DNA的粗提取与鉴定

DNA的粗提取与鉴定
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【自主复习】
一、提取DNA的方法（原理）
提取生物大分子的基本思路是。

对于DNA的粗提取而言，就是要利用、等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。

1.DNA的溶解性
1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。

2）当NaCl溶液浓度低于 mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度；当NaCl 溶液浓度高于 mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度。

选择适当的盐浓度能使充分溶解(比如2mol/l 的NaCl溶液)，而使杂质，或者相反(比如0.14mol/l 的NaCl溶液)，析出，以达到分离的目的。

3）此外，DNA不溶于溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于此溶剂。

利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。

2．DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
蛋白酶能水解，但是对没有影响。

大多数蛋白质不能忍受60—80o C的高温，而DNA在以上才会变性。

洗涤剂能够瓦解，但对DNA没有影响。

3．DNA的鉴定
在条件下，DNA遇会被染成色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。

二、实验设计
1．实验材料的选取
凡是含有的生物材料都可以考虑，但是使用的生物组织，成功的可能性更大。

在下面的生物材料中选取适合的实验材料，并说出理由。

鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基的大肠杆菌
2．破碎细胞，获取含DNA的滤液
动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的，同时用搅拌，过滤后收集滤液即可。

如果实验材料是植物细胞，需要先用溶解细胞膜。

例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的和，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。

①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。

②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。

③如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响?
研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。

④此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？
可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。

3．去除滤液中的杂质
1）为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？
用的溶液溶解DNA，能除去；用低盐浓度使DNA析出，能除去。

因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。

2）方案二与方案三的原理有什么不同？
方案二是利用分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA 和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使，与DNA分离。

4．DNA的析出与鉴定
将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积、冷却的，静置，溶液中会出现，这就是粗提取的DNA。

用玻璃棒搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。

取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。

然后，向两支试管中各加入4ml的。

混合均匀后，将试管置于中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变。

三、操作提示
1）以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g ，防止。

2）加入洗涤剂后，动作要、，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。

加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要，以免，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。

3）二苯胺试剂要，否则会影响鉴定的效果。

四、案例：几种不同材料的操作过程
；鸡血静置以提高细胞悬液浓度；使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒搅拌要缓慢（细胞破裂快速搅拌）；玻棒不要碰到烧杯壁；二苯胺试剂要现用现配等。

为了提高DNA纯度，在科学实验中通常使用的洗涤剂有十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）。

【巩固练习】
1．以下是有关DNA粗提取实验的材料及过程：
A．核酸极不稳定，在较为剧烈的化学、物理因素和酶的作用下很容易降解。

在制备DNA时要加入DNA酶的抑制剂——柠檬酸钠，以除去Mg，防止DNA酶的激活。

B．核酸中的DNA和RNA在生物体内均以核蛋白的形式存在，DNA核蛋白在1 mol/L NaCl溶液中溶解度很大，但在0.14 mol/L NaCl溶液中的溶解度很低；而RNA核
蛋白溶于0.14 mol/L NaCl溶液。

C．用苯酚处理，可使蛋白质变性，且留在苯酚层内；在DNA溶液中加入2.5倍体积、浓度为95%的酒精，可将DNA分离出来；此时DNA十分黏稠，可用玻璃棒搅成
团取出。

D．DNA在强酸环境下，水解产生脱氧核糖等小分子物质，它与二苯胺酸性溶液反应，能生成蓝色化合物。

E．实验材料与器械：柠檬酸钠溶液、石英砂、0.14 mol/L NaCl溶液、1 mol/L NaCl 溶液、蒸馏水、苯酚、95%酒精、二苯胺试剂、浓硫酸、花椰菜、研钵、烧杯、
漏斗、玻璃棒、量筒、石棉网、酒精灯、吸管、试管等。

F．实验步骤：研磨的匀浆→过滤的滤液→滤液稀释6倍→离心处理的沉淀物→沉淀物再溶解→加苯酚静置后去上清液→提取出DNA→DNA鉴定。

据以上材料回答下列问题：
(1)研磨时，取10 g花椰菜，加入适量的石英砂、________ 和________ 。

(2)将滤液稀释6倍，其目的是__________________________________________ 。

(3)取沉淀物，置于2 mL 1 mol/L NaCl溶液中，使DNA核蛋白再次溶解，再加入2 mL
苯酚充分震荡后静置，待其分层后弃其上层的苯酚。

该步骤的目的是除去________ 。

(4)如何将剩余溶液中的DNA提取出来。

(5)如何证明提取物是DNA分子。

2、某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。

具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份．每份l0 g。

剪碎后分成两组，一组置于20℃、另一组置于一20℃条件下保存24h。

DNA粗提取：
第一步：将上述材料分别放人研钵中，各加入l5 mL研磨液，充分研磨。

用两层纱布过滤．取滤液备用。

第二步：先向6只小烧杯中分别注人10mL滤液，再加人20 mL体积分数为95％的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。

第三步：取6支试管，分别加入等量的2 mol／L NaCl溶液溶解上述絮状物。

DNA检测：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂。

混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅,结果如下表。

分析上述实验过程，回答下列问题：
(1)该探究性实验课题名称是。

(2)第二步中”缓缓地”搅拌，这是为了减少。

(3)根据实验结果，得出结论并分析。

①结论1：与20℃相比，相同实验材料在-20℃条件下保存，DNA的提取量较多。

结论2：。

②针对结论1．请提出合理的解释。

(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。

为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性．在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是：将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液。

然后。