(3): 589-595.][2] Jiang JL, Song R, Ren JH et al. Advances in pollution of cyanobacterial blooms-producing microcystins and their ecotoxicological effects on aquatic organisms. Progress in Chemistry, 2011, 23(1): 246-253. [姜锦林, 宋睿, 任静华等. 蓝藻水华衍生的微囊藻毒素污染及其对水生生物的生态毒理学研究. 化学进展, 2011, 23(1): 246-253.][3] Gan N, Xiao L, Zhu L et al. The role of microcystins in maintaining colonies of bloom-forming Microcystis spp.. Environmental Microbiology, 2012, 14(3): 730-742.[4] Zhao XX. Thephytoplankton community dynamics and driving factor during bloom period in Taihu Lake[Dissertation]. Hefei: Anhui University, 2013. [赵秀侠. 太湖蓝藻水华形成过程中的浮游植物群落动态及其驱动因素研究[学位论文]. 合肥：安徽大学, 2013.][5] Ma JR, Deng JM, Qin BQ et al. Progress and prospects on cyanobacteria bloom-forming mechanism in lakes. Acta Ecologica Sinica, 2013, 33(10): 3020-3030. [马健荣, 邓建明, 秦伯强等. 湖泊蓝藻水华发生机理研究进展. 生态学报, 2013, 33(10): 3020-3030.][6] Harke MJ, Gobler CJ. Global transcriptional responses of the toxic cyanobacterium, Microcystis aeruginosa, to nitrogen stress, phosphorus stress, and growth on organic matter. PLos ONE, 2013, 8(7): e69834.[7] Murillo I, Raventos D, Jaeck E et al. Isolation of total RNA and mRNA from plant tissues. Promega Notes Mag, 1995, 54: 2-7.[8] Hu GC, Honda CH, Kita MY et al. A simple protocol for RNA isolation from fruit trees containing high levels of polysaccharides and polyphenol compounds. Plant Molecular Biology Reporter, 2002, 20(1): 69a-69g.[9] Wang D, Douglas D, Kreader C et al. Anintegrated high-throughput system for mRNA purification and quantitation for use in identifying gene knockdown by RNA interference. Journal of the Association for Laboratory Automation, 2006, 11(5): 314-318.[10] Nour AM, Barbour EK, Depint F et al. Comparison of five RNA extraction methods from rabbit’s blood. Agriculture and Biology Journal of North America, 2010, 1(4): 448-450.[11] Rump LV, Asamoah B, Gonzalez-Escalona N. Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells. BMC Research Notes, 2010, 3(1): 211.[12] Reynolds C, Jaworski G, Cmiech H et al. On the annual cycle of the blue-green alga Microcystis aeruginosa Kutz. emend. Elenkin. Philosophical Transactions of the Royal Society of London, 1981, 293(1068): 419-477.[13] Pinto F, Thapper A, Sontheim W et al. Analysis of current and alternative phenol based RNA extraction methodologies for cyanobacteria. BMC Molecular Biology, 2009, 10(1): 1-8.[14] Singh S, Sinha R, Daiker V et al. Quantitative and qualitative extraction of RNA from a filamentous cyanobacterium anabaena variabilis PCC 7937. Journal of Applied Phycology, 2010, 22(1): 113-116.[15] Wang L, Stegemann J. Extraction of high quality RNA from polysaccharide matrices using cetyltrimethylammonium bromide. Biomaterials, 2010, 31(7): 1612-1618.[16] Franca A, Melo L, Cerca N. Comparison of RNA extraction methods from biofilm samples of Staphylococcus epidermidis. BMC Research Notes, 2011, 4(1): 572.[17] Allen M, Stanier R. Selective isolation of blue-green algae from water and soil. Journal of General Microbiology, 1968, 51(2): 203-209.[18] Qian H, Yu S, Sun Z et al. Effects of copper sulfate, hydrogen peroxide and N-phenyl-2-naphthylamine on oxidative stress and the expression of genes involved photosynthesis and microcystin disposition in Microcystis aeruginosa. Aquatic Toxicology, 2010, 99(3): 405-412.[19] Rinta-Kanto J, Ouellette A, Boyer G et al. Quantification of toxic Microcystis spp. during the 2003 and 2004 blooms in western Lake Erie using quantitative real-time PCR. Environmental Science & Technology, 2005, 39(11): 4198-4205.[20] Ren XX, Jiang H, Leng X et al. Ecological significance and industrial application of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Chinese Journal of Ecology, 2013, 32(3): 762-771. [任欣欣, 姜昊, 冷欣等. 蓝藻胞外多糖的生态学意义及其工业应用. 生态学杂志, 2013,32(3): 762-771.][21] Porter RD. DNA transformation. Methods in Enzymology, 1988, 167: 703-712.[22] Wilkins T, Smart L eds. Isolation of RNA from plant tissue. In: Krieg PA ed. A laboratory guide to RNA: Isolation, analysis, and synthesis. New York: Wiley-Liss, 1996: 21-42.[23] Cardellina J, Munro M, Fuller R et al. A chemical screening strategy for the dereplication and prioritization of HIV-inhibitory aqueous natural products extracts. Journal of Natural Products, 1993, 56: 1123-1129.[24] Lau A, Siedlecki J, Anleitner J et al. Inhibition of reverse transcription activity by extracts of cultured blue-green algae. Planta Medica, 1993, 59: 148-151.[25] Cohen M, Wallis J, Campbell E et al. Transposon mutagenesis of Nostoc sp. strain ATCC 29133, a filamentous cyanobacterium with multiple cellular differentiationalternatives. Microbiology, 1994, 140: 3233-3240.[26] Neilan B. Identification and phylogenetic analysis of toxigenic cyanobacteria using a RAPD PCR. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61: 2286-2291.[27] Zhong WH, Wang W, Lin XG et al. Application of nucleic acid-based methods in the study of soil microbial diversity. Acta Pedologica Sinica, 2009, 46(2): 334-341.[28] Chomczynski P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques, 1993, 15(3): 532-537.[29] Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry, 1987, 162(1): 156-159.[30] Emmett M, Petrack B. Rapid isolation of total RNA from mammalian tissues. Analytical Biochemistry, 1988, 174(2): 658-661.[31] Yang ZJ, Gu SQ, Zhang J. Characteristics of several extraction methods on total RNA in plant tissues and strategies to problems. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2009, 37(18): 8341-8342.[32] Tan S, Yiap B. DNA, RNA, and protein extraction: The past and the present. Journal of Biomedicine & Biotechnology, 2009, 11: 1-10.[33] FrancaA, Bento J, Cerca N. Variability of RNA quality extracted from biofilms of foodborne pathogens using different kits impacts mRNA quantification by qPCR. Current Microbiology, 2012, 65(1): 54-59.[34] Carvalhais V, Delgado-Rastrollo M, Melo L et al. Controlled RNA contamination and degradation and its impact on qPCR gene expression in S. epidermidis biofilms. Journal of Microbiological Methods, 2013, 95(2): 195-200.。

适于基因芯片实验的小鼠脑组织RNA提取方法的改进

适于基因芯片实验的小鼠脑组织RNA提取方法的改进隋雷鸣;赵焕英;巩云霞;付文卓;王俐勇【摘要】目的比较Trizol与两种常用提取试剂盒对小鼠脑组织RNA提取质量的差异,并进行方法改进,以期找到适合于基因芯片的高质量组织RNA提取方法. 方法以小鼠脑组织为材料,Trizol试剂、Ambion和天根组织RNA提取试剂盒提取总RNA,并对试剂盒提取方法进行改良,检测改良前后RNA浓度、纯度和完整性以及反转录成cRNA的浓度. 结果与改良前相比,试剂盒经方法改良后提取的RNA产量均有提高;Ambion试剂盒提取的RNA纯度优于Trizol和天根试剂盒. 结论Ambion试剂盒经方法改良后RNA提取质量优于其他方法,适合于基因芯片的实验要求.【期刊名称】《山西医科大学学报》【年(卷),期】2014(045)010【总页数】4页(P992-995)【关键词】RNA提取;基因芯片;小鼠【作者】隋雷鸣;赵焕英;巩云霞;付文卓;王俐勇【作者单位】首都医科大学医学实验与测试中心,北京100069;首都医科大学医学实验与测试中心,北京100069;山东省莒县人民医院急诊科;首都医科大学医学实验与测试中心,北京100069;首都医科大学医学实验与测试中心,北京100069【正文语种】中文【中图分类】Q78目前，基因芯片在科研领域得到广泛应用，这些应用主要包括基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。

获取高质量的RNA是进行包括基因芯片、第二代高通量测序、数字化PCR、cDNA文库等很多分子生物学研究的必要前提［1-3］。

基因芯片实验对于RNA的质量要求较高，这对RNA提取在完整性和纯度方面有了更高的要求。

由于RNA非常不稳定，易被降解，RNA酶无处不在，获得高纯度且完整的RNA并不容易［4，5］。

RNA 的降解和组织内杂质的残留，会产生许多伪阴性的结果，芯片结果的可靠性大大降低，会影响实验结果甚至导致实验失败［6-9］。

传统中草药高通量测序技术 RNA-seq及lncRNA挖掘的应用策略

传统中草药高通量测序技术 RNA-seq及lncRNA挖掘的应用策略白晶;李力恒;孙尧;扈韵绮;付博【摘要】This study summarizes the basic principle ,experiment flow , data analysis and the current applica-tion situation of high-throughput sequencing in traditional Chinese medicine .Especially , this study reviews the role of high -throughput sequencing techniques played in LncRNA resources exploitation , then outlooks the future development and applications in the research field of traditional Chinese medicine .%中草药作为中国传统中医特有药物已有上千年的历史，然而对中草药资源关键生物学过程中的功能基因挖掘却刚刚起步。

lncRNA功能研究越来越引起人们的重视，结合RNA-seq技术研究中草药转录组中lncRNA功能，有望揭示中草药的生长、发育、代谢等生物学过程中的分子机制。

综述了RNA-seq高通量测序及在中草药转录组测序中的应用策略，简述了lncRNA主要生物学功能及分析方法，并对RNA-seq 技术和lncRNA生物信息学分析方法中存在的问题进行了简要讨论。

【期刊名称】《中医药信息》【年(卷),期】2014(000)002【总页数】4页(P20-23)【关键词】传统中草药;转录组;高通量测序;长非编码RNA【作者】白晶;李力恒;孙尧;扈韵绮;付博【作者单位】黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040;黑龙江省农业科学院博士后科研工作站，东北林业大学博士后科研流动站，黑龙江哈尔滨 150086; 黑龙江省农业科学院畜牧研究所，黑龙江哈尔滨 150086【正文语种】中文【中图分类】R2-03中药成分的药理学及化学研究已很成熟，但其天然活性成分的调控机理、生物合成途径的研究才刚起步。

人类精子高质量RNA提取方案的优化

人类精子高质量RNA提取方案的优化于艳;管群;张斌;闻姬;杨丽霞;菅福琴;杨伟娜;孙伟【期刊名称】《实用医学杂志》【年(卷),期】2013(29)21【摘要】目的:人类精子所含RNA极少量,且由于精子中圆形细胞存在,使得分离精子RNA具有一定的挑战性.本研究旨在优化人类精子RNA的提取方案.方法:利用40％的单层梯度液及精子洗涤液纯化精子,使用TRIzol试剂和RNeasy Mini Kit提取RNA,反转录精子RNA,以eDNA为模板扩增PRM2、c-Kit、CD45、CDH1基因来确定所提精子RNA中是否存在基因组DNA或体细胞RNA的污染.结果:利用3倍体积的40％单层梯度液及精子洗涤液可以完全去除精液中体细胞的污染,利用TRIzol试剂提取RNA比RNeasy Mini Kit更有效.结论:人类精子中含有微量RNA,此方法既经济又有效,可以提取高质量的精子RNA,为人类男性生殖的功能基因组研究奠定基础.【总页数】5页(P3589-3593)【作者】于艳;管群;张斌;闻姬;杨丽霞;菅福琴;杨伟娜;孙伟【作者单位】250001济南市,山东中医药大学第二附属医院;250001济南市,山东中医药大学第二附属医院;250001济南市,山东中医药大学第二附属医院;250001济南市,山东中医药大学第二附属医院;250001济南市,山东中医药大学第二附属医院;250001济南市,山东中医药大学第二附属医院;250001济南市,山东中医药大学第二附属医院;250001济南市,山东中医药大学第二附属医院【正文语种】中文【相关文献】1.人类精子低渗试验的机制及优化方法的研究 [J], 施云飞;汤文葳;茅拥军2.辅助生殖技术中人类精子优化技术的相关研究 [J], 尹秀玲3.人类精子库精子冷冻最佳方案的探索 [J], 刘居理;冯耀;陈伊;罗明;杨韡4.李果实高质量RNA提取方法的比较和优化 [J], 邵毅;罗云波;张京声;陈安均;朱本忠5.谷子种子高质量总RNA提取方法的优化 [J], 王金荣;许冰霞;尹美强;温银元因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

基于转录组测序鉴定雌性鸡胚性腺不对称发育相关候选基因

基于转录组测序鉴定雌性鸡胚性腺不对称发育相关候选基因韩紫燕;吴申军;鲍海港【期刊名称】《中国畜牧杂志》【年(卷),期】2024(60)3【摘要】本研究旨在通过转录组测序(RNA-seq)鉴定雌性鸡胚性腺不对称发育相关候选基因,为确定雌性鸡胚性腺不对称发育的分子机制提供参考。

随机选择6胚龄(E6)和8胚龄(E8)的雌鸡胚胎各18~24只,分离并采集其两侧性腺,每6~8个同侧同期性腺组成一个样品,匀浆后提取总RNA经质控后送商业公司进行转录组测序。

每个样品3个生物学重复。

通过基因差异表达分析,GO、KEGG信号通路分析和基因集变异分析(GSVA),筛选雌性鸡胚性腺不对称发育相关候选基因和生物学通路。

经实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对筛选出的差异表达基因进行验证。

转录组差异表达分析结果显示雌性鸡胚左右两侧性腺在E6和E8分别存在195个和315个差异表达基因。

GO功能富集和KEGG信号通路富集分析发现两侧性腺差异表达基因主要富集在卵子发生、细胞发育、piRNA代谢过程等生物学过程并筛选出Pou5f3、STK31、DMRTB1等与鸡胚性腺不对称发育相关的功能基因。

本研究为进一步研究雌性鸡胚性腺不对称发育的分子调控机制提供了参考。

【总页数】7页(P149-155)【作者】韩紫燕;吴申军;鲍海港【作者单位】中国农业大学动物科学技术学院【正文语种】中文【中图分类】S831.2【相关文献】1.基于转录组测序数据的山羊下丘脑组织繁殖相关信号通路及候选基因的筛选2.基于转录组测序鉴定猪肌内脂肪沉积相关生物学通路及候选基因3.基于转录组测序挖掘广西麻鸡生长发育相关基因4.基于转录组测序与定量PCR技术挖掘北沙柳株型相关候选基因5.基于转录组测序挖掘雌性鸡胚性腺不对称发育中的重要lncRNA 及其靶基因因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

rna测序方法

rna测序方法根据所用测序方法的不同，可将rna测序分为变性测序(denaturing dnase)、基于真核表达序列的直接测序(direct rnase)、无校正测序(no-corrected rnase)和校正测序(corrected rnase)。

非变性测序(nc)是指在测序过程中待测样品不被降解，即样品处于生物学活性状态，包括杂交瘤、转染实验等。

nc测序反应一般包括四个步骤：变性、退火、扩增和测序。

通常使用3种技术对基因进行测序：基于snp的单碱基测序(snps)、基于扩增产物的一步测序(dda)、反向遗传学(rmg)以及基于snps的dda。

nc测序主要用于疾病基因组的检测，其优点在于测序精度高，灵敏度好，基因组序列信息能够被准确地分析和解释;缺点是测序时间长，成本高。

目前最常用的变性技术有：变性凝胶电泳(denaturing gel electrophoresis， dglp)、溴化乙锭沉淀(acetyl bromide precipitation， eb)、硼氢化钠(hydride， nab)变性梯度凝胶电泳(acetyl bromide-thapsigargin gel electrophoresis， ebdglp)、硼氢化钠变性梯度凝胶电泳(hydride-ortho-bromide gel electrophoresis， nabedglp)、甲醛和戊二醛(formalin-formaldehyde， formalas)。

dnase的技术关键在于标记，标记方法包括测序后测序仪分析(sequenced-afterse analysis，loath)、 pcr反应前的分析(pre-pcr， pre)、 PCR反应前的分析(pre-PCR， pre-pcr)、 PCR反应后的分析(post-PCR， post-PCR)、PCR反应前后的分析(pre-PCR， post-PCR， post-PCR)以及常见的高密度微球(macrocone， gm)技术(gelatine gel electrophoresis)。

观赏海棠不同组织中RNA的几种提取方法

观赏海棠不同组织中RNA的几种提取方法刘艳娜;李育奇;宋婷婷;于凤鸣【期刊名称】《北京农学院学报》【年(卷),期】2012(27)4【摘要】CTAB method, Guanidine thiocyanate method and Tris— borate method were employed to isolate total RNA from different organizationsof Malus crabapple. The quality and quantity of RNA were compared among the three methods. The results showed that RNA extracted by Guanidine Thiocyanate method had good quality and high purity, and the CTAB method had low expense, while Tris-borate method was not fit for RNA extraction from the fruits with polyphenols and polysaccharides organizations.%以观赏海棠不同组织为试材,用常用的CTAB法、异硫氰酸胍法及Tris-硼酸法,比较其提取RNA的质量和纯度.结果表明:CTAB法提取RNA成本低、RNA质量较高;异硫氰酸胍法提取RNA的质量好、纯度高、提取效率高;而Tris-硼酸法则较不适合于果实类多酚多糖组织的RNA提取.【总页数】3页(P7-9)【作者】刘艳娜;李育奇;宋婷婷;于凤鸣【作者单位】河北科技师范学院,河北066004;北京农学院,北京102206;北京农学院,北京102206;北京农学院,北京102206;河北科技师范学院,河北066004【正文语种】中文【中图分类】S661.4【相关文献】1.几种植物组织总RNA提取方法的特点及疑难对策 [J], 杨占军;谷守琴;张健2.植物组织RNA的几种提取方法 [J], 史公军;侯喜林;王彦华3.香蕉不同组织中总RNA提取方法的研究 [J], 王尉;梁国鲁;谢江辉4.核桃不同时期叶片及不同组织RNA提取方法筛选 [J], 陈浩;安瑞云;常青山;王梓;毛星夜5.喜马拉雅紫茉莉不同组织总RNA提取方法的比较分析 [J], 袁芳;王靖;王昭凤;兰小中因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

V ol. 33 No.2Jun. 2015第33卷第2期2015年6月经济林研究Nonwood Forest Research Doi:10.14067/ki.1003-8981.2015.02.011http: //收稿日期：2014-12-20基金项目：国家“十二五”农村领域科技计划课题（2013BAD14B03）。

作者简介：魏琦琦，硕士研究生。

通讯作者：张琳，副教授，博士。

E-mail ：triwoodtim918@ 引文格式：魏琦琦,冯延芝,林青,等.适于转录组测序的枣不同器官总RNA 提取方法筛选[J].经济林研究,2015,33(2):63－67.适于转录组测序的枣不同器官总RNA 提取方法筛选魏琦琦1a-c ，冯延芝2，林青1a-c ，贾宝光1a-c ，张琳1a-c（1.中南林业科技大学a.经济林育种与栽培国家林业局重点实验室；b.经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室；c.经济林培育与利用湖南省2011协同创新中心，湖南长沙 410004；2.中国林业科学研究院经济林研究开发中心，河南郑州 450003）摘要：为获得适用于转录组测序的枣花、结果枝和果实的总RNA 提取方法，以中秋酥脆枣为材料，比较分析了Ambiogen 和Autolab 2种总RNA 提取试剂盒和基于Autolab 试剂盒改良的CTAB 法的总RNA 的提取效果。

结果表明：3种方法提取RNA 的OD 260/OD 280差别不大，但用2种试剂盒提取的RNA 有降解，其中Ambiogen 试剂盒提取的花、结果枝和果实3个器官的RNA 质量浓度分别为126、284和222 ng/μL ；Autolab 试剂盒提取的RNA 质量浓度分别为307、402和266 ng/μL ；基于Autolab 试剂盒改良的CTAB 法提取的RNA 质量浓度分别为401、417和296 ng/μL 。

与2种试剂盒相比，基于Autolab 试剂盒改良的CTAB 法提取出来的RNA 完整性好、纯度和浓度高，能够满足转录组测序的要求。

关键词：中秋酥脆枣；转录组测序；RNA 提取；RNA 完整性中图分类号：S665.1 文献标志码：A 文章编号：1003—8981(2015)02—0063—05Screening of total RNA extraction methods for RNA-sequences fromdifferent organs in Ziziphus jujubaWEI Qi-qi 1a-c , FENG Yan-zhi 2, LIN Qing 1a-c , JIA Bao-guang 1a-c , ZHANG Lin 1a-c(1. a. The Key Lab of Non-wood Forest Products of State Forestry Administration; b. The Key Lab of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees of Education Ministry; c. 2011 Cooperative Innovation Center of Cultivation and Utilization for Non-Wood Forest Trees of Hunan Province, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. The Center of Research and Development for Non-wood Forest Tree, Chinese Academy ofForestry, Zhengzhou 450003, Henan, China)Abstract: In order to obtain the methods for high-quality total RNA extraction from ﬂ ower, fruit bearing branch and fruit in Ziziphus jujuba , taking Z. jujuba cv. ‘Zhongqiusucui’ as materials, and the RNA extraction effects were compared using two kinds of total RNA extraction kits (Ambiogen and Autolab) and modi ﬁ ed CTAB method based on the Autolab RNA extraction kit. The results showed that OD 260/OD 280 values of the RNA extracted by using the three RNA extraction methods had no signi ﬁ cant differences, but a part of RNAs obtained by the two RNA extraction kits were degraded. The RNA mass concentrations from ﬂ ower, fruit bearing branch and fruit were 126, 284 and 222 ng/μL by using the RNA extraction kit of Ambiogen; the RNA mass concentrations were 307, 402 and 266 ng/μL by using the RNA extraction kit of Autolab; and the RNA mass concentrations were 401, 417 and 296 ng/μL by using the modi ﬁ ed CTAB method based on the Autolab RNA extraction kit, respectively. The modi ﬁ ed CTAB method could generate high-integrity, high-concentration and high-purity RNA that could meet the request of transcriptome sequencing, compared with the two extraction kits.Key words: Ziziphus jujuba cv. ‘Zhongqiusucui’; transcriptome sequencing; RNA extraction; RNA integrity转录组测序是近年兴起的一种高通量测序技术，其测序对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，主要包括mRNA 和非编码RNA。

转录组测序技术（RNA-seq）具有成本低、定量准确、可重复性高、检测范围广和不受遗传背景限制等优点，这在转录组学的应用上具有革命性意义[1-3]。

转录组测序在cDNA文库构建时对RNA的浓度、纯度和完整性等均有较高的要求[4]。

枣Ziziphus jujuba为鼠李科Rhamnaceae枣属Ziziphus落叶灌木，是原产于我国的重要经济树种和木本粮食作物[5]。

枣树栽培历史悠久，具有重要的生态和经济价值，是当前我国果树和生态经济林产业重点发展的树种之一[6-7]。

近年来，有关枣树的研究多集中在枣的光合特性、果实性状评价以及高效栽培技术等方面[8-12]，关于其分子生物学方面的研究报道较少。

有关植物总RNA提取方法的报道较多，但不同物种或同一物种的不同品种，甚至同一品种的不同器官（组织）组成成分差别较大，同一方法未必具有通用性，因此需要根据具体的品种或器官（组织）探索适宜的RNA提取方法[13-15]。

枣不同器官（组织）中组分不同，如枣花和枣果实中含有大量的多酚、多糖和醌类等次生代谢物质，并且富含RNase，RNA极易被分离降解，给枣RNA的分离纯化带来许多困难[16]。

目前已有一些枣RNA提取方法的研究报道[17-19]，但针对适用于枣不同器官转录组测序的RNA提取方法尚未见报道。

基于此，本研究中使用了3种方法对枣花、结果枝和果实进行总RNA提取，比较了RNA的质量，为用于转录组测序的枣不同器官总RNA提取方法的建立提供了科学依据。

1 材料与方法1.1 植物材料试验品种为5年生的中秋酥脆枣，栽植于湖南衡阳中南林业科技大学枣试验基地，分别采集枣花、结果枝和果实，取样品后迅速装入灭菌的RNase-free离心管中，置于液氮中保存。

1.2 总RNA提取方法选取Ambiogen试剂盒法（方法1）、Autolab 试剂盒法（方法2）、基于Autolab试剂盒改良的CTAB法（方法3）3种方法分别对枣花、结果枝和果实进行总RNA的提取。

方法1与方法2严格按该试剂盒操作说明提取即可。

方法3在使用该试剂盒的基础上，进行如下处理：（1）研磨好的样品首先加入65 ℃预热好的CTAB裂解缓冲液，在65 ℃水浴中温浴10 min，在此期间涡旋振荡5次；（2）加入200μL的KAc（5 mol/L）、600 μL的氯仿/异戊醇（24∶1），涡旋振荡5 min，然后冰浴10 min；（3）使用标准离心机13 000～14 000 r/min 离心2 min，取450 μL上清液置于新的离心管中，加入450 μL该试剂盒中的RLT溶液，再次以同样转速离心2 min，以后步骤按试剂盒说明操作即可。

1.3 RNA质量检测用1%琼脂糖凝胶电泳初步检测RNA的质量，然后用Agilent 2100检测RNA的完整性、纯度和浓度。

1.4 mRNA纯化及文库构建、测序用NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module（NEB, E7490）富集mRNA。

以mRNA 为模板，用NEBNext mRNA Library Prep Master Mix Set for Illumina（NEB, E6110）和NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（NEB, E7500）构建上机文库。

制备好的文库用1.8%琼脂糖凝胶电泳检测文库插入片段的大小，然后用Library Quantification Kit-Illumina GA Universal（Kapa, KK4824）进行QPCR定量。