RNA-Seq项目常见问题与解答

RNA-Seq项目常见问题与解答

这两年随着测序成本的下降和转录组研究的日渐火热，RNA-seq俨然已经成为了分子生物学课题组推进项目的首选方向。在我们接触的转录组项目中，有些老师对项目分析结果存在或多或少不清楚或有疑惑的地方。那么春天来了，花儿开了，今天福利也到了，我们特意将转录组项目中常见的一些问题进行了汇总，各位老师可以按需自取哈。

1．如何判定生物学重复一致性的高低？生物学重复统计方法及公式

答：（1）皮尔逊相关系数r可以作为生物学重复相关性的评估指标，理想的生物学重复试验r2≧0.92。考虑到个体差异、取材环境、时间以及人员操作熟练程度等因素对测序数据的影响，一般r2≧0.8为可接受范围。

（2）Pearson（皮尔逊）相关系数：皮尔逊相关也称为积差相关（或积矩相关）是英国统计学家皮尔逊于20世纪提出的一种计算直线相关的方法。

2．DEG基因用Transcripts还是Unigenes？

答：DEG基因用的是Unigene。

3．transcript-id代表什么意思？为什么有的基因有多个transcript-id？

答：基因转录本id；因为可变剪切的缘故，一个基因可能有多个转录本。

4．在miRNA鉴定中，可能成为miRNA的reads是怎样计算的？哪些条件会影响到mrd值？micro RNA在不同组织有异构体的存在，是如何处理的？

答：与 Rfam， miRbase， RepBase和 Exon\Intro 序列库进行比对，获得 sRNA 注释信息，以此作为预测新的 miRNA 的基础。

miRNA的鉴定是利用miRDeep2软件进行已知及新（保守及非保守）的miRNA鉴定。miDeep2会在reads比对到基因组上的位置两端分别延伸75、15bp进行结构预测，此软件认为极可能与可能是miRNA的根据是通过mrd值来区分的，mrd>-10为可能，mrd>0为极可能；

影响mrd值的有reads在基因组上的分布和碱基结合的自由能等；

5．对于有生物学重复的项目，怎样计算差异基因？

答：两两比对使用的是R的EBseq包, 是基于负二项分布检验的方式对reads数进行差异显著性检验，重复间的比对使用的是R的DEseq包，是基于分层贝叶斯模型的原理对组合内样品进行分析。

6．外显子，内含子及基因间区各自的比例如何评估建库情况？

答：理论上，来自成熟mRNA的reads应该比对到外显子区。但是，由于基因组注释水平、可变剪切导致的内含子序列保存，以及很多RNA（比如lncRNA）就来自基因间区和内含子，因此有比对到内含子和基因间区的reads。受物种等的影响外显子所占比例不同，一般情况下外显子区域所占比例超过70%即比较理想。

7．影响组装Contig结果的因素？

答：a．物种的特异性；b．测序质量；c．测序的数据量；d．SNP的杂合率；e．组装参数的选择。

(1)、在不考虑物种特异性和测序质量的情况下，测序的数据量越大，SNP的杂合率越高，得到的短片段Contig的数目就越多。根据Trinity组装Contig的策略，将Reads构建K-mer 库，选取频数最高的K-mer，按照k-1的overlap进行延伸，用于延伸的K-mer全部从库中清掉，因此测到的reads越多，SNP的杂合率越高，延伸完后的短片段就越多。

(2)、对于组装参数的选择，是用于过滤低频数K-mer，选择的参数不同，过滤掉的K-mer 数目不同，如果过滤掉的越多，那么留下的短片段的Contig就会少。所以即使用同一个软件（Trinity）进行组装，如果不知道组装参数的时候，对于组装结果没有很大的可比性。

(3)、组装结果的好坏最主要的还是看Unigene的组装数据，包括组装出的数目和N50。一般来说，组装出的Unigene的数目在一个合理范围内（比如10W以内），N50越大，组装的结果越好。

8．转录组测序Contig 与transcript的区别？

答：转录组测序的原始数据包含了很多的reads，通过序列的拼接，具有重叠区的reads会被组装成更大的片段，称之为contig。将reads比对回contig，通过paired-end reads 能确定来自同一转录本的不同contig 以及这些contig之间的距离，将这些contig连在一起，最后得到两端不能再延长的序列，称之为Unigene。Transcript即转录本。

9．不同ID号代表的基因相同吗？不同ID号功能注释相同的，为什么？

答：不同的ID可以认为是代表不同的基因。不同的基因注释的功能相同，原因有：一是有些长的基因没有组装出完整的序列，而是分成了多个小片段，这种情况去进行注释的话会注释到同一个功能蛋白；二是基因的核酸序列不同，但是蛋白序列具有一定的相似性或者具有相似的功能区域，这些基因在比对注释用的蛋白序列时，会注释到相同的功能。

10．多个Unigene注释一样，序列长度不同，相似性较低，为什么？

答：1)首先某一基因可能比较长，但无参考基因组装出的片段即Unigene很难组装得到全长，得到的是这个基因上的大小不等的片段，在进行比对的时候就会比对到同一个基因上，因此他们的注释信息一致;

2)从序列来看Unigene基因的序列相似度不高，但是因为比对的是蛋白，所以可能他们的蛋白相似度会比较高，因此会注释到同一基因上。

11．transcript_id、gene_id、length、effective_length、expected_count、TPM、FPKM、IsoPct这几个字段的意思？

答：一个Unigene可能对应多个转录本。Transcript id：为组装转录本编号；gene_id：Unigene 编号；length：Unigene的长度；effective_length：各个转录本的平均长度；TPM：Transcripts per million，公式为：Unigene 的reads数×10^6/总reads数；FPKM即RPKM （双端Reads数目/（比对到转录本上的片段总数*转录本长度））；IsoPct：某一个转录本的表达量占相应的组装原件表达量的百分比。