牦牛MYL3基因的克隆及组织表达分析

第52卷 第4期2024年4月
西北农林科技大学学报(自然科学版)
J o u r n a l o f N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y
(N a t .S c i .E d .)V o l .52N o .4
A p
r .2024网络出版时间:2023-09-18 16:01 D O I :10.13207/j .c n k i .j
n w a f u .2024.04.001网络出版地址:h t t p
s ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /61.1390.S .20230914.1712.016牦牛M Y L 3基因的克隆及组织表达分析
[收稿日期] 2023-01-12
[基金项目] 现代肉牛牦牛产业技术体系项目(C A R S -37);甘肃省基础研究创新群体项目(20J R 5R A 580
);中国农业科学院创新工程项目(25-L I H P S -01);甘肃省科技重大专项(21Z D 10N A 001,G Z G G -2021-1
);合作市牦牛种质提升及提质增效项目 [作者简介] 张梦帆(2000-),女,河北沙河人,在读硕士,主要从事动物繁殖原理与技术研究㊂E -m a i l :z m f 136********@163.c o m [通信作者] 梁春年(1973-),男,甘肃武威人,研究员,博士,主要从事动物遗传育种与繁殖研究㊂E -m a i l :c h u n n i a n 2006@163.c o m
张梦帆1,2,路建卫3,扎 老3,赵 雪4,梁春年1,
2
(1中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省牦牛繁育工程重点实验室,甘肃兰州730050;2农业农村部青藏高原畜禽遗传育种
重点实验室,甘肃兰州730050;3合作市佐盖多玛乡畜牧站,甘肃合作747000;4合作市农畜产品质量安全检测检验中心,甘肃合作747000
)[摘 要] ʌ目的ɔ研究牦牛M Y L 3基因的结构和表达特征,
探究其生物学功能及影响牦牛肌肉生长发育的机制㊂ʌ方法ɔ以美仁牦牛c D N A 为模板,P C R 扩增M Y L 3基因编码区序列(C D S ),利用M E G A 11软件构建系统进化
树,利用生物信息学软件对其编码蛋白进行分析㊂通过实时荧光定量P C R (R T -q
P C R )检测M Y L 3基因在心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏(参照)㊁睾丸㊁肌肉和脂肪组织中的相对表达量㊂ʌ结果ɔ牦牛M Y L 3基因C D S 区长600b p ,共编码199个氨基酸,存在1个碱基突变位点,位于第165位(A>T )
㊂系统进化分析结果显示,牦牛与普通牛的亲缘关系最近,与单峰驼的亲缘关系最远㊂生物信息学分析结果显示,牦牛MY L 3蛋白为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽,不存在跨膜结构,主要存在于细胞质内,有8个磷酸化位点和2个N -糖基化位点,蛋白的二级结构以α-螺旋为主,主要与调控肌肉生长发育的相关蛋白相互作用㊂R T -q P C R 结果表明,M Y L 3基因在心脏中的表达量最高,极显著高于其他组织;肌肉中次之,与除心脏外的其他组织存在极显著差异㊂ʌ结论ɔM Y L 3基因可能与牦牛心脏发育有关,
对肌肉的生长发育和肉质有一定影响㊂
[关键词] 牦牛;M Y L 3基因;
肌肉生长发育;肌肉品质[中图分类号] S 823.8+
5
[文献标志码] A
[文章编号] 1671-9387(2024)04-0001-09
C l o n i n g a n d t i s s u e e x p r e s s i o n a n a l y
s i s o f M Y L 3g
e n e i n y a k (B o s g r u n n i e n s )Z H A N G M e n g
f a n 1,2
,L U J i a n w e i 3,Z H A L a o 3,Z H A O X u e 4,L I A N G C h u n n i a n 1,2(1K e y L a b o r a t o r y o f Y a k B r e e d i n g E n g i n e e r i n g G a n s u P r o v i n c e ,L a n z h o u I n s t i t u t e o f H u s b a n d r y a
n d P h a r m a c e u t i c a l S c i e n c e s ,C h i n e s e A c a d e m y o f A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s ,L a n z h o u ,G a n s u 730050,C h i n a ;2K e y L a b o r a t o r y o f L i v e s t o c k a n d P o u l t r y G
e n e t i c s a n d B r e e d i n g o n t h e Q i n g h a i -T i b e t P l a t e a u ,M i n i s t r y o
f A
g r i c u l t u r e a n d R u r a l A f f a i r s ,L a n z
h o u ,G a n s u 730050,C h
i n a ;3A n i m a l H u s b a n d r y
S t a t i o n o f Z u o g a i d u o m a T o w n s h i p ,H e z u o ,G a n s u 747000,C h i n a ;4Q u a l i t y a n d S a f e t y I n s p e c t i o n C e n t e r o f A g
r i c u l t u r a l a n d L i v e s t o c k P r o d u c t s i n H e z u o ,H e z u o ,G a n s u 747000,C h i n a )
A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h i s s t u d y i n v e s t i g a t e d t h e s t r u c t u r e a n d e x p
r e s s i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f M Y L 3g e n e i n y a k ,a n d e x p l o r e d i t s b i o l o g i c a l f u n c t i o n a n d t h e m e c h a n i s m s a f f e c t i n g t h e g r o w t h a n d d e v e l o p
m e n t o f y a k m u s c l e s .ʌM e t h o d ɔM e i r e n y a k c D N A w a s u s e d a s t e m p l a t e ,a n d P C R a m p l i f i c a t i o n t e c h n o l o g y w
a s u s e d t o o
b t a i n t h e
c o
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e g i o n s e q u e n c e (C D S )o
f M Y L 3
g e n e o f y a k .T
h e p h y l o g e n e t
i c t r e e w a s c o n -s t r u c t e d b y M E G A 11s o f t w a r e ,a n d t h e e n c o d e d p r o t e i n w a s a n a l y z e d b y b
i o i n f o r m a t i c s s o f t w a r e .T h e r e l a -t i v e e x p r e s s i o n l e v e l s o f M Y L 3g e n e i n h e a r t ,l i v e r ,s p l e e n ,l u n g ,t e s t i s ,m u s c l e a n d a d i p
o s e t i s s u e s w e r e d e -t e c t e d b y q u a n t i t a t i v e r e a l -t i m e P C R (R T -q P C R ).ʌR e s u l t ɔT h e l e n g
t h o f t h e C D S o f M Y L 3g e n e i n y a k w a s 600b p ,e n c o d i n g 1
99a m i n o a c i d s ,a n d t h e r e w a s 1b a s e m u t a t i o n s i t e a t p o s i t i o n 165(A>T ).T h e
p h y l o g e n e t i c t r e e s h o w e d t h a t y a k h a d t h e c l o s e s t r e l a t i o n s h i p w i t h c o mm o n c a t t l e a n d t h e f a r t h e s t r e l a-t i o n s h i p w i t h C a m e l u s d r o m e d a r i u s.T h e b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s s h o w e d t h a t MY L3p r o t e i n o f y a k w a s a n u n s t a b l e h y d r o p h i l i c p r o t e i n w i t h o u t s i g n a l p e p t i d e o r t r a n s m e m b r a n e s t r u c t u r e.I t m a i n l y e x i s t e d i n t h e c y t o p l a s m w i t h8p h o s p h o r y l a t i o n s i t e s a n d2N-g l y c o s y l a t i o n s i t e s.T h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n w a s m a i n l yα-h e l i x,w h i c h i n t e r a c t e d w i t h r e l a t e d p r o t e i n s r e g u l a t i n g m u s c l e g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t.R T-q P C R r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n o f M Y L3g e n e i n h e a r t w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i n o t h e r t i s s u e s,f o l l o w e d b y m u s c l e,w h i c h h a d h i g h l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e w i t h o t h e r t i s s u e s e x c e p t t h e h e a r t.ʌC o n c l u s i o nɔM Y L3g e n e m a y b e r e l a t e d t o t h e h e a r t d e v e l o p m e n t o f y a k,a n d h a d c e r t a i n i m p a c t s o n t h e g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t o f m u s c l e a n d m e a t q u a l i t y.
K e y w o r d s:y a k;M Y L3g e n e;g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t o f m u s c l e;m u s c l e q u a l i t y
牦牛(B o s g r u n n i e n s)多集中在青藏高原,位于地球之巅的高寒之地,其能够适应低温㊁低气压㊁高海拔等恶劣环境,因此有着 高原之舟 的美称㊂牦牛是有着原始野性的珍稀动物,通常采用半放牧的方式养殖㊂牦牛肉富含硒㊁铁㊁锌等微量元素以及必需氨基酸和非必需氨基酸[1],但牦牛肌肉纤维较粗,脂肪沉积率低,肉质粗糙,且肌肉生长缓慢,这限制了牦牛肉类产品的发展㊂优化牦牛肉的品质有助于牦牛肉的推广,促进消费者接纳,同时促进青藏高原牧区的经济发展㊂
动物脂肪的生成受脂肪细胞分化㊁脂质代谢等生物学过程的共同影响[2],而动物肌肉发育也受多方面的协同作用,出生前肌纤维数量的增长是影响肌肉发育的主要因素,出生后肌纤维长度和直径增加是肌肉发育的主要动力[3]㊂肌纤维的生长发育与动物的产肉量及肉质密切相关[4]㊂
肌球蛋白(m y o s i n)是骨骼肌中重要的结构蛋白和收缩蛋白,是K u e h n e于1864年研究骨骼肌收缩时首次发现并命名的[5]㊂肌球蛋白具有三磷酸腺苷(a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e,A T P)酶活性,能够通过水解A T P来获得肌肉收缩所需的能量,所以也被称为肌球蛋白A T P酶[6]㊂肌球蛋白是由2条重链(m y o-s i n h e a v y c h a i n s,MH C)和2对轻链(m y o s i n l i g h t c h a i n s,MY L)组成的异六聚体[7-9]㊂MY L是肌节相关蛋白,参与肌肉收缩调节[10],包括2条必需轻链和2条调节轻链㊂根据MY L分离所需条件的不同,B a r t o n等[11]将其分为碱性轻链(MY L1㊁MY L3)和磷酸化轻链(MY L2)2类,碱性轻链需在高p H条件下分离,磷酸化轻链需在二硝基苯甲酸存在的条件下分离,由于M L Y2的磷酸化状态会影响MH C 头和肌动蛋白之间的相互作用,所以也被称为调节MY L[12]㊂H a i l s t o n e s等[13]证实,所有的MY L碱性轻链亚型具有不同的功能㊂
肌球蛋白轻链3(m y o s i n l i g h t c h a i n3,MY L3)基因,是动物体内编码球蛋白的基因之一㊂MY L3是W n t信号通路(w n t s i g n a l i n g p a t h w a y,W n t)㊁扩张型心脏病信号通路(d i l a t e d c a r d i o m y o-p a t h y, D C M)和转化生长因子β信号通路(t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r-b e t a,T G F-β)中的成员[14-15],这些通路参与了肌细胞和肌肉组织的形成过程㊂因此M Y L3基因在肌肉生长发育中发挥着重要作用,其主要功能是参与肌纤维形成,结合钙离子调节肌肉收缩,参与平滑肌的收缩活动[16]㊂M Y L3基因在动物心脏中的表达量通常较高,可作为心脏坏死标志物[17]㊂现有研究表明,M Y L3m R N A的下调有利于肌内脂肪(i n t r a m u s c u l a r f a t,I M F)沉积[18],据此可推测M Y L3对于提高牦牛的肌内脂肪含量有一定的意义㊂因此探究M Y L3基因对肌肉生长发育及I M F沉积产生的影响对提高牦牛肉口感和经济效益具有重要意义[19],但目前还未见该基因在牦牛上的研究㊂本研究以美仁牦牛为对象,克隆其M Y L3基因,测序后进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量P C R(q u a n t i t a t i v e r e a l-t i m e P C R,R T-q P C R)测定M Y L3基因在牦牛不同组织中的相对表达量,旨在为研究M Y L3基因在牦牛肌肉中的调控机制奠定理论基础,为牦牛的遗传育种研究提供依据㊂
1材料与方法
1.1材料
试验动物为来自于甘肃省合作市佐盖多玛乡的美仁牦牛,选取身体健康㊁状态良好的雄性牦牛3头,屠宰后采集其心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁睾丸㊁肌肉和脂肪组织,放置于液氮中,转移至实验室于-80ħ保存备用㊂
T r i z o l购于赛默飞世尔科技公司(I n v i t r o g e n);
2西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷
R N A 反转录试剂盒㊁p
M D 19-T 载体均购于宝生物工程有限公司(T a K a R a );大肠杆菌(E s c h e r i c h i a
c o i l )T r a n s 5α感受态细胞购于北京全式金生物技术股份有限公司(T r a n s G e n B i o t e c h );2ˑP o w e r T a q
P C R M a s t e r m i x ㊁琼脂糖凝胶D N A 回收试剂盒均
购于天根生化科技有限公司(T I A N G E N );S Y B R G r e e n P r o T a q H
S q P C R 酶购于艾科瑞生物工程有限公司㊂
1.2 试验方法1.
2.1 牦牛R N A 的提取及反转录 选取牦牛的
肝脏组织为材料,利用T r i z o l 法提取总R N A ,提取的R N A 利用N a n o D r o p
2000C 超微量分光光度计检测R N A 浓度,选取浓度合适的R N A 利用反转录试剂盒合成c D N A ,-20ħ保存备用㊂
1.2.2 引物的设计及合成 参考牛M Y L 3基因序
列(NM _001076501.2)以及G e n B a n k 所公布的内参基因G A P D H 序列,利用N C B I 在线工具设计上下游引物(表1)㊂引物由擎科生物技术有限公司(西安)合成㊂
表1 本试验所用引物信息
T a b l e 1 I n f o r m a t i o n o f p r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y
引物名称
P r i m e r n a m e
引物序列(5'ң3'
)P r i m e r s e q
u e n c e (5'ң3')退火温度/ħ
A n n e a l i n g t e m p
e r a t u r e 片段长度/b p
S e g m e n t l e n g
t h 用途
U s a g
e MY L 3-F MY L 3-R
A G G C T C A C C T A C C C T G T T C A G G T A G C C T G A T G G C A G T G A T
63.3851基因克隆
G e n e c l o n e
q P C R -MY L 3-F q
P C R -MY L 3-R C T T T G A C A C G T T C C T G C C C A T
G C T T C T C C A C C T C G T C T T C T G T 63.3185实时荧光定量P C R Q u a n t i t a t i v e r e a l -t i m e P C R
G A P D H -F G A P D H -R
C T T T G A C A C G T T C C T G C C C A T G C T T C T C C A C C T C G T C T T C T G T
63.3
204
实时荧光定量P C R
Q u a n t i t a t i v e r e a l -t i m e P C R
1.2.3 牦牛M Y L 3基因C D S 区的克隆 以牦牛
肝脏组织的c D N A 为模板,P C R 扩增M Y L 3基因C D S 区序列㊂P C R 反应体系(总体积25μL )
为:上下游引物(10μm o l /L )各2μL ,c D N A 3μL ,2ˑ
P o w e r T a q P
C R M a s t e r m i x 12.5μL ,以R N a s e -f r e e d d H 2O 补足25μL ㊂P C R 扩增程序:95ħ预变性3m i n ;95ħ变性30s ,63.3ħ退火30s ,72ħ延
伸3m i n ,35个循环;72ħ延伸10m i n ,4ħ保存㊂对扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳㊂
选取电泳条带正确清晰㊁特异性良好的样品切
胶回收产物,使用连接酶与p M D 19-T 载体连接过夜,转染至大肠杆菌(E s c h e r i c h i a c o i l )T r a n s 5α感
受态细胞,均匀涂布于氨苄西林制备的L B 固体培养基上,37ħ恒温倒置培养12h 左右㊂挑取菌落振
荡培养12h 后,对菌液进行P C R 鉴定,
将阳性菌液送至擎科生物技术有限公司(西安)进行测序㊂所得序列利用M E G A 11进行拼接,B i o e d i t 对序列进行
统计㊂利用O R F F i n d e r 在线软件(h t t p
s ://w w w.n c b i .n l m.n i h .g
o v /o r f f i n d e r /)进行开放阅读框分析㊂
1.2.4 牦牛M Y L 3基因及其编码蛋白相似性比对和进化树构建 利用D N A s t a r 软件中的M e g A l i g n 程序比较牦牛M Y L 3基因编码蛋白的氨基酸序列
与其他物种的相似性㊂在M E G A 11软件中,
采用邻接法(N e i g h b o r -j o i n i n g
,N J )构建系统进化树,分析比较牦牛与部分物种的亲缘关系㊂
1.2.5 牦牛MY L 3蛋白的生物信息学分析 利用
P r o t P a r a m (h t t p s ://w w w.e x p a s y .o r g /r e s o u r c e s /p r o t p
a r a m )分析MY L 3蛋白的理化性质,利用P r o t S c a l e (h t t p s ://w e
b .e x p a s y .o r g /p
r o t s c a l e /)分析蛋白质的亲疏水性,利用N e t P h o s (h t t p
://w w w.c b s .d t u .d k /s e r v i c e s /N e t P h o s /)进行蛋白磷酸化位点和N e t N G l y c 1.0(h t t p ://w w w.c b s .d t u .d k /s e r v i c e s /N e t P h o s /)N -糖基化位点的预测,利用S i g
-n a l P -5.0(h t t p ://w w w.c b s .d t u .d k /s e r v i c e s /S i g -n a l P /)软件预测蛋白信号肽剪切位点,利用T M -HMM -2.0(h t t p
s ://s e r v i c e s .h e a l t h t e c h .d t u .d k /s e r v i c e s /T MHMM -2.0
/)分析蛋白跨膜结构,利用WO L F P S O R T (h t t p s ://w w w.g e n s c r i p
t .c o m /w o l f -p
s o r t .h t m l )预测亚细胞定位,利用S O P MA (h t t p s ://n p s a -p r a b i .i b c p .f r /c g i _b i n /n p
s a -a u t o -m a t .p l p a g e =n p s a _s o p m a .h t m l #o p
e n n e w w i n -d o w )和S W I S S -MO D E L (h t t p
://s w i s s m o d e l .e x -p a s y .o r g /w o r k s p a c e )预测蛋白质二级结构及三级结构,利用S T R I N G (h t t p s ://s t r i n g -d b .o r g
/)预测蛋白质互作网络关系㊂
1.2.6 牦牛M Y L 3基因的R T -q
P C R 检测 选用G A P D H 作为内参基因,采用R T -q
P C R 法检测M Y L 3基因在心脏㊁
肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁睾丸㊁肌肉和脂肪组织中的表达水平㊂反应体系为10μL :S Y B R
3
第4期
张梦帆,等:牦牛M Y L 3基因的克隆及组织表达分析
G r e e n P r o T a q H
S q P C R 酶5μL ,d d H 2O 3.4μL ,上下游引物(10μm o l /L )各0.4μL ,c D N A 0.8μL ㊂
P C R 扩增程序:95ħ预变性30s ;95ħ变性5s
,63.3ħ退火30s ,45个循环;95ħ5s ,65ħ60s
㊂观察荧光信号㊂每个样品3次重复㊂
1.3 数据统计分析
以肺脏组织作为参照组,采用2-ΔΔC t
方法计算
并比较M Y L 3基因在其他组织中的相对表达量㊂
采用A N O V A 进行单因素方差分析,利用G r a p h -P a d P r i m 8.0进行数据分析和制图㊂
2 结果与分析
2.1 牦牛M Y L 3基因C D S 区序列的克隆
牦牛M Y L 3基因C D S 区扩增结果如图1所示,在851b p 处出现清晰明亮的特异性条带,与预期条带长度相符㊂将扩增结果良好的样品切胶回收,与p
M D 19-T 载体连接进行克隆,得到的菌液送至擎科生物技术有限公司(西安)测序,确定牦牛M Y L 3基因C D S 区克隆成功㊂
2.2 牦牛M Y L 3基因的C D S 区序列分析
用B i o e d i t 对序列进行比对分析,结果表明,牦牛M Y L 3基因序列C D S 区长600b p (
含起始密码子A T G ),共编码199个氨基酸㊂利用N C B I 中的
序列分析工具寻找M Y L 3的开放阅读框(O R F )
,结果显示共含5个O R F 区㊂序列分析结果显示,M Y L 3基因C D S 区A ㊁C ㊁T ㊁G 的碱基含量分别为
25.17%,28.67%,30.50%和15.67%,G+C 含量
(59.17%)高于A+T 含量(40.83%)
,表明该基因C D S 区D N A 双链结构较为稳定㊂
将测序结果与G e n B a n k 中牛M Y L 3基因(G e n B a n k 登录号为:NM _001076501.2)进行比对,结果发现第165位碱基发生了A>T 突变(图2);蛋白序列比对发现,第55位氨基酸并未因突变发生变化(图3),因此推断该突变属于同义突变㊂
M.D L 2000D N A M a r k e r ;1㊁2.M Y L 3基因P C R 产物
M.D L 2000D N A M a r k e r ;1,2.P C R p r o d u c t i o n o f M Y L 3g e n e
图1 牦牛M Y L 3基因的P C R 扩增
F i g .1 P C R a m p
l i f i c a t i o n o f M Y L 3g e n e i n y a k 图2 牦牛与牛M Y L 3基因的突变位点分析
F i g .2 A n a l y
s i s o f M Y L 3g e n e m u t a t i o n s i t e s i n y a k a n d c a t t l
e 图3 牦牛与牛M Y L 3基因编码蛋白的氨基酸序列对比
F i g .3 C o m p a r i s o n o f a m i n o a c i d s e q
u e n c e s o f M Y L 3g e n e i n y a k a n d c a t t l e 2.3 牦牛M Y L 3基因及其编码蛋白相似性比对和
进化树构建2.3.1 M Y L 3基因及其编码蛋白相似性比对 利用D N A s t a r 将测序所得牦牛M Y L 3基因的核苷酸
和氨基酸序列,与G e n B a n k 数据库中牛㊁犏牛㊁美洲野牛㊁山羊㊁绵羊㊁白尾鹿㊁欧洲马鹿㊁单峰驼等8个物种的序列进行相似性比对,结果(表2)显示,牦牛与普通牛M Y L 3基因C D S 区核苷酸序列的相似性
4
西北农林科技大学学报(自然科学版)
第52卷
高达99.9%,与其他物种的相似性均大于90.0%㊂氨基酸序列相似比对结果与此类似,其中牦牛与牛㊁犏牛和美洲野牛的氨基酸序列相似性高达100.0%,说明此基因保守程度较高㊂
表2牦牛M Y L3基因核苷酸和氨基酸序列的相似性分析
T a b l e2 S i m i l a r i t y a n a l y s i s o f n u c l e o t i d e a n d a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f y a k M Y L3g e n e%
物种
S p e c i e s123456789 199.999.799.797.897.395.796.393.0 2100.099.599.597.797.195.596.292.8 3100.0100.099.396.996.595.195.691.8 4100.0100.099.697.096.895.095.792.2 597.597.595.795.398.794.896.192.2 696.596.596.596.599.094.596.293.1 797.097.095.795.396.697.597.390.5 897.097.096.195.796.196.598.792.0 993.093.093.093.093.593.095.095.0
注:1.牦牛;2.牛;3.犏牛;4.美洲野牛;5.山羊;6.绵羊;7.白尾鹿;8.欧洲马鹿;9.单峰驼㊂右上三角表示核苷酸序列相似性,左下三角表示氨基酸序列相似性㊂
N o t e:1.Y a k;2.B o s t a u r u s;3.B o s i n d i c u sˑB o s t a u r u s;4.B i s o n b i s o n b i s o n;5.C a p r a h i r c u s;6.O v i s a r i e s;7.O d o c o i l e u s v i r g i n i a m u s t e x-
a n u s;8.C e r v u s e l a p h u s;9.C a m e l u s d r o m e d a r i u s.T h e u p p e r r i g h t t r i a n g l e r e p r e s e n t s n u c l e o t i d e s e q u e n c e a c i d s i m i l a r i t y,t h e l o w e r
l e f t t r i a n g l e r e p r e s e n t s a m i n o s e q u e n c e s i m i l a r i t y. 2.3.2 M Y L3基因进化树构建结果将牦牛M Y L3基因核苷酸序列与上述8个物种的M Y L3核苷酸序列进行比对,利用M E G A11软件采用邻接法构建系统发育分析树㊂结果(图4)显示,牦牛与普通牛的亲缘关系最近,与单峰驼的亲缘关系最远
㊂
图4基于M Y L3基因序列的牦牛系统进化分析
F i g.4 P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s o f y a k b a s e d o n M Y L3g e n e s e q u e n c e
2.4牦牛MY L3蛋白的生物信息学分析
2.4.1理化性质分析由P r o t P a r a m软件预测结
果可知,牦牛MY L3蛋白分子式为
C970H1543N254O302S11,分子质量为3071u,所含氨基
酸数目及比例见表3㊂MY L3的理论等电点为
5.00,带负电残基(A s p+G l u)总数为35个,正电荷
残基(A r g+L y s)总数为26个㊂牦牛MY L3的不稳
定指数为49.17,大于40,其蛋白结构稳定性较差,
为不稳定蛋白㊂
表3牦牛MY L3蛋白中的氨基酸数量及其占比
T a b l e3 N u m b e r a n d p r o p o r t i o n o f a m i n o a c i d s i n y a k MY L3p r o t e i n
氨基酸
A m i n o a c i d s数量
N u m b e r比例/
%
P r o p o r t i o n氨基酸
A m i n o a c i d s数量
N u m b e r比例/
%
P r o p o r t i o n 丙氨酸A l a2010.1赖氨酸L y s2110.6
精氨酸A r g52.5甲硫氨酸M e t84.0
天冬酰胺A s n63.0苯丙氨酸P h e105.0
天冬氨酸A s p126.0脯氨酸P r o189.0
半胱氨酸C y s31.5丝氨酸S e r52.5
谷氨酰胺G l n73.5苏氨酸T h r115.5
谷氨酸G l u2311.6异亮氨酸I l e73.5
甘氨酸G l y31.5酪氨酸T y r31.5
组氨酸H i s71.5缬氨酸V a l94.5
5第4期张梦帆,等:牦牛M Y L3基因的克隆及组织表达分析
2.4.2亲疏水性预测预测结果(图5)显示,牦牛MY L3蛋白的疏水性值在第87㊁88位最高(2.344),在第240㊁241位最低(-0.222),亲疏水性平均值为-0.617,小于0,因此推测牦牛MY L3蛋白为亲水性蛋白㊂
2.4.3磷酸化位点和N-糖基化位点预测牦牛MY L3蛋白的磷酸化位点预测结果(图6)显示, MY L3蛋白存在8个潜在的磷酸化位点,其中包括2个丝氨酸磷酸化位点㊁5个苏氨酸磷酸化位点和1个酪氨酸磷酸化位点㊂N-糖基化位点预测显示,牦牛MY L3蛋白共存在2个N-糖基化位点,分别位于第90位与第149位
㊂
图5牦牛MY L3蛋白的亲疏水性预测
F i g.5 H y d r o p h i l i c i t y p r e d i c t i o n o f MY L3p r o t e i n i n y a
k
图6牦牛MY L3蛋白的磷酸化位点预测
F i g.6 P r e d i c t i o n o f p h o s p h o r y l a t i o n s i t e s o f MY L3p r o t e i n i n y a k
2.4.4信号肽及跨膜结构预测信号肽是新合成
多肽链中用于指导蛋白质跨膜转运的短肽序列[20]㊂
S i g n a l P-5.0预测结果表明,牦牛MY L3蛋白不存
在氨基酸的信号肽㊂T MHMM-2.0预测结果显示,
牦牛MY L3蛋白不存在跨膜结构,因此该蛋白不属
于分泌蛋白㊂
2.4.5亚细胞定位亚细胞定位发现,牦牛MY L3
蛋白主要在细胞质(39.1%)㊁细胞核(26.1%)㊁线粒
体(26.1%)内分布㊂在液泡(4.3%)和分泌细胞的
囊泡(4.3%)内也有少量分布㊂
2.4.6二级结构和三级结构预测用S O P MA和
S W I S S-MO D E L对牦牛MY L3蛋白进行二级和三
级结构预测,其中二级结构预测结果显示,MY L3蛋
白的二级结构主要由ɑ-螺旋(49.25%)㊁延伸链
(7.04%)㊁β-转角(6.03%)和无规则卷曲(37.69%)组
成㊂蛋白质三级结构预测结果显示,MY L3蛋白以
α-螺旋为主,与预测的二级结构基本一致㊂
2.4.7 互作网络预测和功能富集分析利用
S T R I N G预测牦牛MY L3蛋白的互作网络,结果见
图7
㊂
A C T C1.肌动蛋白α心肌1;MY L P F.快肌肌浆球蛋白可调节磷酸
化轻链;T N N T2.肌钙蛋白T2(心脏型);MY H.肌球蛋白重链;
MY L.肌球蛋白轻链
A C T C1.A c t i n a l p h a c a r d i a c m u s c l e1;MY L P F.M y o s i n l i g h t c h a i n,
p h o s p h o r y l a t a b l e,f a s t s k e l e t a l m u s c l e;T N N T2.T r o p o n i n
t y p e2(c a r d i a c);MY H.M y o s i n h e a v y c h a i n;
MY L.M y o s i n l i g h t c h a i n
图7牦牛MY L3蛋白互作网络预测
F i g.7 P r e d i c t i o n o f MY L3p r o t e i n i n t e r a c t i o n
n e t w o r k i n y a k
6西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷
图7显示,与MY L 3具有互作关系的蛋白有
MY L 2㊁MY L 4㊁MY L 7㊁
快肌肌浆球蛋白可调节磷酸化轻链(m y o s i n l i g h t c h a i n ,p h o s p h o r y
l a t a b l e ,f a s t s k e l e t a l m u s c l e ,MY L P F )㊁肌钙蛋白T 2(
心脏型)(t r o p o n i n t y p
e 2(c a r d i a c ),T N N T 2)㊁肌动蛋白α心肌1(a c t i n a l p
h a c a r d i a c m u s c l e 1,A C T C 1)㊁肌球蛋白重链6(m y o s i n h e a v y c
h a i n 6,MY H 6)等㊂G O 和K E G G 富集结果显示,
其与骨骼肌的生长发育调控和心肌收缩密切相关,因MY L 3蛋白富集于
A p
e l i n 信号通路上[21
],可推测其对血管收缩和扩张㊁血压和血流控制㊁心脏收缩力强弱等都有一定的影响㊂
2.5 牦牛M Y L 3基因的组织表达模式R T -q P C R 分析结果(图8)显示,M Y L 3基因在牦牛心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁睾丸㊁肌肉和脂肪组织中均有表达,其中在心脏中的表达水平最高,极显著高于其他组织(P <0.01);其次是肌肉组织,表达水平极显著高于除心脏外的其他组织(P <0.01);肝脏和脾脏中的表达水平较低
㊂
图柱上标不同小写字母表示差异显著(P <0.05
),标不同大写字母表示差异极显著(P <0.01
)D i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t e s i g
n i f i c a n t d i f f e r e n c e s (P <0.05)a n d d i f f e r e n t c a p i t a l l e t t e r s i n d i c a t e e x t r e m e l y
s i g
n i f i c a n t d i f f e r e n c e s (P <0.01)图8 牦牛M Y L 3基因的组织表达模式
F i g .8 E x p
r e s s i o n d i f f e r e n c e o f M Y L 3g e n e i n d i f f e r e n t t i s s u e s o f y a k
3 讨 论
牦牛肉富含矿物质,脂肪中含有胡萝卜素,但脂
肪的含量较低[22]
㊂与普通牛相比,牦牛的肌纤维更
粗,脂肪沉积率低,嫩度较差,因此牦牛肉口感较为
粗糙[23]
,同时牦牛肌肉生长较为缓慢,其肉质性状受多种与脂肪酸合成和代谢相关的基因调控[
24
]㊂在新疆褐牛与哈萨克牛的对比试验中,哈萨克牛
M Y L 3基因的高表达会促进肌纤维的生长,
但是会阻碍I M F 的沉积,
因而导致肉质整体较粗糙,嫩度低;而新疆褐牛M Y L 3基因的低表达不仅促进I M F 的沉积,有助于肉品嫩度的提升,而且产肉速度优于
哈萨克牛[25
]㊂因此可以推测M Y L 3的下调有助于
肌间脂肪的沉积,且对肌肉生长发育的影响较小㊂MY L 3作为能够调节肌肉生长发育的肌动蛋白,
其基因表达水平对动物肉质存在一定影响㊂L óp
e z -P e d r o u s o 等[26]
研究发现,M Y L 3与鹿肉的嫩度和
I M F 密切相关㊂X i e 等[27]
研究证明,M Y L 3是山羊
肌肉韧性的潜在分子标记㊂目前M Y L 3基因在普
通牛[5]㊁绵羊[28]㊁北京鸭[29]等动物上也有研究,但在牦牛上还鲜有报道㊂
本研究对牦牛与普通牛㊁犏牛㊁绵羊㊁非洲野牛㊁山羊等物种进行了同源性分析,牦牛与所选物种的核苷酸序列同源性均在90.0%以上㊂说明M Y L 3
基因在进化过程中高度保守,符合生物进化特征㊂此外,M Y L 3基因C D S 区序列相似性与氨基酸序列分析结果基本一致,说明M Y L 3在多个物种间高度
保守㊂这与在绵羊[30]㊁北京鸭[29]㊁布莱德黑牛[5]
等
物种上M Y L 3基因的研究结论相同㊂
本研究得到牦牛M Y L 3基因C D S 区长600
b p
,共编码199个氨基酸㊂对牦牛MY L 3蛋白进行理化性质分析发现,其分子式为
C 970H 1543N 254O 302S 11,分子质量为3071u ,理论等电点为5.00,
为不稳定蛋白,水溶性蛋白,且具有良好的亲水性,与绵羊MY L 3蛋白性质
[28,30
]相近㊂牦牛与布莱德黑牛[5]的MY L 3蛋白二级结构相同,即以α-螺旋为主,较多无规则卷曲,β-转角较少,易形成球状蛋白,且水溶性较好,符合上述试验预测的平均
亲水性强的特征[29]
㊂牦牛MY L 3蛋白中不存在信
号肽识别位点且不存在跨膜区,这与对北京鸭[29]
和绵羊[30]的研究结论相同,不属于分泌蛋白㊂
磷酸化位点预测结果表明,牦牛MY L 3蛋白存在8个潜在的磷酸化位点和2个潜在的N -糖基化位点,绵羊[30]和北京鸭[29]MY L 3蛋白也有2个潜在
的N -
糖基化位点㊂蛋白质磷酸化参与调节基因表达㊁信号转导㊁细胞分裂等多种生命活动[31]
㊂MY L
的磷酸化与肌球蛋白的活性相关,其中MY L 3蛋白
磷酸化可影响心肌的收缩[
32-34
]㊂糖基化影响蛋白质的功能[35
],但MY L 3蛋白存在的糖基化位点对于肌
球蛋白功能的影响还有待研究㊂
亚细胞定位显示,MY L 3主要位于细胞质内;
蛋白质互作网络分析显示,MY L 3与MY L 2㊁MY L 4㊁
7
第4期
张梦帆,等:牦牛M Y L 3基因的克隆及组织表达分析
MY L7㊁MY L P F㊁T N N T2㊁A C T C1㊁MY H6等蛋白存在互作关系,这些互作蛋白对心脏收缩[36-37]㊁肌纤维生长[38]与脂肪沉积[39]有一定的影响,因此推测MY L3与心肌收缩和肌肉生长发育具有一定的关联性㊂
C h e n等[40]证明,M Y L3基因在猪的背最长肌中表达,猪肌肉发育得益于M Y L3基因表达量的上调㊂M Y L3基因在小尾寒羊的心肌中表达量最高,其次为骨骼肌,在脾和卵巢组织中有少量表达,在血管㊁肺脏㊁胃㊁肝脏中均无表达[28]㊂M Y L3在肉牛的心脏和背最长肌中有较高表达,在肝脏㊁脾脏等组织中几乎不表达[5]㊂本研究结果显示,牦牛M Y L3基因在心脏中的表达量最高,其次是肌肉,在其他组织中表达量都很低,这与上述研究结果相似㊂说明M Y L3基因与心肌㊁肌肉的生长发育和肌内脂肪的沉积密切相关,推测降低M Y L3表达量可以达到丰富牦牛肌间脂肪的目的,但这还需进一步的试验验证;除此之外,还需研究M Y L3表达量下调对牦牛肌肉带来的影响㊂
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