p53基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定_乔录新

p53基因敲除⼩⿏的饲养繁殖及鉴定_乔录新
第29卷第1期2012年2⽉实验动物科学
LABORATORY ANIMAL SCIENCE Vol．29No．1February 2012
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研究·论著
p53基因敲除⼩⿏的饲养繁殖及鉴定
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乔录新
1
徐萌
1
柴梦⾳
1
乔欣
2
陈德喜
1
（1.⾸都医科⼤学附属北京佑安医院，北京100069）（2.⾸都医科⼤学实验动物科学部，北京100069）
摘要：⽬的为了繁育和鉴定p53基因敲除⼩⿏，将引进的杂合⼦⼩⿏进⾏饲养繁殖，杂合⼦⽤于继续保种。

⽅法
对其幼⿏剪尾提取基因组DNA ，采⽤PCR ⽅法进⾏基因型鉴定。

结果对引进⼩⿏已成功饲养和繁殖，并得到
纯合基因缺失型⼩⿏。

结论
正确的饲养、繁殖及基因鉴定⽅法对于基因敲除⼩⿏的获得和保种具有重要的意
义。

关键词：p53；基因敲除⼩⿏；PCR 中图分类号：Q95-331⽂献标识码：A
⽂章编号：1006－6179（2012）01-
0022-03收稿⽇期：2011－07－28
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基⾦项⽬：国家⾃然科学基⾦⾯上项⽬（No．30870853）
作者简介：乔录新（1985－），⼥，在读硕⼠。

主要研究⽅向：感染性疾病。

E-mail ：qiaolx2006@163．com 徐
萌（1983－），⼥，实验员。

主要研究⽅向：感染性疾病。

通信作者：陈德喜。

E-mail ：Dexi09@yahoo．com
p53基因是迄今发现与⼈类肿瘤相关性最⾼的基因之⼀，有研究显⽰，⼈类⼤约⼀半的肿瘤发⽣与p53基因异常有关，因此p53基因的相关功能成为当前肿瘤分⼦⽣物学研究的热点
［1，2］。

p53蛋⽩介
导的细胞凋亡通路是⼈类肿瘤发⽣过程中最常改变的通路。

该通路中p53蛋⽩发挥细胞周期调控和DNA 修复功能，在肿瘤调控机制中发挥着重要的作⽤
［3，4］。

⽬前对于此⽅⾯的体外研究⼤多在各种
p53基因缺失细胞中进⾏，虽然具有很好的效果，但是在模拟体内环境⽅⾯仍有不⾜，因此，我们于2007年从美国匹斯堡⼤学引进p53基因敲除⼩⿏杂合⼦，在⾸都医科⼤学实验动物部SPF 级动物实验室饲养繁殖，
经基因鉴定成功培育p53基因敲除⼩⿏，为深⼊研究肿瘤疾病提供了动物模型。

1
材料和⽅法
1.1
实验动物
美国匹斯堡⼤学医学院Charles Lopez 教授惠赠
10对p53基因敲除杂合⼦⼩⿏（p53+/－）。

该⼩⿏遗传背景为BALB /c ⼩⿏，近交系。

1.2
⼩⿏的饲养和繁殖
按照SPF 级动物饲养标准进⾏饲养，屏障环境
内温度控制在20 25?，
湿度控制在40% 70%，⼩⿏饲料、垫料和饮⽔均经过⾼温⾼压灭菌处理，实⾏⾃由采⾷和饮⽔，垫料⼀周更换两次。

因引进的⼩⿏数量有限，采⽤了1只雄⿏和1只雌⿏同居的⽅式进⾏繁殖。

母⿏孕期为19 21d ，哺乳期为18 23d 。

在幼⿏15⽇龄左右时打⽿号。

1.3⼩⿏的基因型鉴定
1.3.1
⼩⿏尾部基因组DNA 的提取：将⼩⿏尾部
组织⼩段（长约0.5 1.0cm ）
置⼊ 1.5mL
Eppendolf 管中，参照北京百泰克⽣物技术有限公司⽣产的细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒说明书抽提DNA 。

1.3.2PCR 反应及琼脂糖凝胶电泳基因型鉴定1.3.2.1
引物设计：P1：CTTGGGTGGAGAGGCTATT
C ；P2：AGGTGAGATGACAGGAGATC ；P3：ATAGGTCG
GCGGTTCAT ：ON EXON 6；P4：CCCGAGTATCTGGAA GACAG ：ON EXON 7。

1.3.2.2
PCR 反应：PCR 反应体系：下列反应物构成
30µL 的反应体系。

上游引物2µL （10µmol /mL ），下游引物2µl （10µmol /mL ），
10?PCR Buffer 3µL ，dNTP （20mmol /L ） 2.4µL ，Taqpolymerase （2u /µL ）0．2µL ，DNA 模板（Diluted Template
）2µL ，加H 2O 补⾜30µL 。

采⽤PCR 仪进⾏循环扩增：预变性，
第1期乔录新等：p53基因敲除⼩⿏的饲养繁殖及鉴定
95?3min；预扩增，94?1min，55?1min，72?1min，共3个循环；变性，94?30s；退⽕，55?30s；延伸，72?45s，共27个循环，最后再延伸5min。

1.3.
2.3电泳鉴定：分别取PCR扩增产物8µL、10?Loading Buffer1µL在含30µL/L溴化⼄锭的1.5%琼脂糖凝胶中以120V电泳后于凝胶成像仪中观察拍照。

⼩⿏尾部组织琼脂糖凝胶电泳基因型⽚断为：（野⽣型：550bp；纯合⼦：278bp；杂合⼦：
550bp，278bp）按此基因条带可以鉴别出各个基因型⼩⿏。

2结果
2.1⼩⿏的繁殖情况
P53杂合⼦母⿏成功繁殖出⼦代幼⿏。

每只母⿏妊娠期为19 21d，哺乳期为18 23d，每胎平均产4 10只幼⿏，成活率＞95%。

2.2⼩⿏的⽣长情况
幼⿏由母⿏母乳喂养，哺乳期21d左右，产后3周离乳。

⼦代纯合⼦⽼⿏的寿命较短，很快长出肿瘤（见图1），很少能够继续繁殖，⼤多死于肿瘤或者贫⾎。

图1纯合⼦基因缺失⼩⿏于右下肢巨⼤肿瘤
（2cm?2cm，箭头所指）
2.3⼩⿏基因型鉴定结果
随机选择出⽣⼤约15d的4只⼩⿏剪取尾部组织并编号1 4，将1 4号⼩⿏尾巴提取DNA，分别⽤引物P1、P2（特异性扩增替代p53功能基因）和引物P3、P4（特异性扩增p53功能基因）进⾏PCR 扩增，结果显⽰1号⼩⿏只能扩增出p53功能基因⽚段故为野⽣型⼩⿏，2 3号⼩⿏既含替代基因⼜含原有基因为杂合⼩⿏，4号只能扩增出替代基因⽚段故为纯合⼦p53基因敲除⼩⿏（图2）。

图2⼦代⼩⿏基因型鉴定部分结果
M：2000bp分⼦量标准；1 4为1 4号⼩⿏⽤P1、P2引物
扩增结果，1'-4'为1 4号⼩⿏⽤引物P3、P4扩增结果．
3讨论
p53是⼀种多功能蛋⽩，有“基因卫⼠”或者“分⼦警察”之称，主要参与细胞周期停滞、DNA修复和细胞凋亡等，其在维持机体基因稳定的各个⽅⾯起到重要作⽤。

深⼊研究p53蛋⽩在机体内部的作⽤机制，有助于明确各种肿瘤的发⽣机制，也有助于肿瘤的治疗。

⽬前国外已有采⽤p53基因敲除⼩⿏研究p53蛋⽩在机体中的作⽤机制［5 6］，曾有动物模型表明p53途径在肿瘤的化疗和放疗反应⽅⾯是⼀个重要的调节因⼦［7］。

但是国内⽬前⼤都采⽤p53基因缺失的细胞系，从细胞⽔平分析p53蛋⽩的功能，由于机体内环境相当复杂仅从细胞⽔平研究还是有缺陷的。

p53敲除⼩⿏杂合⼦引进后，饲养和繁殖⼀直严格按照SPF级动物饲养标准进⾏。

杂合⼦⼩⿏⼦代有三种表型，即野⽣型
（p53+/+），杂合⼦（p53+/－），纯合⼦（p53－/－）［8］，⼦代经基因鉴定后继续采⽤杂合⼦雌雄配对繁殖保种，纯合
⼦存活周期较短，不能进⾏正常的繁殖，多数在⼏个⽉⼤⼩出现不同部位的肿瘤、溃疡或贫⾎。

通过PCR法鉴定基因型已经⾮常成熟，且⽅法可靠应⽤⼴泛，我们拟采⽤PCR鉴定⼩⿏的基因型，为此设计了两对特异性引物，⼀对位于原有的功能基因上，⼀对位于替代基因上。

通过两次分别扩增，可以增加鉴定的可靠性。

在饲养繁殖过程中，有时出现母⿏产⼦率低的情况，这时应考虑替掉较⽼的母⿏或者互换雄性⼩⿏；还有个别母⿏有⾷⼦现象，这个可能与受到过惊吓有关。

具体原因尚未明确，有待于进⼀步研究。

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实验动物科学
29卷
参考⽂献
［1］Bykov V J ，Issaeva N ，Shilov A ，et al ．Restoration of the tumor
suppressor function to mutant p53by a lowmolecularweight compound ［J ］．NatMed ，2002，8（3）：282 288．
［2］Hollstein M ，Sidransky D ，Vogelstein B ，et al ．p53mutations in
human cancers ［J ］．Science ，1991，253（5015）：49 53．
［3］Tokino T ，Nakamura Y．The role of p532target genes in human
cancer ［J ］．Oncology /Hematology ，2000，33（1）：1 6．
［4］Vogelstein B ，Kinzler K W．P53function and dysfunction ［J ］．
Cell ，1992，70（8）：523 526．
［5］Marusyk A ，Porter C C ，Zaberezhnyy V ，et al ．Irradiation selects
for p53-deficient hematopoietic progenitors ［J ］．
PLoS Biol ，
2010，8（3）：e1000324．
［6］Tomasevic G ，Raghupathi R ，Scherbel U ，et al ．Deletion of the
p53tumor suppressor gene improves neuromotor function but does not attenuate regional neuronal cell loss following experimental brain trauma in mice ［J ］．J Neurosci Res ，2010，88（15）：3414 3423．
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response to radio-and chemotherapy in vivo is tumor-type-dependent ［J ］．Cancer Res ，2001，61（1）：327 332．［8］施新猷．现代医学实验动物学［M ］．北京：⼈民军医出版社，
2000：171．
Breeding Reproducing and Identifying for p53Gene Knockout Mice
QIAO Lu-xin 1，XU Meng 1，CHAI Meng-yin 1，QIAO Xin 2，CHEN De-xi 1
（1.Department of Infectious Diseases of Capital Medical University Affiliated Beijing Youan Hospital ，Beijing 100069，China ）
（2.Department of Laboratory Animal Science of Capital Medical University ，Beijing 100069，China ）
Abstract ：Objective To breed and identify p53gene knockout mice ，Heterozygote mice were bred and reproduced．Methods Genome DNA extracted from the mice ’s tails were subjected to PCR test for genotype identification．Results
Heterozygous were used to acquire baby mice for Protection species．Conclusion
The
breeding and reproducing were successful and Homozygous genotype mice were acquired．Appropriate methods of feeding ，breeding and identifying are important for obtaining gene knockout mice and protecting species．Key words ：
p53；gene knockout mice ；檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴毷
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PCR
动态·信息美发现提⾼⼩⿏胰岛素敏感性新法
新华社华盛顿2011年11⽉14⽇电，美国研究⼈员⽇前报告说，去除实验⿏体内的⼀种关键调控蛋⽩，
可显著提⾼其对胰岛素的敏感性。

这项研究为糖尿病治疗和药物研发提供了新途径。

美国加州⼤学圣迭⼽分校的研究⼈员在美国《细胞》杂志⽹站上报告说，他们培育了体内脂肪细胞缺少核受体辅助抑制因⼦的⼩⿏，然后⽤促使⼩⿏肥胖并易患上糖尿病的⾷物喂养。

研究⼈员发现，这类⼩⿏对⾎糖升⾼的耐受性有显著提⾼，其肝脏、肌⾁和脂肪对胰岛素的敏感性得到改善，体内的系统性炎症也有所减少。

胰岛素抵抗与慢性系统性炎症是Ⅱ型糖尿病的重要特征。

胰岛素抵抗是指机体对胰岛素的敏感性降低，其利⽤胰岛素促进葡萄糖代谢的能⼒下降。

研究⼈员表⽰，核受体辅助抑制因⼦似乎能促进⼀种调节脂肪酸存储和⾎糖代谢的常见蛋⽩质PPAR-γ磷酸化，进⽽使这种蛋⽩质失去活性。

去除⼩⿏的核受体辅助抑制因⼦后，PPAR －γ蛋⽩质就能保持活性，因⽽可以继续改善⾎糖代谢。

研究⼈员说，
这意味着核受体辅助抑制因⼦可能是较好的Ⅱ型糖尿病药物靶点。

（张树庸供稿）
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