HPLC法测定含藤黄不同外用制剂中的藤黄酸含量

2020年第4期
分
析
测
试
中药藤黄为藤黄科植物藤黄Garcinia hanburyi
Hook.f.的树脂[1]。

主产于印度、柬埔寨、泰国等地区[2]，
是一味名贵的进口药材。

其具有很强的消癥散结、化
瘀止痛的作用，常以外用法给药。

《纲目拾遗》记载其
治痈疽，止血化毒，敛金疮，亦能杀虫。

“在療病、痈
疽、烫伤、跌打损伤、金掩肿痛、换血凝结、疔肿”等方
面疗效显著，内服可做致泻剂。

然而，生藤黄有大毒，
主要毒性成分为藤黄酸、新藤黄酸等，也是其有效成
分。

现代药理研究，藤黄酸主要有抗菌、抗炎、抗病
毒、抗肿瘤等作用[3]。

藤黄酸的不良反应主要是注射
部位出现血管刺激、腹痛和恶心等[4]。

目前，为了降
低其毒性，一方面采用不同炮制方法，另一方面严格
控制生藤黄入药剂量。

然而，目前，市场上藤黄制剂
中藤黄酸的含量并不明确。

为此，本文采用高效液相
色谱（HPLC）法测定含藤黄不同制剂中藤黄酸的含
量，建立一种稳定可靠、方法和操作简单的测定藤黄
酸的含量方法，为藤黄在新药剂型研发和质量控制
奠定基础，为含藤黄不同制剂的质量控制和临床应
用提供科学资料。

王蕊a，杨大宇a，许贵军b，高宏伟c，吕邵娃a
（黑龙江中医药大学a.北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室；b.附属第二医院;c.附属第一医院,黑龙江哈尔滨150040）摘要：目的建立测定含藤黄不同外用制剂中藤黄酸的含量测定方法。

方法采用HPLC测定含藤黄外用制剂、实验室自制贴膏、藤黄酊、藤锌散等外用制剂中藤黄酸的含量，色谱柱为XB-C18（4.6mm×
250mm，5μm），流动相乙腈-0.1%磷酸水溶液（94∶6），流速1.0mL·min-1，程序可变检测波长（361nm），柱温
30℃，进样量10μL。

结果藤黄酸在0.125~0.200μg峰面积与进样量呈良好的线性关系，4种不同含藤黄外用
制剂平均回收率分别为99.97%（RSD=1.96%）、99.45%（RSD=1.07%）、98.39（RSD=1.46%）、99.68%
（RSD=0.14%）。

结论该方法简便、准确、重复性好，可用于含藤黄不同外用制剂中的质量控制。

关键词：外用制剂；含量测定;藤黄酸;高效液相色谱法
中图分类号：R917文献标识码：A
Determination of Gambogic acid in different external preparations containing Garcinia by HPLC*
WANG Rui a,YANG Da-yu a,XU Gui-jun b,GAO Hong-wei c,LV Shao-wa a
（a.Traditional Chinese Medicine Basic Medicine and Applied Research Key Laboratory of Ministry of Education;
b.The Second Affiliated Hospital;
c.The First Affiliated Hospital,Heilongjiang University
of Chinese Medicine,Harbin150040,China）
Abstract:OBJECTIVE To establish a method for the determination of gambogic acid in different external
preparations containing garcinia cambogia.METHOD HPLC was used to determine the content of gambogic acid in
hibiscus Lab-made plaster,garcinia cambogia,vinegar powder and other external preparations.The column
was18（4.6mm×250mm,5μm）-0.1%phosphoric acid aqueous solution（94∶6）,flow rate1.0mL·min-1,pro-
gram wavelength（361nm）,column temperature30°C,and injection volume10μL.RESULTS The
peak area of gambogic acid at0.125~0.200μg showed a good linear relationship with the injection volume.The av-
erage recoveries of four different Garcinia camellia preparations were99.97%（RSD=1.96%）and99.45%（RSD=
1.07%）,98.39（RSD=1.46%）,99.68%（RSD=0.14%）.CONCLUSION The method is simple,accurate and repro-
ducible,and can be used for quality control in different external preparations containing Garcinia cambogia.
Key words:external preparations；content determination；gambogic acid；high performance liquid chromatography
DOI：10.16247/ki.23-1171/tq.20200424
收稿日期：2019-12-07
基金项目：黑龙江中医药大学校校基金新药临床前研究基金项目（2018
xy04）
作者简介：王蕊（1949-），女，汉，在读硕士研究生，研究方向：为中药
新药研究与开发。

通信作者：吕邵娃（1971-），女，汉，教授，博士，研究方向：中药新剂型
及新药开发。

Sum295No.4
化学工程师
Chemical Engineer2020年第4期
2020年第4期
1材料
1.1仪器
Thermo Ultimate3000高效液相色谱仪；梅特勒AB265-S天平（Mettler-Toledo Group）；SB-5200D型超声波清洗机（200W，40kHz），R-210旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）。

1.2试药
藤黄（购于安因市振宇中药材饮片有限公司,经黑龙江中医药大学药学院生药教研室孙慧峰教授鉴定）；含藤黄外用制剂市售（批号：20180410，201805 21，20180618，20190306，20190716）；实验室自制贴膏；藤黄酸对照品（批号：wkq18031911，纯度≥98%四川省维克奇生物科技有限公司）；H3PO4（批号：2018 0110天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲醇（批号：1903071西陇科学股份有限公司）；乙腈（色谱纯河北百灵威精细材料有限公司）；水为哇哈哈水，其他试剂均为分析纯。

2方法与结果
2.1色谱条件
ULtimat XB-C18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm），流动相乙腈-0.1%H3PO4水溶液（94∶6），流速1.0mL·min-1，测波长361nm，理论板数按藤黄酸计不低于4000，与相邻峰分离度大于1.5，柱温30℃，进样量10μL。

2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液精密称取藤黄酸对照品2.002mg，置10mL棕色量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，即得藤黄酸对照品照品贮备溶液。

2.2.2含藤黄外用制剂溶液的制备取本品内容物[5]，取约2g，加硅藻土3g，研匀，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理（功率25QW，频率33kHz）30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤1mL，置10mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释置刻度，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3实验室自制贴膏溶液的制备取本品一贴剪碎，置烧杯中搅拌混匀，精密称定4g，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇45mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，旋干，加甲醇溶液定容置25mL容量瓶中，作为供试品母液，从供试品母液中精密吸取1mL，置50mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释置刻度，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.4藤黄酊[6]供试品溶液将藤黄30个研碎成粉,浸泡于95%酒精70mL中,配成略带粘稠之藤黄酊。

精密吸取藤黄酊10μL，置100mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释置刻度，摇匀，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.5藤锌散供试品溶液取藤黄细粉30g,锌氧粉70g,搅拌混匀，制成藤锌散，外用。

精密称定藤锌散0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理（功率25W，频率33kHz）30min，放冷,再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤1mL，置25mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释置刻度，摇匀，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3专属性试验
以实验室自制贴膏的阴性对照溶液在上述色谱条件下，吸取溶液10μL进样，记录色谱图，溶液色谱中在与藤黄酸保留时间相同的位置处无干扰峰。

专属性良好。

色谱图见图1。

01020
A.藤黄酸标准品
1
05101520
B.含藤黄外用制剂
1
05101520
C.实验室自制贴膏
1
王蕊等：HPLC法测定含藤黄不同外用制剂中的藤黄酸含量*25
2020年第4期
2.4线性关系考察
精密量取藤黄酸对照品，加甲醇制成浓度为0.4000mg·mL-1的储备液，逐级稀释成系列浓度的对照品溶液使浓度分别为0.2000、0.1000、0.0500、0.0250、0.0125mg·mL-1置棕色量瓶中，精密吸取上述各对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，将数据进行线性回归，以峰面积为纵坐标，以标准品浓度（mg·mL-1）为横坐标，得回归方程为y=124.43x-0.4229，相关系数R2=0.9998，结果表明藤黄酸在0.1250~0.2000μg线性范围内，线性关系良好，见图2。

2.5精密度实验
取2.2.1项下对照品溶液，进样10μL，连续进样6次，藤黄酸峰面积的RSD分别为0.12%，结果见表1。

2.6稳定性试验
取上述4种供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12h，依上述色谱条件进样10μL，计算藤黄酸的RSD为0.21%~2.35%范围内，表明4种供试品溶液在12h 内稳定性良好，结果见表2。

2.7重复性试验
取上述4种藤黄外用制剂，按2.2项下供试品制备方法制得供试品溶液（n=6），测定其中藤黄酸的RSD在1.05%~1.59%之间，表明该方法重复性良好，结果见表3。

05101520
D.藤黄酊1
05101520
E.藤锌散
1
05101520
F.实验室自制贴膏阴性对照溶液
1.藤黄酸
图1藤黄酸含量测定图Fig.1Determination of gambogic acid content
30
25
20
15
10
5
y=124.43x·0.4229
R2=0.9998
0.050.10.150.20.25
浓度/mg·mL-1
图2藤黄酸标准曲线图
Fig.2Standard curve of Gambogic acid
表1精密度考察结果
Tab.1Precision inspection results
进样次数峰面积/mAU·min-1平均值RSD/%
1 5.71 5.720.12
2 5.72
3 5.72
4 5.71
5 5.72
6 5.71
表2稳定性考察结果
Tab.2Stability inspection results
时间/h
峰面积/mAU·min-1
含藤黄
外用制剂
实验室
自制贴膏
藤黄酊藤锌散
0 2.18 3.94 6.73 2.80
2 2.18 3.87 6.71 2.80
4 2.17 3.7
5 6.71 2.79
6 2.1
7 3.77 6.71 2.81
8 2.16 3.71 6.69 2.79
12 2.10 3.73 6.69 2.69平均值 2.16 3.79 6.71 2.78 RSD/% 1.45 2.350.21 1.59
王蕊等：HPLC法测定含藤黄不同外用制剂中的藤黄酸含量* 26
2020年第4期2.8加样回收率试验
取已知含量的含藤黄外用制剂、实验室自制贴
膏、藤黄酊、藤锌散各6份，精密称定分别加入适量的对照品，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，
按照“2.1”项下色谱条件测定。

结果见表，藤黄酸的平均回收率（n =6）分别为99.97%，99.45%，98.39%，99.68%；RSD 分别为1.96%，1.07%，1.46%，0.14%。

2.9含藤黄不同外用制剂中藤黄酸的含量
取含藤黄外用制剂、实验室自制贴膏、
藤黄酊、藤锌散，
按2.2项下方法分别制备四种供试品溶液，按2.1的色谱条件测定藤黄酸的含量，
结果见表5。

3
结果与讨论
3.1
色谱条件的选择
本文考察甲醇-水、乙腈-水溶液、
乙腈-0.1%乙酸水、
乙腈-0.1%H 3PO 4水溶液作为流动相，乙腈-0.1%H 3PO 4水溶液作为流动相时分离度良好，
峰型无拖尾[6]。

当乙腈比例低于94%时，藤黄酸及其异构
体的色谱峰分离，裂开，出现肩峰，
藤黄酸没有完全分离，最终选择乙腈-0.1%H 3PO 4水溶液（94∶6）洗脱条件，藤黄酸分离度良好，峰形对称，保留时间适中，无杂峰干扰，检测结果准确，可靠。

藤黄酸的全波长扫描最大吸收波长为361nm ，该检测波长下分离
度好，其他杂峰干扰小，能满足测定要求。

3.2
稳定性考察
对藤黄酸标准品进行稳定性考察时，因藤黄酸
结构含多个酚羟基，很容易被氧化[1]，对照品放置
12h 后，发现藤黄酸不稳定，
其后出现了一个小峰，同时含量降低，所以在配制标准品时应现配现用，
以免藤黄酸在空气中暴露太久，
被氧化变质。

3.3
提取和分离方法的选择
除回流提取方法本实验还考察了另外一种提取
方法超声提取方法，结果显示回流提取法和超声提
取法含量无显著性差异，但由于供试品中含有黏稠性基质，超声提取无法除去黏稠成分，
进样时易吸附在色谱柱上，冲洗柱子不方便，对色谱柱伤害较大，所以本实验最终选择回流提取法。

3.4进样量的选择
分别考察了5、10、20、30μL 进样量，
发现20和30μL 时由于浓度过大分离度不好，
藤黄酸及其同分异构体分不开，进样量10μL 时峰易分开，没有肩峰
表3重复性试验考察结果
Tab.3Repeated test investigation results
次数峰面积/mAU ·min
-1
含藤黄外用制剂实验室自制贴膏藤黄酊藤锌散1 2.18 3.46 6.72 2.802 2.18 3.36 6.72 2.803 2.17 3.48 6.62 2.794 2.10 3.53 6.72 2.695 2.17 3.46 6.82 2.816 2.16 3.47 6.80 2.80平均值 2.16 3.46 6.73 2.78RSD/%
1.32
1.44
1.05
1.59
表4加样回收率结果Tab.4Sample recovery results
制剂名称样品中含量/mg 加入量/mg 测得量/mg 回收率/%平均回
收率/%RSD /%含藤黄外用制剂
6.87 6.7713.67100.4499.97
1.96
6.87 6.7713.78102.076.88 6.7713.459
7.056.76 6.7713.4999.406.86 6.7713.559
8.826.85 6.7713.76102.07实验室
自制
10.2010.0020.2099.9899.45 1.07
10.3010.0020.1198.1510.1010.0020.0099.0110.2010.0020.1499.4010.1010.0019.9998.9110.1010.0020.23101.24藤黄酊11.331020.8996.1298.39 1.46
11.311021.34100.2711.211021.1399.2911.231021.1098.8411.251020.9997.6911.221021.0198.13藤锌散
8.43816.3999.5399.68
0.14
8.44816.4099.538.34816.3199.648.33816.3299.888.33816.3199.768.33
8
16.3199.76
表5含藤黄不同外用制剂中藤黄酸的含量
（n =6）Tab.5Contents of gambogic acid in different external preparations containing Garcinia cambogia （n =6）
次数藤黄酸含量/mg ·g -1
含藤黄外用制剂实验室自制贴膏藤黄酊藤锌散1 6.8710.01143.35
166.882 6.8710.12144.01164.573 6.8810.11143.21163.784 6.7610.13143.29166.575 6.8610.00143.08166.656 6.8510.09143.22166.90平均数 6.8510.08143.36165.89RSD/%
0.65
0.57
0.23
0.82
王
蕊等：HPLC 法测定含藤黄不同外用制剂中的藤黄酸含量*
（下转第46页）
27
2020年第4期
现象，重现性也良好。

3.5
柱温的选择
本实验曾考察25、30℃两种柱温，柱温影响并不大，但考虑到耐用性等问题选择用30℃为柱温。

4结论
本研究以藤黄酸为指标，对藤黄的古方外用制
剂藤黄酊与藤锌散和现代医院制剂含藤黄外用制剂与实验室自制制剂的质量控制进行研究，结果表明所建立的方法简便快速，稳定可靠，
能有效控制藤黄酸的使用量，用于该制剂的质量评价，以此为藤黄外用制剂的质量控制提供了科学可靠的依据。

参考文献
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（上接第27页）
液与交联液的体积比为100∶5。

由表6可以看出，除未处理的长2产出水无法
交联外，其余两组配置的压裂液体系，在交联后都可以挑挂，但是处理后长2采出水配制的压裂液在2h
后破胶效果不佳，因此，我们对配方进行了调整，调整后配方如下：基液：瓜尔胶0.3%、助排剂0.12%、
引发剂0.06%；交联液：硼砂1.5%、过硫酸铵1.4%；基液与交联液的体积比为100:5。

继续使用处理后的长2产出水与清水配制压裂液进行对比，对比实验数据见表7。

由表6、7两组粘度实验数据分析，
可得出结果：长2油层产出水，未经处理无法交联，Ca 2+、Mg 2+处理
至1000mg ·L -1以下，可以配制压裂液，实现交联，基液粘度较清水低，交联粘度较清水高近50%，破胶后粘度较清水略高。

4结论与建议
（1）长2油层产出水利用常规的化工药剂Na 2CO 3、
NaHCO 3处理后，可以实现配制压裂液，
且交联粘度较清水更高，携砂效果更好。

（2）现场实施可在长2产出水污水处理站的水
处理系统之前添加除Ca 2+、Mg 2+的Na 2CO 3或Na 2CO 3，
在处理过程中药剂与水中钙镁离子生产沉淀，经过水处理系统的过滤器过滤后，实现除Ca 2+、Mg 2+的效果。

处理后的长2产出水，可在配液站或者压裂现场配制压裂液。

（3）该长2油层产出水配制压裂液技术，实用性强，操作简便，为我厂油层产出水的利用提供了一条新的道路，为油田的发展做出了贡献。

参考文献
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表6加药过滤后的长2采出水中Ca 2+、Mg 2+含量
Tab.6Calcium magnesium ion content in water
from long 2after dosage filter
名称
类型
基液粘度
/mPa ·s 未处理长2水99----处理后长2水1518084848178清水
21
123
75
60
54
24
交联粘度/mPa ·s 0min 30min 60min 90min 120mi 表7加药过滤后各Ca 2+、Mg 2+浓度
Tab.7Calcium magnesium ion concentration after dosage filter 药剂基液粘度/mPa ·s
交联粘度/mPa ·s
0min 30min 60min 90min 120min 长2水
1517784816027清水
21
120
75605424
应丹丹等：宝塔采油厂长2油层采出水配置压裂液技术研究46。