7 DNA重组技术
分子生物学试题及答案(整理版)3篇
分子生物学试题及答案(整理版)第一篇：DNA结构与特性1. DNA的全称是什么？DNA的全称是脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）。
2. DNA是由哪些基本单元组成的？DNA由四种不同的碱基组成，称为腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）。
3. DNA含有一条还是两条互补的链？DNA是由两条互补的链组成的，它们以双螺旋形式交织在一起。
4. DNA的双螺旋结构是由哪些部分组成的？DNA的双螺旋结构是由磷酸基团、脱氧核糖糖基和碱基三部分组成的。
5. DNA的碱基配对方式是什么？每个碱基都能与哪些其他碱基配对？DNA的碱基配对方式是A-T、C-G，即腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，鸟嘌呤与胞嘧啶互补。
6. DNA的链方向是什么？DNA的两条链是相对方向相反的，即它们是“头对头”地排列在一起的。
7. DNA的复制方式是什么？该过程用哪种酶？DNA的复制方式是半保留复制，即每条新合成的DNA链都包含一个旧链和一个新链。
该过程用DNA聚合酶完成。
8. DNA序列编码的是什么？DNA序列编码的是生物体遗传信息的载体，包括基因和非编码区域。
9. DNA在哪些生物体中被发现？DNA存在于所有有细胞核和一些原核生物的细胞中。
10. DNA是如何被发现的？DNA是由克里克和沃森在1953年通过X射线晶体学研究得到的。
这项研究揭示了DNA的双螺旋结构，正式开启了分子生物学的新篇章。
第二篇：基因表达调控1. 什么是基因表达？基因表达是指基因信息从DNA转录为RNA，再转化为蛋白质的过程。
2. 基因表达是否受到调控？为什么？基因表达是受到调控的。
因为不同的细胞类型和不同的时期需要不同的基因表达模式来维持生命活动。
3. 给出三种调控基因表达的方式。
调控基因表达的方式有：转录水平调控、RNA后转录水平调节和转化水平调控。
4. 什么是启动子？在哪里找到它？启动子是一段DNA序列，位于转录开始位点上游，通常是几百个碱基对。
DNA重组技术
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② 工具酶
DNA重组技术中对DNA的“精雕细刻”主要用酶作 为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多 都用作工具，所以称在核酸及有关研究中像基本 工具一样不可缺少的酶类为工具酶。这类酶包括 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、末 端修饰酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。
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限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
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PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和 量要求低。因此，广泛应用于许多领域。 1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
限制性核酸内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶， 可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀； 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚 合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶； 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且 与电泳技术相结合还可以用于基因组酶切图谱的鉴定 以及法医鉴定等。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 13
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6 重组体的转化及鉴定
转化 转化过程是指将DNA重组体或质粒转到适宜的宿主细 胞中。通过这个过程，使目的基因片段得到大量扩 增、或产生需要的基因表达产物、或使宿主生物具 备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳 定遗传。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对 转化的大肠杆菌进行扩大培养使目的基因大量表达 和积累。通过对表达产物分离纯化便可获得想要的 产品。
DNA重组(DNA recombination)技术：DNA重组与鉴定-1
DNA重组（DNA recombination）技术：DNA重组与鉴定-1重组DNA是在体外用限制性内切酶，将不同来源的DNA分子进行特异地切割，获得的目的基因或DNA片段与载体重新连接，从而组成一个新的DNA杂合分子。
重组的DNA分子能够通过一定的方式进入相应的宿主细胞，在宿主细胞中进行无性增殖，获得大量的目的基因或DNA片段，此过程称基因克隆。
重组的DNA分子也能够在宿主细胞中进行表达，获得相应的蛋白质的表达。
一、DNA重组重组DNA分子的构建所需的目的基因或DNA片段可来自基因组DNA、cDNA以及人工合成的DNA片段；载体最常用的是质粒、噬菌体及逆转录病毒等；它们在限制性内切酶的作用下，可形成粘性末端或平齐末端，在DNA连接酶的作用下可连接成一个DNA 重组体。
（一）目的DNA片段与载体的连接主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体遗传性状的目的。
DNA克隆的一项关键技术就是DNA重组技术，所谓DNA重组，就是指把外源目的基因“装进”载体过程，即DNA的重新组合。
这种重新组合的DNA叫做重组体，因为是由两种不同来源的DNA组合而成，所以又称异源嵌合DNA。
载体在DNA克隆中是不可缺少的，目的基因片段与之共价连接形成重组体后，才能进入合适的宿主细胞内进行复制和扩增。
作为载体DNA分子，必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达能力，这样，外源目的基因装入该载体后，才能在载体的带动下一起复制，达到无性繁殖的目的；载体分子不宜过大，以便于DNA体外操作，同时载体DNA与宿主核酸应容易分开，便于提纯；载体上应具有两个以上的容易检测的遗传标记，以区分阳性重组分子和阴性重组分子。
选择性标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷型及形成嗜菌斑的能力等；载体应该具有多个限制性内切酶的单一切点，以便从中选出一种酶，使它在目的基因上没有切点，保持目的基因的完整性。
现代分子生物学（第3版）_课后答案-五章
第一章 绪论1， 简述孟德尔、摩尔根和沃森等人对分子生物学发展的主要贡献。
答：孟德尔的对分子生物学的发展的主要贡献在于他通过豌豆实验，发现了遗传规律、分离规律及自由组合规律；摩尔根的主要贡献在于发现染色体的遗传机制，创立染色体遗传理论，成为现代实验生物学奠基人；沃森和克里克在1953年提出DAN 反向双平行双螺旋模型。
反向双平行双螺旋模型。
2， 写出DNA 和RNA 的英文全称。
答：脱氧核糖核酸（答：脱氧核糖核酸（DNA, Deoxyribonucleic acid DNA, Deoxyribonucleic acid DNA, Deoxyribonucleic acid））， 核糖核酸（核糖核酸（RNA, Ribonucleic acid RNA, Ribonucleic acid RNA, Ribonucleic acid））3， 试述“有其父必有其子”的生物学本质。
答：其生物学本质是基因遗传。
子代的性质由遗传所得的基因决定，而基因由于遗传的作用，其基因的一半来自于父方，一般来自于母方。
自于父方，一般来自于母方。
4， 早期主要有哪些实验证实DNA 是遗传物质？写出这些实验的主要步骤。
答：一，肺炎双球菌感染实验，答：一，肺炎双球菌感染实验，11，R 型菌落粗糙，菌体无多糖荚膜，无毒，注入小鼠体内后，小鼠不死亡。
型菌落粗糙，菌体无多糖荚膜，无毒，注入小鼠体内后，小鼠不死亡。
22，S 型菌落光滑，菌体有多糖荚膜，有毒，注入到小鼠体内可以使小鼠患病死亡。
型菌落光滑，菌体有多糖荚膜，有毒，注入到小鼠体内可以使小鼠患病死亡。
33，用加热的方法杀死S 型细菌后注入到小鼠体内，小鼠不死亡；后注入到小鼠体内，小鼠不死亡；二，噬菌体侵染细菌的实验：二，噬菌体侵染细菌的实验：11，噬菌体侵染细菌的实验过程：吸附→侵入→复制→组装→释放。
，噬菌体侵染细菌的实验过程：吸附→侵入→复制→组装→释放。
2 2 2，，DNA 中P 的含量多，蛋白质中P 的含量少；蛋白质中有S 而DNA 中没有S ，所以用放射性同位素35S 标记一部分噬菌体的蛋白质，用放射性同位素32P 标记另一部分噬菌体的DNA DNA。
DNA重组技术概述
一、重组DNA技术相关概念
（一）DNA克隆 克隆（clone） 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化（cloning）,
DNA重组技术概述
路漫漫其悠远
少壮不努力，老大徒悲伤
第一节
DNA的重组
DNA Recombination
基因表达的分子生物学基础
原核细胞的基因是由成 百上千个核苷酸对组成 的。组成基因的核苷酸 序列可以分为不同区段。 在基因表达的过程中， 不同区段所起的作用并 不相同。有的区段能够 转录为相应的信使RNA， 进而指导蛋白质的合成， 也就是说能够编码蛋白 质的区段叫做编码区。 有的区段不能转录为信 使RNA，也就是说不能 编码蛋白质的区段叫做 一个典型的原核细胞基因结构示意图 非编码区。
顺序称为回文结构（palindrome）。
识别序列可以是四核苷酸、六核苷酸或 八核苷酸；产生的切口可以是粘性末端、 平头或钝性末端、配伍末端。 。
５’ ３’
５’ ３’
３’５’ ５’ ３’
３’ ５’ ５’ ３’
３’ ５’
３’ ５’
(三)目的基因
目的基因：用来扩增作研究或生产某一 种蛋白质的基因。就是在重组DNA时，人 们感兴趣的基因或DNA序列，又称目的 DNA(target DNA)。
1973年是基因工程诞生的元年。 1. 1944年Oswald T.Avery等的肺炎球菌转化证 明了DNA是遗传信息携带者。 2. 1953年James Watson和Francis Crick 两人 提出了DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质 自我复制的机制。 3. 1961-1965年,科学家破译了生物界全部64个遗 传密码,发表了划时代的遗传密码字典，提出了遗 传信息由DNA→RNA→蛋白质传递的中心法则。 4. 1970年发现了反转录酶，丰富了中心法则，为 cDNA的制备奠定了基础。
DNA体外重组技术介绍
星活性: 酶切反应条件不能满足最适 条件,导致某些酶产生第二活性.
EcoR I*
GAATTC
AATT
酶切反应体系的建立：
标准的酶切体系 1μgDNA，20μl总反应体积，1U酶，推 荐的Buffer和温度，反应1h
酶切体系组成
• 内切酶 根据实验目的选择，保存，使 用，稀释（避免失活与污染）
第五章
DNA体外重组技术
概述
一、DNA重组技术相关概念
克隆(clone) 来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细 胞
或克动 隆物 化（(c常lo被ni成ng为) 副本或拷贝）。 获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖。
DNA克隆(DNA cloning)
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传 物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然 的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我 复制能力的DNA分子。
• 大肠杆菌LacZ基因：编码半乳糖苷酶， 分解X-gal，使菌落为蓝色。
pBR322质粒：一种克隆质粒
结构：
ORI：复制起始点， 保证高拷贝自我复制。
Ampr, Tetr：
Ampr
两个抗性基因用于
Tetr
筛选阳性克隆。
Pst I, BamH I：
两个单酶切位点用于 ORI 插入目的基因
pfxBlue: 克隆质粒
质粒载体
体 酵母人工染色体
粘性载体
二、不同载体的特点与分类 （一）质粒载体 1. 质粒(plasmid)
定义: 细菌染色质以外的双链环状DNA， 能自我复制和表达其携带的遗传信息。
染色质 质粒 细菌培养
大肠杆菌
质粒扩增并表达蛋白质
DNA重组技术
第五章DNA重组技术DNA重组技术是指在体外将目的DNA片段与质粒（plasmid）等能够自主复制的载体（vector）连接形成重组DNA分子，再导入合适的受体细胞。
由于重组DNA可以在受体细胞中复制，目的DNA片段同时也可以扩增获得大量拷贝，因此这项技术也被称为分子克隆（molecluar cloning）。
与PCR技术相比，通过分子克隆得到的拷贝错误率更低，并且获得重组DNA的受体细胞可以无限传代，目的片段可以更长久的保存，并能进行筛选、突变、融合、序列分析等一系列基因操作。
此外，如果载体在插入目的基因的区域具有合适的启动子、核糖体结合位点、转录终止子等序列，目的DNA片段所含基因还有可能能在受体细胞中大量表达，获得目的蛋白或其它表达产物。
通过DNA重组技术表达的蛋白又称为重组蛋白。
目前，DNA重组技术在基础研究、基因诊断、生物制药、基因治疗等方面都得到广泛的应用。
第一节DNA重组技术的常用工具酶在DNA重组技术中，需要利用一些酶来对基因进行操作，我们可以把这些酶称为工具酶。
工具酶的用途涵盖DNA重组技术的各个方面，包括目的DNA的获得、DNA的切割、片段的连接等。
一、目的DNA获得相关工具酶在DNA重组技术中，目的DNA的获得有多种方法。
其中通过酶扩增来获得是重要的一类方法，其中需要多种工具酶。
（一）Klenow片段Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，是DNA聚合酶I通过木瓜蛋白酶部分水解得到的大片段，保留了DNA聚合酶I的5’-3’的聚合和3’-5’的核酸外切酶的活性，去除了5’-3’的核酸外切酶活性。
Klenow片段可用于在体外扩增DNA片段。
由于其具有3’-5’的核酸外切酶活性，因此可以校正聚合中可能出现的错误，具有一定的保真性。
但由于其不耐热，聚合活性弱，在体外合成DNA的效率较低，随着PCR技术的发展，Klenow片段的应用已日趋减少。
现主要用于DNA双链末端的补齐和标记操作。
分子生物学技术之DNA重组技术
书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
•
书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
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•大肠杆 菌 pSC101 质粒载体 示意图。
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•是第一个真核基因克隆载体。缺点：它是一种 严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒 的寄主细胞中提取pSC101 DNA，产量很低。
书山有路勤为径， 学海无ห้องสมุดไป่ตู้苦作舟
•
• 2、ColE1质粒载体
•第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在 1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序 列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生 具有粘性末端的小片段。
书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
•
•图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及
其酶切末端。
书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
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书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
• 松弛型复制控制的多拷贝质粒。
• 一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或 是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质 的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制， 细胞的生长也随之停止。
• 而松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每
个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到
1000~3000个，占细胞总DNA的50%左右。
书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
•
•AmpR
书山有路勤为径， 学海无涯苦作舟
•
•优点是具有较小的分子量，其长度为4 363bp。 不仅易于纯化，而且即使携带上一段6-8kb的外 源DNA片段，操作起来仍较为便利。
•具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择 记号。有较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增， 每个细胞中可累积1000~3000个拷贝，为重组体 DNA的制备提供了极大的方便。
基因重组技术
AAAA
逆转录酶
AAAA TTTT
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
SI核酸酶
（二）克隆载体的选择和构建 （三）外源基因与载体的连接
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
T4 DNA连接酶 15º C
重组体
载体自连
目的基因 自连
目录
（四）重组DNA导入受体菌
受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection)
反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基
（三）目的基因
cDNA (complementary DNA) 基因组DNA (genomic DNA)
（四）基因载体
定义
为携带目的基因，实现其无性繁殖或 表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分 子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
感染 (infection)
（五）重组体的筛选 1. 直接选择法
(1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹
又称重组DNA工艺学。
目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
（二）工具酶
限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ
逆转录酶
T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶
限制性核酸内切酶
定义 限制性核酸内切酶 (restriction 围切割双链DNA的一类内切酶。 endonuclease,
DNA重组技术
DNA重组技术不同来源的DNA分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合的过程，称为DNA重组（DNA recombination）。
重组DNA技术（recombinant DNA technology）作为分子生物学的一项重要技术得到了迅速的发展。
利用重组DNA技术对DNA分子进行剪切和重新连接，构成重组DNA分子，然后把它导入宿主细胞，进而扩增相关DNA片段，表达相关基因的产物，是进行基因功能研究的基本方法。
克隆（clone）是指由一个细胞经过无性繁殖以后形成的子代群体。
构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁殖体系，即DNA的分子克隆（molecular cloning）过程。
因此，重组DNA技术又称为分子克隆技术或基因工程技术，其具体过程大致为分、切、连、转、筛选。
即分离纯化目的质粒载体、用限制性内切酶酶切纯化的载体、酶切后的载体与靶基因片段的连接、构建质粒载体转染感受态菌、筛选阳性克隆。
载体选择载体（vector）是携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。
常用的载体是通过改造天然的细菌质粒、噬菌体和病毒等构建而成。
目前已构建成的载体主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等多种类型，亦可根据其用途不同分为克隆载体和表达载体二类。
载体的构建和选择应考虑以下几个主要的条件：①在宿主细胞中具有自主复制能力或能整合到宿主染色体上与基因组一同复制的能力；②有合适的限制性酶切位点供外源DNA片段插入，多种酶单一位点使载体在使用上具有较大的灵活性；③分子量不宜过大，以便于容纳较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数，也有利于体外重组操作。
④具有合适的筛选标记，以便区分阳性重组体和阴性重组体，常用的筛选标记有抗药性、酶基因、营养缺陷型或形成噬菌斑的能力等。
⑤配备与宿主相适应的调控元件，如启动子、增强子和前导序列等。
本试验选择高拷贝型pGEM载体系列的pGEM-3Zf(+)为基础载体，它含有Lac Z基因编码区、SP6、T7RNA聚合酶启动子和其间的多克隆区域（见图），能在离体情况下合成ssDNA或RNA由于构建DNA或RNA探针的构建。
分子生物学技术之DNA重组技术( 35张)
AmpR
优点是具有较小的分子量，其长度为4 363bp。 不仅易于纯化，而且即使携带上一段6-8kb的外 源DNA片段，操作起来仍较为便利。
具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择 记号。有较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增， 每个细胞中可累积1000~3000个拷贝，为重组体 DNA的制备提供了极大的方便。
大肠杆菌质粒载体: 1、pSC101质粒载体
• 低拷贝数严紧型复制控制的大肠杆菌质粒载 体，平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝。
• 长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及 EcoRI 、 HindIII 、 BamHI 、 SalI 、 XhoI 、 PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的 单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3 个位点插入外源基因，会导致tetr失活。
4、pUC质粒载体（包括四个部分）：
(i)来自pBR322质粒的复制起点（ori）；
(ii)氨苄青霉素抗性基因（ampr）；
(iii)大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动 子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称 为lacZ’基因；
(iv)位于lacZ ’基因中的靠近5’-端的一段多克 隆位点（MCS）区段，外源基因插入后破坏 了lacZ ’基因的功能。
5.1 基因操作的基本工具 （一）限制性核酸内切酶
能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位 点切开DNA分子。
第 一 个 核 酸 内 切 酶 EcoRI 是 Boyer 实 验 室 在 1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序 列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生 具有粘性末端的小片段。
大肠杆菌 pSC101 质粒载体 示意图。
2020-2021高中生物3配套学案：专题一第一节DN重组技术的基本工具含解析
2020-2021学年高中生物人教版选修3配套学案：专题一第一节DNA重组技术的基本工具含解析专题一基因工程〔趣味导学〕当人们的许多奇思妙想成为现实后,又有人想出了天方夜谭式的神话，能否让水稻植株也能够固定空气中的氮?能否让细菌也能够吐出蚕丝？能否让微生物也能够生产出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？想创造这些生物新品种，你认为能实现吗？〔专题概述〕本专题包括了“DNA重组技术的基本工具”“基因工程的基本操作程序”“基因工程的应用”及“蛋白质工程的崛起”，另外还在专题开始回顾了基因工程的诞生和发展历程。
教材首先讲述了基因工程的概念、基本工具，在此基础上又讲述了基因工程的基本操作程序,让我们对基因工程有了一个较完整的认识.基因工程的应用则主要从植物基因工程、动物基因工程和基因治疗等几个方面进行了阐述.这样不仅可以使我们充分了解基因工程的最新进展，更重要的是以此激发我们学习生物学的兴趣，培养科学探索精神和奉献精神。
在本专题内容中，DNA重组技术的基本工具、基因工程的基本操作程序是近年高考中经常涉及的重点内容，也是难点。
在这些知识中，往往考察用遗传学的基本知识分析生物技术的原理的能力，并对一些社会焦点和热点问题理解和分析能力，认识科学技术的发展所带来的双重影响。
〔学法指导〕本专题内容较为抽象，在学习时应注意：1．应联系前面已经学过的DNA的结构和功能、半保留复制、中心法则、遗传密码等知识，有助于理解DNA重组技术的基本工具、操作步骤及应用.2．需要认真阅读教材中的每个图解，充分发挥想象力,将抽象内容具体化。
〔专题重点〕基因工程所需的三种基本工具；基因工程的基本操作程序四个步骤；基因工程在农业和医疗等方面的应用；蛋白质工程的原理。
〔专题难点〕基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基因；利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。
第一节DNA重组技术的基本工具学习目标课程标准1．认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
基因重组技术概述
3’外切功
a.5’ a.5’→3’DNA聚合酶活性 DNA聚合酶活性 底物：单链DNA模板及带3 羟基的DNA DNA模板及带 DNA引物 底物：单链DNA模板及带3’羟基的DNA引物
聚合酶
dATP dTTP dGTP dCTP
5’ CCG 3’ GGCTATCGA5’
5’ CCGATAGCT3’ CCGATAGCT3’ 3’ GGCTATCGA5’
（5）常见容量发生星号活力的酶有： 常见容量发生星号活力的酶有：
EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、ScaI、 III、 SalI、XmnI、HinfI、BssHII、EcoRV II、
7.II型限制酶的用途 7.II型限制酶的用途 II （1）DNA重组克隆及亚克隆 DNA重组克隆及亚克隆 （2）DNA杂交与序列分析 DNA杂交与序列分析 （3）改NA
（二）关键性实验技术问世为重组DNA技术奠定基础 关键性实验技术问世为重组DNA技术奠定基础 DNA 1.DNA分子的切割与连接技术 1.DNA分子的切割与连接技术 DNA 2.载体构建和大肠杆菌转化体系的建立 2.载体构建和大肠杆菌转化体系的建立 3.Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链式反应 3.Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链式反应 Southern杂交
DNA重组技术概述 DNA重组技术概述
DNA重组技术前言 DNA重组技术前言
一、重组DNA技术的诞生 重组DNA技术的诞生 DNA （一）重组DNA技术诞生的理论基础 重组DNA技术诞生的理论基础 DNA 1.40年代明确了遗传的物质基础是DNA 1.40年代明确了遗传的物质基础是DNA 年代明确了遗传的物质基础是 肺炎链球菌
II型酶 3. II型酶 II型酶的识别 （1）II型酶的识别 识别序列一般为4 个碱基对， 识别序列一般为4-6个碱基对，通常是反转重 复顺序，具有180 的旋转对称性。 180º的旋转对称性 复顺序，具有180 的旋转对称性。 II型酶的切割功能 （2）II型酶的切割功能 平末端（ ★平末端（blunt end) 在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。 DNA同时切割 在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。
DNA重组技术
第一章DNA重组技术讨论4个问题：⏹1.什么是基因工程——基因工程的概念。
⏹2.为什么能进行基因工程——基因工程的原理和技术。
（包括3大理论和3大技术准备）⏹3.怎样进行基因工程——3大步骤（DNA体外重组，重组DNA导入宿主细胞后扩增和表达，基因工程后处理）⏹4.基因工程的应用和前景——对于医学来说即生产基因工程产品、开展基因治疗等。
第一节概述一.现代科学技术发展的特点（一）科学技术加速发展和急剧变革1.当代科学发展成指数增长趋势，全世界发表科技论文6000－8000/天，平均1篇/10.8秒问世。
2.人类科技知识在19世纪半衰期是50年，现在是3－5年（终身教育学习）。
3.1973年，Cohen Group第一次实现了细菌遗传性状的转移ter r+ne r s r→ter r ne r，导致基因工程技术诞生，至今不到30年，人类已经拥有了克隆羊、猪等等的技术，可以复制一个生命体。
（克隆羊多利1997－2003，体细胞克隆，胚胎细胞克隆）Psclol tet r Rb-3ne rs rtet rne r tet r ne r O tet r ne rCohen Group 第一次实现了细菌遗传性状转移示意图一.现代科学技术发展的特点(二)科学技术发展的综合化1.19世纪中叶，科学和技术是二者分离的，它们各有独自文化传统，它们的发展往往是脱节的。
2.科学回答“是什么”“为什么”，技术回答“做什么”“怎么做”。
当今科技发展已经密不可分，科学里包含技术，技术里体现科学。
3.当代科技发展有两种形式：一是突破，二是融合。
突破是线性的，即从研究开发新一代的科技成果取代原有一代科技成果。
融合是非线性的，即混合原有不同的科技领域，进而发展新产品，造成革命性市场，它们是互补和合作的结果。
二．基因工程的概念（一）基因（gene）：从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype），可以由于突变生成等位基因变异体（体细胞父源和母源；正常和突变基因）；从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。
DNA重组技术PPT课件
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酶的切割可以有两种方式：即粘性末端和平末端
粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端 的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G’AA|TT_C ……3’ 3’…… C_TT|AA’G …… 5’
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制 与修饰体，则以罗马数字表示，如HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
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限制性核酸内切酶的类型及特性
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸 的情况不同，分为三类：
Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型
第二类(II型)限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶.
Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。
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限制性核酸内切酶的命名法
❖ 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄 主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜 体字。
❖ 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株 用d，即Hind。
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① 质粒/载体
质粒(Plasmid)基本概念 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传 因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中， 在细菌细胞中最多。 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1K200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组 DNA的同一组酶系。
特别是在完成人类基因组测序计划后，DNA重组技术与其它技 术相结合，将为功能基因组的研究提供强大的技术支持；通 过此方法可以对单个或多个基因的功能进行研究；
结合PCR技术还可以应用于疾病诊断、合成具有商业意义的产 品，如胰岛素、干扰素等药物以及疫苗等。
重组技术制品指导原则
重组技术制品指导原则重组技术是一种用于改变DNA序列的方法，它可以在不同的生物体中移动基因片段，并将其插入到新的位置上。
这项技术在现代生物学研究和应用中发挥着重要作用，例如基因工程、药物研发和农作物改良等领域。
在进行重组技术制品的研发和应用过程中，需要遵循一些指导原则，以确保其安全性、有效性和可持续性。
重组技术制品的研发需要进行充分的前期规划和设计。
在确定研究目标和方法时，需要考虑到制品的应用领域和需求，并确保其具备实际可行性。
此外，研发过程中应充分考虑道德和法律的约束，确保符合伦理规范和法规要求。
重组技术制品的研发需要进行严格的实验设计和操作控制。
在实验设计中，需要考虑到实验样本的选择、实验条件的控制和重复实验的进行，以保证实验结果的可靠性和可重复性。
在操作控制方面，需要遵循标准的实验操作规程，确保实验过程的稳定性和安全性。
在重组技术制品的研发过程中，应注意数据的准确性和可靠性。
数据的采集和分析需要严格按照科学的方法进行，避免主观偏差和误导性结果的出现。
同时，数据的记录和保存要做到完整和可追溯，以备后续的验证和分析。
在重组技术制品的应用过程中，需要进行全面的风险评估和安全管理。
在确定应用对象和环境时，需要考虑到潜在的风险和影响，并采取相应的防护措施和管理措施。
同时，应建立健全的监测和应急机制，以及有效的风险沟通和管理机制，及时应对可能出现的问题和风险。
重组技术制品的研发和应用过程中，需要充分尊重知识产权和合作伙伴的权益。
对于已有的技术和知识，应进行合法合规的使用和引用，并尽可能避免侵权和不当竞争。
在合作伙伴关系中，要建立互信互利的合作机制，共同推动技术的创新和应用。
重组技术制品的研发和应用过程中，需要进行长期的监测和评估。
对于已经上市和应用的产品，应建立健全的监测体系，及时跟踪其安全性和有效性，并进行必要的调整和改进。
同时，应加强对新技术和新产品的评估和监测，及时发现和解决可能的问题和风险。
重组技术制品的研发和应用需要遵循一系列的指导原则，以确保其安全性、有效性和可持续性。
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(一)λ噬菌体 一 噬菌体
基因组： 基因组：
野生型含60多个基因， 野生型含 多个基因，约48.5 kb，具有 多个基因 ， 12bp的粘性末端。有溶菌和溶源性生长 的粘性末端。 的粘性末端 有溶菌和溶源性生长. 其基因可分为必需基因和非必需基因.当后者 其基因可分为必需基因和非必需基因 当后者 被外源基因取代后,不影响噬菌体的生命功能 不影响噬菌体的生命功能. 被外源基因取代后 不影响噬菌体的生命功能
限制酶的种类 内切酶类， 属DNA内切酶类，均来源于细菌，分 内切酶类 均来源于细菌， 三型 在DNA重组中用 型，该酶特点是： 重组中用II型 该酶特点是： 重组中用 有特异识别位点
限制酶的识别位点
通常是4-6个碱基对，具有回文结构序列的 个碱基对， 通常是 个碱基对 DNA片段 片段 有些限制酶识别序列为8个或 个或8个以上碱基对 有些限制酶识别序列为 个或 个以上碱基对 识别序列短，切点数多，产生的片段小； 识别序列短，切点数多，产生的片段小；反之 识别序列长，切点数少， 识别序列长，切点数少，产生的片段大 切割位点：大多数酶是错位切割， 切割位点：大多数酶是错位切割，产生粘性末 少数酶产生平端或称钝端. 端，少数酶产生平端或称钝端
噬菌体载体的插入失活
免疫功能失活型:合成阻遏蛋白功能破坏, 免疫功能失活型:合成阻遏蛋白功能破坏, 丧失溶原作用,生成清晰的噬菌斑. 丧失溶原作用,生成清晰的噬菌斑.否则形 成混浊噬菌斑. 成混浊噬菌斑. 半乳糖苷酶失活型:可用蓝白筛选法. Β-半乳糖苷酶失活型:可用蓝白筛选法.
(二)粘粒载体
又称柯斯质粒:由质粒和λ 又称柯斯质粒:由质粒和λ噬菌体改造而 成. 具有λ噬菌体的特征:溶源生长, 具有λ噬菌体的特征:溶源生长,无法形成 子代噬菌体颗粒. 子代噬菌体颗粒. 具有质粒载体特征:可复制,扩增. 具有质粒载体特征:可复制,扩增.有抗性 基因可供筛选用. 基因可供筛选用.
PBR322质粒载体 质粒载体
Байду номын сангаас
一个复制起始点（ori） 一个复制起始点（ori） 二个抗性基因（ 二个抗性基因（Ampr,Terr） 四个单一酶切位点 BamHⅠ,HindⅢ,SalⅠ,PstⅠ,） （BamHⅠ,HindⅢ,SalⅠ,PstⅠ,） 分子量小，插入6kb序列 分子量小，插入6kb序列 6kb 高拷贝数，1000高拷贝数，1000-3000
3’→5’ →
Klenow fragment： ：
DNA聚合酶 受枯草蛋白酶水解作用而产生（大 聚合酶I受枯草蛋白酶水解作用而产生（ 聚合酶 受枯草蛋白酶水解作用而产生 分子量76kD） 片段 分子量 ） 5’→3’聚合酶活性 → 聚合酶活性 3’→5’外切酶活性 校正作用 外切酶活性—校正作用 → 外切酶活性 主要作用： 主要作用： 补齐双链DNA的3’末端 补齐双链 的 末端 标记探针 克隆中， 在cDNA克隆中，合成第二链 克隆中 DNA序列分析 序列分析
具有松弛型复制子---增殖复制不可少的序列 具有松弛型复制子---增殖复制不可少的序列 --存在多个单一酶切位点-----便于外源序列插入 存在多个单一酶切位点---便于外源序列插入 具有插入失活标记-----便于筛选阳性克隆 具有插入失活标记---便于筛选阳性克隆 分子量较小---插入序列小于15kb ---插入序列小于 分子量较小---插入序列小于15kb
一限制性内切酶 restriction endonuclease
限制酶的命名： 限制酶的命名：
四个字母+罗马数字 四个字母 罗马数字 第一个字母： 第一个字母：大写 表示该菌的属名 第二、三个字母： 第二、三个字母：小写 表示该菌的种名 第四个字母：（有时无） ：（有时无 第四个字母：（有时无） 表示该菌的株名 罗马数字：酶的编号（按发现的顺序） 罗马数字：酶的编号（按发现的顺序）
λ噬菌体作为克隆载体的优点： 噬菌体作为克隆载体的优点： 噬菌体作为克隆载体的优点
感染能力强： 感染能力强： 可以在体外包装， 可以在体外包装，产生有感染性的噬 菌颗粒， 菌颗粒，每个包装颗粒都有感染大肠杆菌 的能力。 的能力。 有利于筛选阳性克隆： 有利于筛选阳性克隆： 只有一定长度（野生型的75%只有一定长度（野生型的 105%）的λ噬菌体才能包装。 λ噬菌体 噬菌体才能包装。 噬菌体 ） 噬菌体才能包装 经改造后，使非重组体λ噬菌体过小 噬菌体过小， 经改造后，使非重组体 噬菌体过小，无 法包装和感染细菌。 法包装和感染细菌。
(三) 噬菌体载体 三
phage
本质为细菌的病毒 ---能自用宿主细胞的 能自用宿主细胞的 蛋白质合成体系,进行生长和增殖. 蛋白质合成体菌体 双链噬菌体： λ噬菌体 单链噬菌体： 单链噬菌体：M13、f1 、
二 质粒的类型
接合型质粒、 接合型质粒、可移动型质粒和自传递 型质粒 严谨型质粒（stringent plasmid）、 plasmid）、 严谨型质粒（ 松弛型质粒(relaxed 松弛型质粒(relaxed plasmid) 窄宿主谱及广宿主谱质粒
DNA重组中所用质粒载体多用松弛型质粒 DNA重组中所用质粒载体多用松弛型质粒 改造而成。 改造而成。 质粒载体的特点： 质粒载体的特点：
3 T4 DNA连接酶 连接酶 T4 DNA ligase
主要作用 连接双链DNA 连接双链 形成3’， 磷酸二酯键 形成 ，5’-磷酸二酯键
4 末端脱氧核苷酰转移酶 TdT 俗称加尾酶
主要作用 将脱氧核苷酸加到DNA的3’-OH 将脱氧核苷酸加到 的 用于探针标记 或形成同聚尾的粘性末端便于连接
pBR322： (一) pBR322：
双链环状， 双链环状，长4363bp 拷贝数高（拷贝数：细菌中的分子个数） 拷贝数高（拷贝数：细菌中的分子个数） 多个单一的限制酶位点 两个抗药性基因标记： 两个抗药性基因标记：四环素抗性基因 氨苄青霉素抗性基因amp tetR 、氨苄青霉素抗性基因ampR （外 源基因插入失活） 源基因插入失活） 目前已被其它载体所取代
克隆
指由一个细胞经过无性繁殖以后形成的子代群 构建DNA DNA重组体并导入宿主细胞建立无性 体。构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性 繁殖体的过程叫做克隆化。 繁殖体的过程叫做克隆化。
重组DNA技术也叫基因工程。 重组DNA技术也叫基因工程。 DNA技术也叫基因工程
第一节 工具酶
工具酶： 工具酶： 对目的基因进行切割，合成，连接， 对目的基因进行切割，合成，连接，修 饰的酶 主要有 限制酶和修饰酶两类
pUC质粒载体结构特点: pUC质粒载体结构特点: 质粒载体结构特点
Ori---来自pBR322 Ori---来自pBR322 ---来自 ---无酶切位点 Ampr ---无酶切位点 LacZ序列---来自 序列---来自M13 LacZ序列---来自M13 多克隆位点---来自M13 ---来自 多克隆位点---来自M13 可用蓝白斑筛选
2 逆转录酶 reverse transcriptase： ：
常用的有两种：AMV逆转录酶、MMLV 常用的有两种： 逆转录酶、 逆转录酶 逆转录酶 模板： 模板：RNA 底物： 底物：dNTP 合成方向： 5’—3’ 合成方向： 外切酶活性） （ 5’—3’RNaseH外切酶活性） 外切酶活性 主要作用：合成cDN合酶 聚合酶
特点：可耐高温 特点： 5’—3’聚合酶活性 聚合酶活性 3’—5’外切酶活性 外切酶活性 主要用途： 主要用途：PCR DNA测序 测序
6 碱性磷酸酶
来源有二： 来源有二：牛，细菌 作用：去除5 作用：去除5’-磷
载体
vector
能够携带重组DNA进入宿主细胞，并在 能够携带重组 进入宿主细胞， 进入宿主细胞 其中进行复制和表达的特殊DNA序列。 序列。 其中进行复制和表达的特殊 序列 载体通常分为克隆载体和表达载体 理想的载体：具有自主复制能力； 理想的载体：具有自主复制能力；具有较 多拷贝数；有足够的容量； 多拷贝数；有足够的容量；单一特异的克 隆位点；一个或多个筛选标记； 隆位点；一个或多个筛选标记；有较高的 遗传稳定性。 遗传稳定性。
(二) pUC质粒载体系列 二 质粒载体系列
pUC18/19：由pBR质粒与 ： 质粒与M13噬菌体 噬菌体 质粒与 改建而成（二者方向相反） 改建而成（二者方向相反） 2.69kb 复制起始点：来自pBR322 复制起始点：来自
氨苄青霉素抗性基因ampR 氨苄青霉素抗性基因 大肠杆菌半乳糖苷酶基因（ 大肠杆菌半乳糖苷酶基因（Lac Z基因 ）启动 子和α肽序列 子和 肽序列 多克隆位点
二 修饰酶
分子末端进行剪切、 对DNA、RNA分子末端进行剪切、补平、 、 分子末端进行剪切 补平、 连接、 连接、化学修饰的酶
1大肠杆菌 大肠杆菌DNA聚合酶 （全酶） 聚合酶I 全酶） 大肠杆菌 聚合酶
模板 DNA 底物 dNTP Mg 2+ 合成方向 5’→3’ → 外切酶活性 5’→3’ →
λ噬菌体 取代型： 噬菌体---取代型 噬菌体 取代型：
取代型：也叫替换型。 取代型：也叫替换型。有两组反向排列的 多克隆位点. 多克隆位点. 基因组中约60%为溶菌所必须，中间 为溶菌所必须， 基因组中约 为溶菌所必须 40%为非必需，作其隆载体时可将这部 为非必需， 为非必需 分切除，插入目的基因。 分切除，插入目的基因。 常见的有EMBL系列和 常见的有 系列和Charon系列。插 系列。 系列和 系NA重组载体
常用载体
质粒 噬菌体 病毒
一 质粒
plasmid
基本特性： 基本特性：
质粒是细菌细胞内的染色体外的共价闭 合的环状DNA分子，能独立进行复制。 DNA分子 合的环状DNA分子，能独立进行复制。
可以赋予宿主细胞特定的遗传性状. 可以赋予宿主细胞特定的遗传性状. 只有在宿主细胞内才能复制. 只有在宿主细胞内才能复制.
DNA重组技术 重组技术