细菌转录机制
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• 流产性转录（abortive transcription）：也称为流产性起始，是RNA聚 合酶结合启动子后在离开启动子前进入的合成很短的转录本（一般小 于10 nt）的循环。
6-26
流产性转录、蜷缩和启动子清除
• Ebert及其同事开展一系列实验来区分流产性转录的三种假说，结果和结 论如下 ：
• E.coli RNA聚合酶接近100%的流产性转录均涉及蜷缩，表明蜷缩是启动 子清除所必须的。
• E.coli RNA聚合酶通过蜷缩机制完成流产性转录：将下游DNA拉到RNA 聚合酶内部，RNA聚合酶自身不需要移动，与启动子DNA的结合也不会松 开
核心启动子元件
• Pribnow发现转录起始位点上游大约10 bp处有一个6-7 bp的共有区域： -10框（-10 box），也称为Pribnow框
• Ptashne等发现在转录起始位点上游约35 bp处有另一个共有区域：-35 框（-35 box）
• 分析了数千个启动子后，发现-10框和-35框都存在共有序列 （consensus sequence）
holoenzyme • Omega (ω) 亚基：10 kD （SDS PAGE中未
检测到，但在尿素梯度凝胶电泳中可以清楚 地检测到） • ω亚基对于细胞存活或体内RNA pol的活性不 是必需的，但可能在全酶的组装中起作用
6-5 Burgess, R. R., Travers, A. A., Dunn, J. J., & Bautz, E. K. (1969). Nature, 221(5175), 43-46.
• rrnB启动子中，UP元件在核心启动子的上游，可以被RNA聚合酶识别， 使转录效率提高30倍
• rrnB启动子中有3个Fis位点，属于增强子（enhancer），与转录激活 因子Fis蛋白的结合（与UP元件有关）， 而不与RNA聚合酶结合
6-16
6.3 转录起始
• 1980年以前，普遍认为：RNA聚合酶催化第一个磷酸二酯键形成，转录 起始阶段就结束了
6-15
rrnB P1启动子
• E.coli有7个rrn基因（rrnA, rrnB, rrnC, rrnD, rrnE, rrnG, rrnH），每个 基因都有2个启动子（P1和P2）
• rrn启动子受起始NTP（iNTP）的负调控和预警素（alarmone）鸟苷 5’-二磷酸-3’-二磷酸（ppGpp）的正调控
形成的转录泡大小为17-18 bp。
• 转录泡（transcription bubble）：在合成RNA过程中紧随着RNA聚合 酶之后的局部解链的DNA区域，一般在10~18 bp之间，转录泡越大， 解链需要的能量越多。
6-24
RNA聚合酶在早期启动子解1979). Nature, 279(5714), 651-652.
• 细菌启动子中包含的最少元件（-10框和-35框）称为细菌的核心启动 子元件（core promoter elements）
6-12
细菌核心启动子共有序列
6-13
细菌启动子基本特征元件
6-14
启动子强度
• 共有序列: • -10 box sequence approximates TATAAT • -35 box sequence approximates TTGACA
RNA聚合酶全酶与核心酶
• E. coli RNA聚合酶全酶由核心酶和σ因子组成
β'
α
α
β
核心酶 聚合酶活性
+σ
σ因子
β'
α
α σβ
全酶 正确起始转录
6-6
σ因子是一种特异性因子
• 核心酶对T4 DNA转录活性低，但对有切口的小牛胸腺DNA转录活性高 • 全酶对两种DNA的转录活性都很高
• 全酶的转录产物与天然T4 RNA相同（非对称转录，不能杂交，对 RNase A敏感），核心酶有30%的转录产物与天然T4 RNA杂交产生 RNase A抗性，证明σ因子使转录具有特异性（specificity）。
• 随后，全酶使启动子中的一小 段DNA区域解链，形成RNA与 启动子的紧密结合的开放启动 子复合物（open promoter complex ）
6-11 Hinkle, D. C., & Chamberlin, M. J. (1972). Journal of molecular biology, 70(2), 157-18
σ core
6-20
σ因子循环模型
• 强制释放（obligate release）模型：聚合酶进行启动子清除，从起始 模式转换为延伸模式时，σ因子与核心酶解离。 • 有大量证据支持强制释放模型，但有一些实验发现转录延伸后，σ 因子仍与核心酶结合
• 随机释放（stochastic release）模型：σ因子确实会与核心聚合酶解 离，但这种解离是随机的，而不存在σ因子必须解离的离散点 • 有更多的证据支持随机释放模型
• 全酶在T7 DNA上有紧密结合与 松散结合的位点，核心酶只有 松散结合位点。
6-9 Hinkle, D. C., & Chamberlin, M. J. (1972). Journal of molecular biology, 70(2), 157-18
温度对RNA聚合酶结合的影响
• 在测定的不同温度条件下：温度 越低，RNA聚合酶与DNA的结合 能力越低
σ core
6-21
荧光共振能量转移技术
• 会不会σ因子在延伸过程中只是与核心酶的结合变得更加松散，而不是解 离，而支持强制释放模型的实验由于技术原因导致σ解离？
• Ebright等通过荧光共振能量转移技术来解释这个问题 • 荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）：
6-25
流产性转录和启动子清除
• RNA聚合酶进化很强的启动子识别和结合能力，但RNA聚合酶必须离 开启动子，并进入延伸阶段。聚合酶必须通过以下三种方式之一，才 能合成10 nt 以上的转录本： • 瞬间漂移（transient excursion）：聚合酶短暂地向下游移动，然 后迅速返回起始位置 • 缓慢爬行（inchworming）: 聚合酶自身拉伸，其前缘向下游移动 而后缘停留在原处 • 蜷缩（scrunching）: 聚合酶自身不移动而压缩DNA
一种用于测量两个分子或同一大分子两个组分之间距离的分析技术。其原 理是两个彼此靠近的荧光分子之间有共振能量的转移，但转移效率随两个 分子之间距离的增加而迅速减弱。
6-22
FRET法分析σ因子相对于DNA的移动
后缘FRET
后缘FRET
前缘FRET
前缘FRET
• 在整个转录过程中，一些延伸复合体会保留σ因子 6-23
• Carpousis和Gralla发现RNA聚合酶起始转录后没有离开启动子，而是产 生了许多很小（2-6 nt）的流产性转录本（abortive transcript）
• 其他研究者也发现了更长（9-10 nt）的流产性转录本 • 转录起始过程比最初设想的要复杂得多
• 流产性转录本（abortive transcript）：RNA聚合酶在启动子清除 （promoter clearance）之前发生流产性起始（abortive initiation），合 成的很短的转录产物，一般小于10 nt
细菌转录机制
6.1 RNA聚合酶结构
• SDS-PAGE显示从E. coli提取的RNA聚合酶有几个亚基（1969年）
• 2 个大亚基：β (150 kD) 、β’ (160 kD) • Sigma (σ) 亚基：70 kD • Alpha (α) 亚基：40 kD – 2 copies present in
Carpousis, A. J., & Gralla, J. D. (1980). Biochemistry, 19(14), 3245-3253.
6-17
转录起始阶段
1. 形成闭合启动子复合物 2. 闭合启动子复合物向开放启动子复
合物转换 3. RNA聚合酶停留在启动子上，在起
始转录复合体（initial transcribing complex）中聚合最初的几个核苷酸 4. 启动子清除（Promoter clearance）： 形成的转录本足够长，可以和模板 形成稳定的杂合体，RNA聚合酶转 变为延伸构象，释放σ因子，并移出 启动子区域
• 使启动子强度减弱的突变： • 下降突变（Down mutations） • Increase deviation from the consensus sequence
• 使启动子强度增强的突变： • 上升突变（Up mutations） • Decrease deviation from the consensus sequence
• 如何比较核心酶与全酶结合DNA的 能力？
• 硝酸纤维素（NC）膜结合实验： 先用3H标记的T7 DNA（可被E. coli的RNA聚合酶识别）与 RNA聚合酶结合，然后加入过 量未标记的T7 DNA。
• 结果：全酶结合更紧密，解离 半衰期（t1/2）为30-60 h；核心 酶结合更松散（t1/2 <1 min）
6-18
σ因子促进转录起始
• Travers和Burgess（1969年）以T7 DNA为模板转录RNA的实验发现：σ 因子可促进转录的起始和延伸
• 由于起始是转录的限速步骤，σ对延 伸的促进，是通过起始实现的，即σ 越多，可供延伸的起始RNA越多
• 进一步实验证明：σ不能增强RNA链 的延伸
γ βα
Travers, A. A., & Burgess, R. R. (1969). Nature, 222(5193), 537-540.
6-19
σ因子的再利用
• Travers和Burgess在低离子强度下进 行转录反应，这样核心酶转录完一个 基因后从DNA的解离会很缓慢
• 加入新的核心酶，转录又重新开始， 说明新添加的核心酶与游离的σ（从 全酶中脱落）结合，并启动新的转录
6-7 Bautz, E. K., Bautz, F. A., & Dunn, J. J. (1969). Nature, 223(5210), 1022-1024.
6.2 启动子
• 为什么核心酶对小牛胸腺DNA转录活性高，而对T4 DNA转录活性低？ • DNA分子上的切口（nick）和间隙（gap）是RNA聚合酶容易非特 异性结合的位点，而T4 DNA切口或间隙很少
启动子处DNA的局部解链
• Chamberlin等（1972）发现DNA在与RNA聚合酶结合处发生了局部解 链，可使模板链的碱基暴露出来而与掺入的核苷酸配对。
• Hsieh和Wang（1978）从结合在DNA上的全酶数量，估算每个聚合酶 会引起大约10 bp的解链。
• Siebenlist（1979）发现解链区域大约12 bp。 • Camper和Hearst（1982）发现转录活跃区域的聚合酶-启动子复合体
• σ循环（σ cycle）：σ因子在RNA聚 合酶全酶启动转录后某一时刻从全酶 中解离，然后又与核心酶结合，形成 一个新的能够起始转录的全酶的循环
- rifampicin + rifampicin
Travers, A. A., & Burgess, R. R. (1969). Nature, 222(5193), 537-540.
• σ亚基使天然的RNA聚合酶可以结合识别与更紧密地结合在特定的DNA 序列（真实的RNA聚合酶结合位点，即启动子）
• 启动子（promoter）：RNA聚合酶在转录起始前所结合的一段特定 DNA序列，通常直接位于基因转录起始位点的上游。在启动子处起始的 转录由σ因子决定特异性转录。
6-8
聚合酶与启动子的结合
• 较高温度促进DNA解链及其与 RNA聚合酶的结合
Hinkle, D. C., & Chamberlin, M. J. (1972). Journal of molecular biology, 70(2), 157-18
6-10
RNA聚合酶与启动子结合
Hinkle和Chamberlin提出:
• 全酶首先与DNA松散结合：可 能一开始就结合在启动子上， 或者沿DNA链扫描直至发现启 动子，此时RNA与启动子形成 松散结合的闭合启动子复合物 （closed promoter complex）
6-26
流产性转录、蜷缩和启动子清除
• Ebert及其同事开展一系列实验来区分流产性转录的三种假说，结果和结 论如下 ：
• E.coli RNA聚合酶接近100%的流产性转录均涉及蜷缩，表明蜷缩是启动 子清除所必须的。
• E.coli RNA聚合酶通过蜷缩机制完成流产性转录：将下游DNA拉到RNA 聚合酶内部，RNA聚合酶自身不需要移动，与启动子DNA的结合也不会松 开
核心启动子元件
• Pribnow发现转录起始位点上游大约10 bp处有一个6-7 bp的共有区域： -10框（-10 box），也称为Pribnow框
• Ptashne等发现在转录起始位点上游约35 bp处有另一个共有区域：-35 框（-35 box）
• 分析了数千个启动子后，发现-10框和-35框都存在共有序列 （consensus sequence）
holoenzyme • Omega (ω) 亚基：10 kD （SDS PAGE中未
检测到，但在尿素梯度凝胶电泳中可以清楚 地检测到） • ω亚基对于细胞存活或体内RNA pol的活性不 是必需的，但可能在全酶的组装中起作用
6-5 Burgess, R. R., Travers, A. A., Dunn, J. J., & Bautz, E. K. (1969). Nature, 221(5175), 43-46.
• rrnB启动子中，UP元件在核心启动子的上游，可以被RNA聚合酶识别， 使转录效率提高30倍
• rrnB启动子中有3个Fis位点，属于增强子（enhancer），与转录激活 因子Fis蛋白的结合（与UP元件有关）， 而不与RNA聚合酶结合
6-16
6.3 转录起始
• 1980年以前，普遍认为：RNA聚合酶催化第一个磷酸二酯键形成，转录 起始阶段就结束了
6-15
rrnB P1启动子
• E.coli有7个rrn基因（rrnA, rrnB, rrnC, rrnD, rrnE, rrnG, rrnH），每个 基因都有2个启动子（P1和P2）
• rrn启动子受起始NTP（iNTP）的负调控和预警素（alarmone）鸟苷 5’-二磷酸-3’-二磷酸（ppGpp）的正调控
形成的转录泡大小为17-18 bp。
• 转录泡（transcription bubble）：在合成RNA过程中紧随着RNA聚合 酶之后的局部解链的DNA区域，一般在10~18 bp之间，转录泡越大， 解链需要的能量越多。
6-24
RNA聚合酶在早期启动子解1979). Nature, 279(5714), 651-652.
• 细菌启动子中包含的最少元件（-10框和-35框）称为细菌的核心启动 子元件（core promoter elements）
6-12
细菌核心启动子共有序列
6-13
细菌启动子基本特征元件
6-14
启动子强度
• 共有序列: • -10 box sequence approximates TATAAT • -35 box sequence approximates TTGACA
RNA聚合酶全酶与核心酶
• E. coli RNA聚合酶全酶由核心酶和σ因子组成
β'
α
α
β
核心酶 聚合酶活性
+σ
σ因子
β'
α
α σβ
全酶 正确起始转录
6-6
σ因子是一种特异性因子
• 核心酶对T4 DNA转录活性低，但对有切口的小牛胸腺DNA转录活性高 • 全酶对两种DNA的转录活性都很高
• 全酶的转录产物与天然T4 RNA相同（非对称转录，不能杂交，对 RNase A敏感），核心酶有30%的转录产物与天然T4 RNA杂交产生 RNase A抗性，证明σ因子使转录具有特异性（specificity）。
• 随后，全酶使启动子中的一小 段DNA区域解链，形成RNA与 启动子的紧密结合的开放启动 子复合物（open promoter complex ）
6-11 Hinkle, D. C., & Chamberlin, M. J. (1972). Journal of molecular biology, 70(2), 157-18
σ core
6-20
σ因子循环模型
• 强制释放（obligate release）模型：聚合酶进行启动子清除，从起始 模式转换为延伸模式时，σ因子与核心酶解离。 • 有大量证据支持强制释放模型，但有一些实验发现转录延伸后，σ 因子仍与核心酶结合
• 随机释放（stochastic release）模型：σ因子确实会与核心聚合酶解 离，但这种解离是随机的，而不存在σ因子必须解离的离散点 • 有更多的证据支持随机释放模型
• 全酶在T7 DNA上有紧密结合与 松散结合的位点，核心酶只有 松散结合位点。
6-9 Hinkle, D. C., & Chamberlin, M. J. (1972). Journal of molecular biology, 70(2), 157-18
温度对RNA聚合酶结合的影响
• 在测定的不同温度条件下：温度 越低，RNA聚合酶与DNA的结合 能力越低
σ core
6-21
荧光共振能量转移技术
• 会不会σ因子在延伸过程中只是与核心酶的结合变得更加松散，而不是解 离，而支持强制释放模型的实验由于技术原因导致σ解离？
• Ebright等通过荧光共振能量转移技术来解释这个问题 • 荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）：
6-25
流产性转录和启动子清除
• RNA聚合酶进化很强的启动子识别和结合能力，但RNA聚合酶必须离 开启动子，并进入延伸阶段。聚合酶必须通过以下三种方式之一，才 能合成10 nt 以上的转录本： • 瞬间漂移（transient excursion）：聚合酶短暂地向下游移动，然 后迅速返回起始位置 • 缓慢爬行（inchworming）: 聚合酶自身拉伸，其前缘向下游移动 而后缘停留在原处 • 蜷缩（scrunching）: 聚合酶自身不移动而压缩DNA
一种用于测量两个分子或同一大分子两个组分之间距离的分析技术。其原 理是两个彼此靠近的荧光分子之间有共振能量的转移，但转移效率随两个 分子之间距离的增加而迅速减弱。
6-22
FRET法分析σ因子相对于DNA的移动
后缘FRET
后缘FRET
前缘FRET
前缘FRET
• 在整个转录过程中，一些延伸复合体会保留σ因子 6-23
• Carpousis和Gralla发现RNA聚合酶起始转录后没有离开启动子，而是产 生了许多很小（2-6 nt）的流产性转录本（abortive transcript）
• 其他研究者也发现了更长（9-10 nt）的流产性转录本 • 转录起始过程比最初设想的要复杂得多
• 流产性转录本（abortive transcript）：RNA聚合酶在启动子清除 （promoter clearance）之前发生流产性起始（abortive initiation），合 成的很短的转录产物，一般小于10 nt
细菌转录机制
6.1 RNA聚合酶结构
• SDS-PAGE显示从E. coli提取的RNA聚合酶有几个亚基（1969年）
• 2 个大亚基：β (150 kD) 、β’ (160 kD) • Sigma (σ) 亚基：70 kD • Alpha (α) 亚基：40 kD – 2 copies present in
Carpousis, A. J., & Gralla, J. D. (1980). Biochemistry, 19(14), 3245-3253.
6-17
转录起始阶段
1. 形成闭合启动子复合物 2. 闭合启动子复合物向开放启动子复
合物转换 3. RNA聚合酶停留在启动子上，在起
始转录复合体（initial transcribing complex）中聚合最初的几个核苷酸 4. 启动子清除（Promoter clearance）： 形成的转录本足够长，可以和模板 形成稳定的杂合体，RNA聚合酶转 变为延伸构象，释放σ因子，并移出 启动子区域
• 使启动子强度减弱的突变： • 下降突变（Down mutations） • Increase deviation from the consensus sequence
• 使启动子强度增强的突变： • 上升突变（Up mutations） • Decrease deviation from the consensus sequence
• 如何比较核心酶与全酶结合DNA的 能力？
• 硝酸纤维素（NC）膜结合实验： 先用3H标记的T7 DNA（可被E. coli的RNA聚合酶识别）与 RNA聚合酶结合，然后加入过 量未标记的T7 DNA。
• 结果：全酶结合更紧密，解离 半衰期（t1/2）为30-60 h；核心 酶结合更松散（t1/2 <1 min）
6-18
σ因子促进转录起始
• Travers和Burgess（1969年）以T7 DNA为模板转录RNA的实验发现：σ 因子可促进转录的起始和延伸
• 由于起始是转录的限速步骤，σ对延 伸的促进，是通过起始实现的，即σ 越多，可供延伸的起始RNA越多
• 进一步实验证明：σ不能增强RNA链 的延伸
γ βα
Travers, A. A., & Burgess, R. R. (1969). Nature, 222(5193), 537-540.
6-19
σ因子的再利用
• Travers和Burgess在低离子强度下进 行转录反应，这样核心酶转录完一个 基因后从DNA的解离会很缓慢
• 加入新的核心酶，转录又重新开始， 说明新添加的核心酶与游离的σ（从 全酶中脱落）结合，并启动新的转录
6-7 Bautz, E. K., Bautz, F. A., & Dunn, J. J. (1969). Nature, 223(5210), 1022-1024.
6.2 启动子
• 为什么核心酶对小牛胸腺DNA转录活性高，而对T4 DNA转录活性低？ • DNA分子上的切口（nick）和间隙（gap）是RNA聚合酶容易非特 异性结合的位点，而T4 DNA切口或间隙很少
启动子处DNA的局部解链
• Chamberlin等（1972）发现DNA在与RNA聚合酶结合处发生了局部解 链，可使模板链的碱基暴露出来而与掺入的核苷酸配对。
• Hsieh和Wang（1978）从结合在DNA上的全酶数量，估算每个聚合酶 会引起大约10 bp的解链。
• Siebenlist（1979）发现解链区域大约12 bp。 • Camper和Hearst（1982）发现转录活跃区域的聚合酶-启动子复合体
• σ循环（σ cycle）：σ因子在RNA聚 合酶全酶启动转录后某一时刻从全酶 中解离，然后又与核心酶结合，形成 一个新的能够起始转录的全酶的循环
- rifampicin + rifampicin
Travers, A. A., & Burgess, R. R. (1969). Nature, 222(5193), 537-540.
• σ亚基使天然的RNA聚合酶可以结合识别与更紧密地结合在特定的DNA 序列（真实的RNA聚合酶结合位点，即启动子）
• 启动子（promoter）：RNA聚合酶在转录起始前所结合的一段特定 DNA序列，通常直接位于基因转录起始位点的上游。在启动子处起始的 转录由σ因子决定特异性转录。
6-8
聚合酶与启动子的结合
• 较高温度促进DNA解链及其与 RNA聚合酶的结合
Hinkle, D. C., & Chamberlin, M. J. (1972). Journal of molecular biology, 70(2), 157-18
6-10
RNA聚合酶与启动子结合
Hinkle和Chamberlin提出:
• 全酶首先与DNA松散结合：可 能一开始就结合在启动子上， 或者沿DNA链扫描直至发现启 动子，此时RNA与启动子形成 松散结合的闭合启动子复合物 （closed promoter complex）