六Ecoli环状染色体
质粒的提取与转化
转化原理
• 电转化法：
外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定
，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细 胞，也有利于DNA等大分子进入。同时DNA在电 场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要 的。
转化前准备工作
A. 制备选择性培养基平板(eg：Amp和Kana)
（若放置在冰箱内应提前取出）； B. 预热42℃水浴，预热未添加抗生素的LB液体 培养基； C. 预热37℃恒温摇床； D. 提前给超净工作台照射紫外消毒；
转化原理
• 热击法：
大肠杆菌在 0℃ CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨 胀成球形，转化混合物中的 DNA形成抗DNase的羟 基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间 热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富 培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖 。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选 择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
质粒的提取与转化
2014年11月27日
目 录
目 的 背景知识 质粒转化大肠杆菌
质粒的提取
目
的
• 了解质粒的概念及相关知识。 • 了解质粒DNA转化的原理和方法。
• 掌握质粒DNA转化大肠杆菌的操作步骤。
• 掌握碱裂解法和利用试剂盒提取质粒的方法。
目 录
目 的 背景知识 质粒转化大肠杆菌
质粒的提取
（1）细菌的收获： 取 1.5 ml 新鲜菌液8,000转/分，离心5min， 弃上清。 （2）细菌的裂解： 加入200l预冷的细胞悬浮液（溶液I）悬浮细菌。 加入 200l 细菌裂解液（溶液 II ），颠倒混合离心 管内容物，待溶液变粘稠为止。
注： 粘稠 ，开盖后出现拉丝现象，证明DNA已经游出。
基因工程菌发酵
成并导致减产。
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
（4）溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。 好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若 能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。 发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下 降，发酵后期下降幅度更大。 外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼 吸作用，提高对氧的需求。 维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生长，利于外 源蛋白产物的形成。 采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供 给，提高活菌产量。
原核:包涵体,分泌型
真核:穿梭质粒
质粒(plasmid) 载体 粘粒(cosmid) λ噬菌体(λ phage)
细菌：氯化钙；电穿孔;
细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；微注射；V
动物：微注射；电穿孔；精子；ESC；RT-V 核酸鉴定：PCR; Southern and Northern blot. 蛋白鉴定：SDS-PAGE; HPLC; Western blot. 功能检测：机体生理生化功能、性状的改变。
DNA接头连接法
（三）目的基因导入受体细胞
（四）转化细胞的筛选及表达产物的鉴定
1、重组体的筛选 2、表达产物的鉴定
α 互 补 的 检 测
二、基因工程菌的发酵
• 就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目
标产物，工程菌和常规微生物并无太多的 差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产 过程中表现出不稳定性，以及安全性等问 题，使得工程菌的培养有着自身所特有的 特点。
（一）质粒的稳定性
1、质粒不稳定的类型
• 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程 中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质 粒丢失。 • 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发 生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化
04 复制
1958年， Matthew Messelson and Franklin Stahl 用令人信服的实验 证明了DNA的半保留复制机制。
DNA 半 保 留 复 制 实 验
DNA 复 制 模 型
、
3、DNA半保留复制的生物学意义：
DNA的半保留复制表明DNA在代谢上 的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传 递给后代。
DNA聚合酶I (DNA Polymerase I，Pol I) ：
DNA聚合酶I具有 5′ 3′ 5′
3 ′聚合活性 5 ′外切酶活性(校阅作用 Proofreading) 3 ′外切酶活性
Pol I主要负责修复及切除引物RNA。
Pol I一条多肽上的三种酶活性的分布
DNA聚合酶I为一条多肽链，经枯草杆菌蛋白酶 水解分为大片段(Klenow片段)和小片段。
DNA合成的精确性主要依赖于 DNA聚合酶保真 机制： 1.合成前的控错机制：DNA聚合酶能够仔细 检查引入的碱基的化学特征是否与模板链互补， 保证特异碱基配对；（聚合活性） 2.校对控制功能： DNA聚合酶能够仔细检查 在新碱基引入后形成的碱基对，如果发现了错误 配对，就切除最近加进的碱基。 （校阅活性）
滚环复制用于基因扩增：丝心蛋白
DNA复制方式小结
θ型复制
线形DNA复制
滚环复制
D－Loop复制 滚环复制
第四节 原核生物和真核生物DNA复制的特点
4.1 原核生物DNA复制的酶学
DNA聚合酶和聚合反应 p47
三种DNA聚合酶的结构和功能 DNA连接酶 与DNA几何学性质相关的酶 p 44
滚环复制
滚环式(电镜图)
结果
释放出的新合成的单链；
第七章 细菌遗传分析
1)不同的Hfr品系转移的起始基因是不同的; 说明：Ｆ因子可以在不同的位点插入细菌染色体; 2)与同一基因相邻的基因是相同的; 说明：不同品系细菌的基因顺序是相同的; 3)Hfr基因可以两个不同方向转移基因进入Ｆ-; 4)一个Hfr转移的起始基因是另一个Hfr最后转移的基因 说明：细菌的染色体是环状的. HfrH 1 thr pro 312 2 gly lac his pur gal 3
第四节
中断杂交与重组作图
一 中断杂交实验作图
1中断杂交实验 Hfr thr+ leu+ azir Tonr lac+ gal+ strs X F- thr- leu- azis tons lac- gal- strr
选择培养基 加str
9′ ↓
11′ ↓ ↓
18′ ↓ ↓ ┆
25′ ↓ ↓ ┆
无thr,leu
第七章 细菌的遗传分析 学习要点：
１名词概念 转化、转染、转导、质粒、性导、F因子、Hfr、转 化子、转导子、半合子、附加体、高频转导、低频转 导、感受态因子、特异性转导、合子诱导 2 了解细菌染色体大小与结构；
3 细菌的突变型的类型； 4 细菌菌株的类型、接合的组合方式与重组特点； 5 中断杂交实验作图的原理与方法；
第六节 转化与转导作图
一 细菌的转化与作图 （一）转化：指外源DNA片断不经中间媒介体直接进 入感受态细胞进行基因重组形成重组体的过程。 转化子：通过转化而形成的重组体. （二）转化作图 1 转化作图的条件: 2 转化基因间关系及其确定
DNA浓度 下降比率 1/2 1/2 A转化率下 B转化率 降比率 下降比率 1/2 1/2 1/2 1/2 A与B共转化 率下降比率 1/2 1/4 A与B 关系 连锁 不连锁
人类染色体的识别与核型分析(精选)
人类染色体的识别与核型分析应用人类染色体分析，为诊断疾病、探讨病因和发病机制，针对具体情况采取必要的措施提供了科学的依据。
因此染色体的研究已成为临床医学中一个不可缺少的组成部分。
人类染色体分析与鉴定是否可靠，直接关系到遗传咨询和产前诊断的准确性。
因此如何准确识别染色体，鉴别正常与异常染色体是十分必要的。
(一)染色体的命名和常用命名符号人类细胞遗传学标准化国际命名体制(ISCN1985)包括了1960年、1963年、1968年、1971年、1978年、1981年、1985年7次人类细胞遗传学国际命名会议的结果。
主要决议的文本是人类细胞遗传学的国际法规，为了简便地记述人类染色体及染色体畸变，制定了统一的命名符号，详见表13-5。
表13-5染色体常用命名符号表示符号说明表示符号说明ace→bcen：：：csctdelderdirdicdisdup无着丝粒片段从→到断裂着丝粒断裂断裂与重接染色体染色单体缺失衍生染色体正位双着丝粒体远侧端重复/+-？minmospph1przqrrcprearec将不同的细胞分开多余丢失不能确定微小点嵌合体染色体短臂费城染色体粉碎染色体长臂环形染色体相互易位重排重组染色体(续表)表示符号说明表示符号说明eendffrafemghiinvmalmar互换内复制断片脆性位点女性裂隙次缢痕等臂染色体插入倒位男性标记染色体robsscettantertrivar；罗伯逊易位随体姊妹染色单体互换易位串联易位染色体末端三射体三着丝粒体染色体可变区在涉及一个以上染色体重排中，用来分开各染色体1.非显带染色体的命名：一个典型的中期染色体由2条姊妹染色单体组成，2条姊妹染色单体借着丝粒(次缢痕)相连，着丝粒将染色体分为长臂和短臂，根据着丝粒在染色体上所处的位置不同分为中着丝粒、亚中着丝粒和近端着丝粒染色体。
人类的1号、9号、16号染色体长臂近着丝粒端有1个次缢痕。
在近端着丝粒染色体上，常借1个纤细的染色质丝连接上1粒状结构称随体。
染色体带纹及命名
染色体带纹及命名人类染色体是以几届国际会议的结果予以命名的（1960的Denver会议，1963年的伦敦会议，1966年的芝加哥会议，1975年巴黎会议，1977年stockholm会议，1994年Memphis会议）。
1995年细胞遗传学标准委员会修改了自1985到1991年所发表的文件，把他们编撰成一个册子，名为《人类细胞遗传学国际命名体制》，常简称ISCN1995。
显带是一类分带技术，是一种方法学。
是把染色体标本经过特殊处理后染色，使染色体有深、浅或明、暗的区别带。
这里我们介绍几种常出现在文献中的带型。
1、G带：也叫G显带，这是临床上最常用的显带方法。
用胰酶，缓冲液处理中期染色体标本均可显带。
G带的特性是显带方法简单恒定，带型稳定，保存时间长。
染色体标本用热、碱、蛋白酶等预处理后，再用Giemsa染色，可以显示出与Q带相似的带纹。
在光学显微镜下，可见Q带亮带相应的部位，被Giemsa染成深带，而Q带暗带相应的部位被Giemsa 染成浅带。
这种显带技术称为G显带，所显示的带纹称为G带。
G显带克服了Q显带的缺点，G带标本可长期保存，而且可在光学显微镜下观察，因而得到了广泛的应用，是目前进行染色体分析的常规带型。
2、Q带：用喹吖因染料染中期染色体标本可出现一种特征性黄光亮暗带型，一般富含AT-DNA区段表现为亮带，富含GC-DNA区段黄光较暗，常用于人类Y染色体长臂的观察。
临床上较少用，不能长久保存。
3、C带：这种方法将结构异染色质和高度重复的DNA区域染色。
在人类染色体上这些区域位于着丝粒和Y染色体上。
常用于某一科题的研究。
专门显示着丝粒的显带技术。
C显带也可使第1、9、16号和Y染色体长臂的异染色质区染色。
因而，C带可用来分析染色体这些部位的改变。
4、R带：带型与G带相近，常用于染色体末端的研究。
所显示的带纹与G带的深、浅带带纹正好相反，故称为R带（reversed band）。
G带浅带如果发生异常，不易发现和识别，而R显带技术可以将G带浅带显示出易于识别的深带，所以R显带对分析染色体G带浅带部位的结构改变有重要作用。
EColi感受态细胞的制备、质粒DNA的转化、提取与酶切鉴定
4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速 颠倒离心管,以混匀内容物,冰上放置3－5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变 性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状结构
色，可确定DNA在胶中的位置。 影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素：
DNA的分子大小； 琼脂糖浓度； DNA构象； 电场强度； 碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。
三．实验材料与设备：
1、用品与与仪器： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养 箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速 离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝 胶成像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头 、烧杯、量筒
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰 上放置2～3min；
溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部 分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性
6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep 管中；
7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀， 室温放置2min. 8、 12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙 醇洗涤一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸 上扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含20 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或 TE 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约 8min)，存于－20℃或直接用于酶切。
08XM一中生物竞赛自测题1解析
单选：1.形成层又称维管形成层。
一般指裸子植物和双子叶植物的根和茎中，位于木质部和韧皮部之间的一种分生组织。
经形成层细胞的分裂，可以不断产生新的木质部与韧皮部，使茎或根不断加粗，形成层的细胞特征可分为两种类型：纺锤状原始细胞和射线原始细胞。
细胞两端尖锐、扁长形、细胞核多为椭圆形或肾脏形；细胞质较稀薄，具明显的大液泡和分散的小液泡；细胞径向壁较厚，壁上具初生纹孔。
2．花药壁（编者：题目要求的是整个花药不止是花药壁，也就是说……）的结构与功能如下（从外到内）：表皮（skin)药室内壁(endothecium)中层(middle layer)绒毡层（tapetum)（编者：……最里面还有一层孢子母细胞）3．雌球花侧生或近顶生，单生或成束，由无数螺旋排列的珠鳞和苞鳞所组成，珠鳞生于苞鳞的腋内，有胚珠2颗；成熟时珠鳞发育成种鳞，木质，厚，其露出部分名鳞盾。
5.南瓜黄瓜为单性花，毛白杨、银白杨为杨属，其特征：雌雄异株，柔荑花序下垂。
花先叶开放，无花被，有杯状花盘，雄蕊常多数。
蒴果，种子小，具白色绵毛。
一品红为单性花，一串红为两性花。
马蹄莲与魔芋为两性花。
6、马尾松和黄山松为两性花，苏铁和银杏为单性花，柏木两性花，侧柏单性花，板栗两性花，锥栗单性花。
8、辅酶Q在体内呼吸链中质子移位及电子传递中起重要作用,在光合链中数量最多。
它是细胞呼吸和细胞代谢的激活剂,也是重要的抗氧化剂和非特异性免疫增强剂。
10.光合作用产生的氧气来自水。
12.13.①植物从光转暗时核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）水平急剧下降，PGA迅速上升，②骤然降低CO2浓度时，PGA迅速下降，RuBP、核酮糖-5-P（Ru5P）、甘油醛-3－P（GAP）依次上升，断定RuBP是PGA的前体。
③找到了催化RuBP与NaH14CO3形成PGA的RuBP羧化酶，肯定RuBP是CO2的受体。
CO2同化需要光化学反应形成的ATP及NADPH。
14.植物的光合强度和呼吸强度达到相等时的光照度值。
病毒、细菌基因组结构与功能
泛基因阶段孟德尔的遗传因子阶段摩尔根的基因阶段顺反子阶段操纵子阶段现代基因阶段DNA分子中含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。
合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列（通常是DNA序列）。
一个基因应包含不仅是编码蛋白质肽链或RNA的核酸序列，还包括为保证转录所必需的调控序列、5′非翻译序列、内含子以及3′非翻译序列等所有的核酸序列（蛋白质基因和RNA基因）。
根据其是否具有转录和翻译功能可以把基因分为三类第一类是编码蛋白质的基因，它具有转录和翻译功能，包括编码酶和结构蛋白的结构基因以及编码阻遏蛋白的调节基因第二类是只有转录功能而没有翻译功能的基因，包括tRNA基因和rRNA基因第三类是不转录的基因，它对基因表达起调节控制作用，包括启动基因和操纵基因是指生物体全套遗传信息，包括所有基因和基因间的区域。
原核生物基因组：染色体基因组（chromosomal genome）染色体外基因组（extrachromosomal genome ）真核生物基因组：染色体基因组（chromosomal genome）染色体外基因组（extrachromosomal genome ）生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象称为 C value paradox，又称C值悖论）病毒基因组很小，且大小相差较大病毒基因组可以由DNA组成，或由RNA组成多数RNA病毒的基因组是由连续的RNA链组成基因重叠基因组的大部分可编码蛋白质，只有非常小的一部份不编码蛋白质形成多顺反子结构病毒基因组都是单倍体（逆转录病毒除外）噬菌体（细菌病毒）的基因是连续的，而真核细胞病毒的基因是不连续的1981年，美国首先发现获得性免疫缺陷征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），其病原体是一种能破坏人免疫系统的逆转录病毒1986年，命名为：人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）HIV特异性地侵犯并损耗T细胞而造成机体免疫缺陷HIV如何感染免疫细胞并复制捆绑――当HIV病毒的gp120蛋白捆绑到T-helper细胞的CD4蛋白时，HIV 病毒附着到机体的免疫细胞上。
分子生物学课后练习
第一章1.How gene was defined during development?在开发过程中基因是如何定义的?编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位,是染色体或基因组的一段DNA序列2.The definition of Molecular biology? What are the contents?分子生物学的定义？内容是什么？定义：分子生物学是在分子水平上研究生命现象的科学。
通过研究生物大分子(核酸、蛋白质)的结构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。
主要内容：①.重组DNA技术、②.基因表达调控研究、③.生物大分子的结构功能研究、④.基因组、功能基因组与生物信息学研究。
3.The main development stages of Molecular biology? Say 3 standerd examples in each stage.分子生物学的主要发展阶段？每个阶段说3个例子。
认识DNA和RNA. ②.建立和发展DNA重组技术. ③.快速发展阶段。
例子略4.Explain the importance of subject of Molecular biology.解释分子生物学这门学科的重要性.分子生物学、细胞生物学和神经生物学是当代生物学研究的三大主题。
三者相互渗透，相互促进。
分子生物学不仅是目前自然学科中进展最迅速、最具活力和生气的学科，也是新世纪的带头学科。
第二章Nucleotide：一类由嘌呤碱或嘧啶碱基、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物。
B-DNA：又称B型DNA，为DNA双螺旋的一种形式，具有右旋型态的双股螺旋。
Z-DNA：称Z型DNA，是DNA双螺旋结构的一种形式，具有左旋型态的双股螺旋。
三链DNA(H-DNA)：称H-DNA，同型嘧啶和同型嘌呤的两股链，低PH下能形成三链。
四链DNA( 4-strand DNA)：富含G的序列容易形成四链结构。
第四章 人工染色体载体
P1噬菌体载体
P1噬菌体DNA多联体与包装的关系
三、P1人工染色体载体
➢ PAC系由pAd10sacBⅡ 衍化而来，除去了腺病毒(adenovirus) 的填充片段，插入了基于pUC质粒的序列
F质粒
➢ Cavalli-Sforza(1950)和Hayes（1952） ➢ 大肠杆菌(E.coli)接合交配期染色体标记的单向转移 ➢ 大小约100kb，编码60多种参与复制、分配和接合过程的
蛋白质
➢ 可以整合到宿主染色体中，在大肠杆菌 ➢ 染色体中有30多个位点进行随机整合(random intergration)
3.大小：一般5 kb左右，可克隆38～47 kb片段 包括噬菌体（38～52 kb）
N=ln(1-p)/ln(1-f)
哺乳动物 3x入片段占总 DNA的比值
N=ln(1-0.99)/ln(1-(1.7x104/3x109) 用噬菌体颗粒感染recA+ E.coli（pUC18∷探针） ④ 发生重组 ⑤ 再次包装 ⑥ 再次感染，宿主为recA- E.coli(ampr, kanr)pWE15四、黏粒的扩增和贮存1. 滤膜影印
25%甘油 TB平板， -70 C
cosN：来自 phage，可 被 phage 的 terminase特异切割
LoxP：类似 phage 的 cosN，来自P1 phage，其Cre蛋白 特异性切割该位 点
制备平均大小100kb的外源片段
未酶切 Hindlll酶切2hrs Hindlll酶切4hrs
切胶回收后检测
97.0kb
23kb
cI 溶源(lysogenic)：R 复制子 RepA par 裂解(lytic)：162bp pac
二、P1噬菌体载体
《Ecoli环状染色体》课件
在细菌中，除了E.coli外，还有许多 其他种类的细菌具有环状染色体，如 大肠杆菌、沙门氏菌等。
在真核生物中，某些低等真核生物如 原生动物和藻类也具有环状染色体。
不同微生物环状染色体的比较分析
不同微生物的环状染色体在基因组大小、基因数目和排列顺序等方面存在差异。
不同微生物的环状染色体在复制方式、复制速度和复制调控机制等方面也存在差异 。
20世纪中叶
科学家开始对染色体进行测序 ，发现染色体上的基因排列顺 序。
20世纪末期
科学家通过全基因组测序技术 ，发现E.coli的染色体是环状的
。
环状染色体的实验证据
通过全基因组测序技 术，科学家发现 E.coli的染色体是环 状的。
通过电镜观察技术， 科学家发现染色体的 形态呈现环状结构。
通过荧光染色技术， 科学家发现染色体的 两端是连接在一起的 。
基因表达的可塑性
环状染色体结构使得基因 表达具有更高的可塑性， 可以根据环境变化来调整 基因的表达。
环状染色体与DNA超螺旋结构
DNA超螺旋的形成
环状染色体上的DNA分子可以形成超螺旋结构，这种结构对基因 的表达具有重要影响。
超螺旋结构的调控
超螺旋结构可以调控DNA的复制和转录过程，进而影响基因的表 达。
用等。
染色体分离的异常可能导致遗 传异常和细胞分裂异常。
04
CATALOGUE
E.coli环状染色体与基因表达调控
环状染色体对基因表达的影响
基因表达的调控
环状染色体结构对基因表 达具有重要影响，可以通 过DNA超螺旋结构来调控 基因的表达。
基因表达的稳定性
环状染色体结构有助于维 持基因表达的稳定性，避 免基因表达受到外界因素 的干扰。
4(2011) 载体的种类9.6
4、复性：加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸钠，振荡后，冰浴5分钟。
5、质粒DNA的获得：离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质
粒DNA。
冰浴盒
小型离心机
质粒抽提试剂盒操作流程：
①大肠杆菌的培养：从平板上挑选单菌落接种至2 ml 的含
有抗生素的液体培养基中，37 ℃过夜培养；
流程：
(1) 首先加溶菌酶或十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）来促进大肠菌细胞裂解 (2)将溴化乙锭的氯化铯溶液加清亮的大肠杆菌 裂解液中，EB会嵌入DNA链的碱基中去。 (3)在EB达到饱和时，进行氯化铯密度梯度离心。
2.碱变性法（重点掌握）
质粒背景 • 质粒是染色体外的DNA分子，大小可为 1kb到200kb。 • 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭 合环状的分子，以超螺旋形式存在。它 是细菌内的共生型遗传因子。 • 其复制和遗传独立于细菌染色体，但复 制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。
1.5mL EP管 小型离心机
2、细胞裂解：加入100微升冰冷的细胞裂解液
液，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0,
10mM EDTA，4-5mg溶菌酶）静置5分钟；
加样枪
3、染色体变性：加入200微升微冷的碱液（0.2NaOH，
1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟（65度水浴一段时间会加
质粒的应用
• 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入
细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基
因运载工具在基因工程中具有极广泛的应
用价值。
2.碱变性法（重点掌握）
原理：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在 拓扑学上的差异而发展出来的。 在PH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价 闭合环状质粒DNA却不会被变性。 通过冷却或恢复中性PH值使之复性，线性染色体形成网状 结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染
第五节 中断杂交与重组作图解析
第五节中断杂交与重组作图一中断杂交实验作图1中断杂交实验Hfr thr+ leu+ azir Tonr lac+ gal+ strsXF- thr- leu- azis tons lac- gal- strr选择培养基9′11′18′25′加str ↓↓↓↓无thr,leu↓↓↓影印接种azi Ton lac gal ┆┆┆表5-3 Hfr的未选择性标记基因进入F-所需时间（分钟）2 中断杂交实验作图原理A： Hfr染色体上的基因是从某一点开始,以线性方式进入F-的,B：离原点愈近的基因进入Ｆ-愈早,出现在F- 中的比例愈大。
3 中断杂交作图：指在HfrXF-杂交中,把接合中的细菌在不同时间取样,搅拌中断杂交, 分析受体菌基因型,以Hfr基因出现在F-中的先后为顺序,以转移的时间(分钟)为图距单位进行基因作图的方法。
4 作图(原点) azi Ton lac gal F0 9 11 18 25min,反之,则愈小.5 Ecoli的染色体呈环状表5-4 几个Hfr菌株的基因顺序1)不同的Hfr品系转移的起始基因是不同的;说明：Ｆ因子可以在不同的位点插入细菌染色体;2)与同一基因相邻的基因是相同的;说明：不同品系细菌的基因顺序是相同的;3)Hfr基因可以两个不同方向转移基因进入Ｆ-;4)一个Hfr转移的起始基因是另一个Hfr最后转移的基因说明：细菌的染色体是环状的. P153 图6-9二重组作图(难点)1、细菌的重组作图的前提(1) 两个基因紧密连锁; (2) 两个基因进入受体菌的先后;例：已知lac 和ade紧密连锁; lac+比ade+先进入Ｆ-;2 杂交、选择、统计重组体Hfr lac+ ade+ strs X F- lac- ade- strr3 计算重组体重组值=重组菌落数/总菌落数X100 %=(lac- ade+)/[(lac+ ade+ )+(lac- ade+)]X100% = 15/(52+15)X100% ≈20%已知中断杂交实验该两个基因相距1分钟, 重组作图与中断杂交作图的图距关系:1分钟图距≈20% 重组值4 Ecoli染色体全长：90分钟；含有：3.6X106bp20X90 ≈1800 cM。
六Ecoli环状染色体
pur－
lac－
pro－
图8-16 Hfr Hstrs × F－pro－ lac－ pur－，以strr pur＋选择标记的重组类型
(仿Griffiths A.J.F.et al：《An Introduction to Genetic Analysis》5th Ed. 1993, Fig.10-13)
SV40
人 类 双 链 DNA 超 螺 旋 环
鼠 白 血 病 病 毒鼠
单 链 RNA 几 个 片 段
烟 草 花 叶 病 毒烟 草 单 链 RNA 线 状
二．λ噬菌体
1951年 Esther Lederberg 发现K12中有原 噬菌体，并命名为λ。
附加体(episome) 合子诱导（zygotic induction）
当 我 们 选 择 标 记 为 b ＋ 时 ， 公 式 为 : R F a b =a b ＋ a b ＋ ＋ a 数 ＋ b ＋× 1 0 0 ％
三、特异性转导
又称局限性转导（restricted transduction） J. Lederberg & N. Zinder发现
野生型E.coli UV K12 (λ) gal＋ 诱导
正常的切离 非正常切离 λdg(λd gal) λpgal λdbio 低频转导(low-frequency transduction, LFT） 高频转导(High-feequency transduction, HFT) 双重溶原（double lysoge）细菌
（2）各基因的重组频率随着时间的增加 而增加，直至极值；
（3）按时间顺序，先重组和后重组的基 因，重组率的极值在逐步减少；
0
5 10
15 20 25 (分钟)
大肠杆菌质粒和噬菌体
大肠杆菌在分子生物学实验中的应用
★ mRNA的分子结构差异：绝大多数真核mRNA分子的3末端有 poly(A)尾巴，在5末端有一个帽结构。真核mRNA不能结合到细菌核 糖上。
★ 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统：表达的蛋白质不能进行糖基 化、磷酸化修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构想折叠，因而蛋 白质没有足够的生物学活性（缺乏对真核生物蛋白质的复性功能）。 ★ 大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，表达的蛋白经 常是不溶的，表达蛋白量超过菌体总蛋白10%时，容易形成包涵体。 ★ 细胞周质中有种类繁多的内毒素很难除去，细菌的蛋白酶可以识别降 解真核生物的蛋白质产物。
大肠杆菌生长曲线
将一定数量的细菌，接种于适宜的液体培养基中，在适温下培养 ，定时取样测数，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标， 作出的曲线称为生长曲线。 该曲线表明细菌在一定的环境条件下群体生长与繁殖的规律。一 般分为延缓期、对数期、稳定期、衰亡期四个时期，各时期的长 短同菌种本身特征、培养基成分和培养条件不同而异。
松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可 以进行复制，在细胞内的数量可以达到10-200个或更多。如果用一定的 药物处理抑制寄主蛋白质的合成，会使质粒拷贝数增至几千份。
pBR322即属于松弛型质粒，经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。
严紧型
松弛型
细菌质粒性质：
3、可以通过转化（直接吸收摄入）、转导（噬菌体载体）或接合作用(通 过细胞间紧密接触而实现遗传物质交换)由一个细胞转移到另一个细胞，使 两个细胞都带有质粒；质粒转移时，可以单独转移，也可以携带着染色体 （片段）一起转移，所以可成为基因工程载体。
大肠杆菌的培养与保存
在固体培养基上培养
遗传学试题——精选推荐
遗传学试题第⼆章孟德尔式因⼦1、分离定律：⼀对等位基因在杂合⼦中，各⾃保持其独⽴性，在配⼦形成时，彼此分开，随机地进⼊不同的配⼦。
2、⾃由组合定律：⽀配两对（或两对以上）不同性状的等位基因，在杂合状态保持其独⽴性。
配⼦形成时，各等位基因彼此独⽴分离，不同对的基因⾃由组合。
3、卡平⽅检验【x2（Chi sqare method）】（1）X2=∑[（实计频数-预计频数）2/预计频数]= ∑[d2/e]（2）x2 检验应⽤于⼤样本（3）预期数≥5（4）所取数值不⽤百分⽐表⽰（5）查表时n=表型-1（6）统计的标准：P>0.05，结果与理论数⽆理论差异，实验值复合理论值，说明基因是⾃由组合的。
P<0.05，结果与理论数有显著差异，实验值不符合理论值；p<0.01，结果与理论书存在极显著的差异，实验值⾮常不复合理论值。
第三章基因的作⽤及其环境的影响1、致死基因（Lethal genes）：导致⽣物体不能成活的基因。
隐性致死基因：基因的致死发⽣在隐性纯合体中，这种基因叫做隐性致死基因。
显性致死基因：基因的致死发⽣在杂合体中，这种基因叫做显性致死基因。
配⼦致死基因：在配⼦形成期致死的基因。
合⼦致死基因：胚胎期或者成体阶段致死的基因合称为合⼦致死基因。
2、复等位现象：⼀个基因作为上存在很多等位基因形式的现象。
复等位基因（Multiple Alleles）：⼀组等位基因的数⽬在两个以上，作⽤相互类似，都影响同⼀器官的性质和形状，这种基因称为复等位基因。
3、互补基因：不同对的两个基因相互作⽤出现了新的性状，这两个基因称为互补基因。
4、修饰基因：有些基因可以影响其他基因的表型效应。
例如，强化基因、限制基因、抑制基因。
5、上位效应：某对基因的表现受到另外⼀对⾮等位基因的影响，随后者的不同⽽不同的现象。
隐性上位：上位基因隐性则遮盖下位基因。
显性上位：上位基因显性则遮盖下位基因。
6、ABO⾎型以及孟买⾎型的形成：第四章遗传的细胞学基础1、DNA结构稳定遗传的功能序列（1）ARS序列：⾃主复制序列，或复制起点序列（2）CEN序列：着丝粒序列（3）TEL序列：端粒序列2、有丝分裂各个时期特点合成前期G1：RNA和蛋⽩质的合成合成期S：DNA合成合成后期G2：RNA合成，能量储备分裂期M：前期：细胞核染⾊质开始浓缩，经螺旋化、折叠、包装等过程逐渐缩短变粗核膜破裂标志着进⼊前中期，前中期核膜、核仁消失，形成纺锤体中期：着丝点排列在⾚道板上，染⾊体长轴与纺锤体轴垂直后期：姊妹染⾊单体分开，随着动⼒微管缩短，移向细胞两极末期：⼦染⾊体完成向两极前移，染⾊体开始解螺旋，恢复间期伸展状态，核膜、核仁重现，纺锤体消失。
3物理图绘制
原位杂交是以标记的DNA分子为探针，检测完 整染色体的一种杂交分析方法，其必须使染色 体DNA 成为单链。
荧光原位杂交
一种 封闭 杂交 探针 中重 复序 列的 方法
3.4 序列标签位点
（Sequence tagged site, STS）作图 限制性作图不能用于大型基因组； 克隆重叠群复杂，费时费力； FISH难于操作，数据积累慢。 目前最有效的物理作图技术，也是能对大型基因 组产生最详尽图谱的技术，是STS作图，主要为 辐射杂种作图。
限 制 性 片 段 指 纹 作 图 原 理
限制性片段指纹电泳图
指纹重叠群构建
酵母基因组遗传图与物理图的整合
3.3 染色体细胞图
细胞图：通过原位杂交的方法将基因或DNA 分 子标记定位在染色体的某一区段，由此绘制图 称为细胞图。 最常用的细胞图绘制技术为荧光原位杂交。
（fluorescent in situ hybridization , FISH）
思考题：
如何从单条染色体中制备出DNA克隆？3.2.2 重叠群组建相互重叠的DNA片段组成的物理图称为重叠群(contig)。 构建重叠群：步移法和指纹法
染 色 体 步 移
3.2.3 指纹作图—3种指纹
在基因组范围内查找重叠的克隆，最好的方法是克隆指纹排 序。指纹指克隆的DNA序列所具有的特定的DNA片段组成。
Huai-Xiang Hao 1, Oleh Khalimonchuk 2, Margit Schraders 3, Noah Dephoure 4, Jean-Pierre Bayley 5, Henricus Kunst 6, Peter Devilee 7, Cor W. R. J. Cremers 6, Joshua D. Schiffman 8, Brandon G. Bentz 9, Steven P. Gygi 4, Dennis R. Winge 2, Hannie Kremer 3, Jared Rutter 1*