亚能HPV核酸分型检测试剂盒说明书
04-HPV 人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒-产品介绍13-12-17
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形态学筛查存在的问题
１、假阴性结果(10-30%)面临医疗纠纷；
２、重复性不好；
３、经验性:需要富有经验的专家； ４、增加筛查成本:复诊率过高； ５、在等待复查中承受焦虑和精神压力；
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宫颈癌临床主要检测方法（二）
HPV DNA分型检测方法
---荧光PCR法(默乐生物） ---杂交信号放大法 (HC2)
1、竞争性内标技术：
监测整个核酸抽提和检测过程是 否有误，有利于消除反应出现的 假阴性，结果更可靠。
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产品特点——独特探针引物设计
高保守
无交叉 阴阳性
无漏检
基于HPV分型原理： 根据HPV L1区基因保守序列设计一系列扩增引物富集24种型别的HPV
PCR产物，再针对不同亚型设计不同探针，进行荧光PCR反应，通过荧光信
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宫颈癌前病变各期及宫颈癌的病理模式图
正常宫颈
轻度不典型增生 中度不典型增生 CIN I CIN II
重度不典型增生 CIN III/CIS
浸润癌 Invasive CA
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宫颈癌筛查方案
• 权威组织一致推荐：采用细胞学检 查和HPV DNA联检进行宫颈癌筛查。
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产品市场容量分析
HPV检测试剂 盒未来的市场 规模达222亿元
我们默乐 HPV产品市 场占有率
？
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CIN1、CIN2、CIN3：子宫颈上皮内瘤变
ASC-US:意义不明确的非典型鳞状细胞
MP核酸检测试剂盒说明书
肺炎支原体（MP）核酸检测试剂盒（PCR荧光法）说明书【产品名称】通用名称：肺炎支原体（MP）核酸检测试剂盒（PCR荧光法）英文名称：PCR-Fluorescence Detection Kit for Mycoplasma Pneumonia【包装规格】32人份/盒【预期用途】本产品用于定性检测痰液或咽拭子中的肺炎支原体核酸。
肺炎支原体（）是人类支原体肺炎的病原体，主要经飞沫传染，潜伏期2～3周，支原体肺炎的临床表现和胸部X线检查并不具特征性，单凭临床表现和胸部X线检查无法做出诊断。
若要明确诊断，需要进行病原体的检测。
而病原体核酸检测是目前最为直接的检测手段。
适应症：由肺炎支原体感染引起的肺炎等疾病。
【检验原理】本试剂盒选用肺炎支原体（MP）保守基因片段设计特异引物及特异Taqman 探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，在PCR延伸反应过程中，Taq酶的外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3’端荧光淬灭基团的屏蔽，即能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，从而实现在全封闭反应体系中对肺炎支原体核酸的自动化检测。
【主要组成成份】注: 不同批号试剂盒中各组份不可以互换。
【储存条件及有效期】试剂-20℃可保存12个月。
【适用仪器】ABI7300、ABI7500荧光PCR扩增仪。
【样本要求】1. 标本：痰液及咽拭子。
2. 采集器：应当选用国家批准生产的一次性使用的咽拭子，拭子应当包括洁净海绵头、PP杆、PP杆与海绵头应连接牢固，经无尘清洗包装。
3. 采集：样本采集具体方法请参考《微生物标本采集手册》一书。
a. 自然咳痰法以晨痰为佳，用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入痰盒中，标本量应大于等于1ml。
b. 咽拭子取痰法用弯压舌板向后压舌，将拭子伸入咽部，转动拭子取出粘液。
4.存放：2-8℃保存，不超过24小时；-20℃下保存，不超过3个月；-70℃下长期保存，但应避免反复冻融。
02 HPV病原体(流式荧光法)测定标准操作规程
人乳头状瘤病毒病原体检测(流式荧光法)标准操作规程一、检验目的人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)病原体检测用于临床尖锐湿疣体表面脱落细胞，妇女宫颈细胞及宫颈粘液标本中26种HPV病毒DNA的分型检测。
可作为HPV感染的辅助诊断。
二、适用范围1. 适用于下生殖道分泌物、宫颈脱落细胞等样本的采集，接受，处理，检测及报告。
2. 适用仪器：ABI7000 PCR扩增仪、LIFE EXPRESS基因扩增仪、Luminex200流式分析仪。
三、方法原理本试剂盒系由人乳头状瘤病毒(HPV)核酸提取试剂、HPV杂交检测试剂等组成。
用Chelex-100树脂法抽提宫颈脱落细胞基因后，采用多重PCR技术对DNA进行扩增，并以流式荧光杂交法对扩增产物进行检测分析，判定样品中是否存在HPV。
多重PCR可有效扩增HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66共13种高危亚型，此外还可以有效扩增HPV6、11、40、42、44、53、54、55、56、61、68、73、83等亚型。
微球杂交液中包含多种荧光编码微球，每种荧光编码微球的表面都共价交联有寡核苷酸探针，在杂交过程中探针特异性识别并结合PCR产物中的靶序列，再经过和荧光素反应后形成微球－探针－扩增产物－荧光素的复合物，经Luminex流式分析仪阅读时，可获得该复合物的微球编码及荧光强弱信号，最后经过透景HPV专用的分析软件判定相应的检测结果。
四、性能指标1. 检测灵敏度：本试剂盒的最低检测限为10-20拷贝(0.02ng/ml)2. 检测特异性：阳性参比品符合率：试剂盒对26种HPV亚型的阳性参比品进行2次平行坚持测，结果均为阳性。
阴性参比品符合率：试剂盒对正常人基因组参比品进行2次平行检测，结果均为阴性。
3. 检测重复性：分别对HPV16、HPV18、HPV31、HPV45和 HPV33共5种高危亚型阳性参比品进行10次平行检测，结果一致且准确。
HPV SOP - 不带提取
人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒（荧光PCR 法）标准操作流程一、目的：规范实验室操作，正确使用PCR扩增仪进行HPV-DNA扩增分析，以保证实验结果的准确性。
二、适用范围：人乳头状瘤病毒(HPV)基因分型检测试剂盒在扩增仪上进行扩增以及分析。
三、职责：由临床分子生物实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。
四、程序：【检验方法】1. 试剂准备（试剂准备区）a) 从-20℃取出试剂盒，将各试剂融化混匀并短暂离心后备用。
计算需要进行的反应份数n （n=待测样本数+空白对照1份+阳性对照1份）。
b) 取出8个离心管分别标记1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#和8#，分别加入n×10μl 核酸扩增反应液，然后对应每个编号离心管分别加入n×8μl A反应液（1#）、n×8μl B反应液（2#）、n×8μl C反应液（3#）、n×8μl D反应液（4#）、n×8μl E反应液（5#）、n×8μl F反应液（6#）、n×8μl G反应液（7#）、n×8μl H反应液（8#）。
c) 混匀并短暂离心后，依次分装至对应编号PCR八联管中，每管18μl，总共分装n排PCR 反应八联管，1排PCR八联管为1人份。
2. 加样（1）小心打开PCR八联管盖，每份待测样本核酸溶液、空白对照按照2μl/管依次加入对应编号含有A-H反应体系的PCR八联管中，1排PCR八联管为1人份，阳性对照（A-H组）同样按照2μl/管分别加入对应的A-H反应体系的PCR八联管中，总体积为20μl/管。
（2）盖紧PCR八联管盖，低速短暂离心。
3. PCR扩增检测（核酸扩增区）3.1 将反应管放入荧光PCR 扩增仪进行扩增检测。
4. 结果分析4.1 杭州博日Linegene 9600荧光定量PCR仪：反应结束保存结果，根据分析后图像调节基线的起始循环、终止循环（可以根据实际情况自行调整，起始循环可以在3~15、终止循环可设在5~20，调整空白对照的扩增曲线平直或低于阈值线；也可由仪器进行自动判读，起始循环为3、终止循环为15），点击确定自动获得分析结果，在同一界面的显示区察看结果。
人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测及基因分型、试剂技术审查指导原则
的筛查方法，可发现早期病变。但宫颈细胞学检查存在其固有的 局限性。高危型HPV检测用于宫颈细胞学检查异常患者的分流及 宫颈癌筛查，可有效地增加宫颈病变检出率，提高细胞学检查敏 感性，并降低筛查频率。
一、范围 人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV）属于乳头瘤病 毒科，是一种小分子的、无被膜包被的 1、环状双链 DNA 病毒， 基因组长约 8000 碱基对（bp），分为 3 个功能区，即早期转录区 （E 区）、晚期转录区（L 区）和非转录区（长控制区，LCR）。 HPV 通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒 不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤
由于宫颈癌筛查涉及面广，故由假阴性和假阳性 HPV 检测 结果引起的潜在公共卫生损害风险较为显著。假阴性结果可能导 致宫颈癌诊断和治疗不及时，假阳性结果可能导致不必要的频繁 筛查和侵袭性处置。因此，确立良好的性能指标并充分理解 HPV 检测的临床意义，对于此类产品的安全有效性评价至关重要。产 品性能如不符合临床需求，可能导致对患者所作的决策错误。总 体来说，此类试剂分析及临床性能的评价应有严格的控制，同时 亦应重点关注临床的合理应用和检测结果的科学解释。
本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，不涉 及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足 法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和 验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定 的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导 原则相关内容也将适时进行调整。
病毒核酸纯化试剂盒说明书百度文库
病毒核酸纯化试剂盒说明书病毒核酸纯化试剂盒Cat. No. 5次样品400200550次制备4002050250次制备4002250核酸纯化柱2 ml离心管蛋白酶K贮存液Carrier RNABuffer VLBuffer WBR（浓缩液）Buffer TE说明书5个5个120 µl40 µl1.5 ml1.5ml0.5 ml1份50个50个1.2 ml400 µl15 ml6.5ml×25 ml1份250个250个1.2 ml×5400 µl×575 ml32 ml×225 ml1份产品储存1.蛋白酶K贮存液和Carrier RNA请置于-20℃贮存。
2.其他试剂与物品如果储存于室温（15~25℃），可在两年内保持使用性能无明显变化；如果将产品贮存于2~8℃，可延长产品的有效期至两年以上。
技术支持杭州新景生物试剂开发有限公司研发部产品介绍本产品适合从血浆、全血、无细胞体液（包括血浆、血清、尿液、CSF及细胞培养上清）、病毒原液和感染病毒的组织中提取各种病毒RNA或病毒DNA。
用本试剂盒最高可从病毒拷贝数为50copies/ml的体液样品（DNA病毒）中检测到病毒核酸。
与传统的煮沸法提取病毒DNA相比，检测灵敏度可提高10-50倍；与传统Trizol法提取病毒RNA相比，检测灵敏度可提高5-10倍。
被溶解的病毒中的核酸结合到纯化柱上后，Buffer WBR洗涤去除残留在纯化柱上PCR抑制物，然后用Buffer TE洗脱，即可用于PCR或RT-PCR反应。
用户需自备的试剂与物品1．无水乙醇2．1.5ml离心管（推荐选用DNase-free & RNase-free的1.5ml离心管）3．移液器吸头（为避免样品间的污染，请选用含有滤芯的DNase-free & RNase-free移液器吸头）4．一次性手套及防护用品和纸巾5．台式小量离心机（可配离心1.5ml离心管和2ml离心管的转子）6．水浴锅与旋涡震荡器7．可能需要生理盐水使用前准备1）如果离心机有制冷功能，请将温度设置到25℃。
hpv 基因分型检测项目介绍(检验科)
HPV检测在治疗后的随访过程中可提示治疗效果
HPV检测灵敏度明显高于细胞学检查
对经组织学诊断为CIN2 及以上病变检测的灵敏度： 细胞学检查仅为55%， HPV检测的高达96%。
HPV检测——ASCUS的分流处理首选
2006 consensus guidelines for management of women with abnormal cervical cancer screening tests European guidelines for quality assurance in cervical cancer screening: recommendations for clinical management of abnormal cervical cytology, part 1. Cytopathology 2008, 19, 342–354
有效避免假阴性带来的漏检
单次检测标本量可达96份
效率高
所需仪器设备简单、通用性好 技术平台通用
投入低，各级实验室均适宜
该技术平台除了可以开展HPV基因分 型外，还可以开展HBV分型与耐药检 测，结核分枝杆菌耐药检测等分子诊 断项目，提供医院整体诊断水平
业界肯定
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问题？
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HPV 基因分型检测流程
结果判读
单一感染 多重感染 阴性样本
HPV18 HPV35,59,66
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HPV 基因分型检测主要仪器设备
试剂准备区 标本制备区 PCR扩增区
冰箱
冰箱 离心机 微量加样器 生物安全柜 （或超净工作台） 电磁炉（水浴锅 或干式恒温器） 旋涡混合器
PCR仪
HPV检测方法
FDA认证的三种HPV检测技术
2009年 Cervista HPV-Invader 酶切信号放大法 Cobas 4800-实时荧光定量PCR技术 2012年 Aptima-RNA 逆转录扩增法
Cervista HPV-DNA检测
在等温反应，有Cleavase酶特异性识别并切割分子 结构， 通过分子杂交和化学信号放大，从而直接检 测特定的HPV-DNA核苷酸序列。
HPV DNA检测标准操作程序
入空白对照、阳性质控、阳性DNA对照，建议加样编号顺序如下：首先依次是不同的样本编号，最后为阳性质控、阳性DNA对照、与空白对照管（蒸馏水）。
6.2.3 从冰箱中取出PCR试剂盒，将PCR Premix融化后，与Taq酶管一起放入离心机中点动离心。
6.2.4 将试剂放入生物安全柜内，将已点动离心了的PCR premix管、Taq酶管插在冰块上保持在低温条件下。
6.1.6 按照反应数计算所需的PCR各个组份的数量来准备PCR Mastermix（可参照PCR MIX与酶混合比例如下表）。
6.2.7 在生物安全柜内，按已计算好的PCR premix用量，从冰中取出相应的PCR premix管吸取准确量后加入对应的1.5ml离心管中，将PCR premix管放回冰块中。
6.2.8 垂直将枪头小心打入废液缸中，确保移液枪前臂没有碰到废液缸口。
6.2.9 从冰中取出Taq酶管，按计算好的用量（可参照PCR MIX与酶混合比例附表），吸取准确量后分别加入对应的1.5ml离心管中。
6.2.10 盖紧1.5ml离心管盖，同时将PCR premix管及Taq酶管从超净台中取出放回-20℃冰箱的原包装中，标注已使用数量。
6.2.11 将已加入PCR premix和Taq酶的1.5ml离心管在涡旋器上振荡5sec，放入离心机点动离心。
6.2.12 在生物安全柜中，将6种PCR混合液分装入对应的0.2ml PCR扩增管中，每管加入混合液18ul，加完后将所有PCR管盖盖上。
6.3 DNA提取6.3.1将临床样本及阴性对照品置室温下解冻，把标本编号，取出相应数量的样本管，对应编号。
6.3.2 将临床样本振荡混匀，伸入采集管底部吸取临床样本0.8ml 至管底，。
人乳头瘤病毒全基因组分型参考品说明书
本参考品未经批准，说明书仅供参考版本号： V1.0中国食品药品检定研究院人乳头瘤病毒全基因组分型参考品National reference materials for the complete genome of HumanPapillomavirus genotyping【类别】体外诊断试剂参考品 【批号】370060-201901【性状】无色液体【用途】本参考品由病毒培养物和HPV全基因组质粒组成，适用于以非L1区域如E6、E7区域和全基因组为靶序列的人乳头瘤病毒核酸（基因分型）检测试剂盒的质量控制和评价，包括但不限于PCR-荧光探针法、PCR反向杂交法、基因芯片法、恒温扩增法、杂交捕获法、酶切信号放大、测序法等方法学原理。
【组成和规格】此参考盘组成为28支/套，包括23个不同型别的HPV参考品和5个HPV阴性参考品（分别为CMV、HSV-1、CT、GBS和UU），详细信息见下表。
参考品类型型别浓度(IU/ml) 规格 高危型HPV 参考品HPV16 1.49×107100μl/支 HPV18 6.52×106 100μl/支 HPV31 7.49×106 100μl/支 HPV33 6.55×106 100μl/支 HPV35 9.31×106 100μl/支 HPV39 6.63×106 100μl/支 HPV45 3.87×106 100μl/支 HPV51 5.18×106 100μl/支 HPV52 7.30×106 100μl/支 HPV56 1.02×107 100μl/支 HPV58 4.10×106 100μl/支 HPV59 5.57×106 100μl/支 HPV66 8.51×106 100μl/支 HPV68 8.72×106 100μl/支 潜在高危型HPV 参考品HPV26 1.45×107 100μl/支 HPV53 9.00×106 100μl/支 HPV735.72×106100μl/支本参考品未经批准，说明书仅供参考版本号： V1.0中国食品药品检定研究院HPV82 8.79×106100μl/支 低危型HPV 参考品HPV6 1.10×107100μl/支 HPV11 1.49×107 100μl/支 HPV42 9.78×106 100μl/支 HPV43 7.56×106 100μl/支 HPV81 1.30×107100μl/支 HPV 阴性参考品NC1 / 500μl/支 NC2 / 500μl/支 NC3 / 500μl/支 NC4 / 500μl/支 NC5/500μl/支注： 82和ISO39、MM4等同。
人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测试剂申报要求及常见问题解析申报要求及常见问题解析
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预期用途—限定性要求
高危型界定：
HPV 基因型 16 18 26 31 33 35 39 45 51 52 53 56 58 59 66 68 73 82 √√ △ √ √ √ √√ √ √ △ √√ √ △ √ △ △
要求：13型高风险（+5型中度风险） 其他型别：提供依据。
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• 综述资料
• 主要原材料&生产工艺、反应体系 • 分析性能评估&稳定性评价 • 阳性判断值
• 临床试验
• 产品技术要求&说明书
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综述资料
有关临床适应症背景情况的描述 生物安全性
同类产品比较
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要点
• 适用范围
• 综述资料
• 主要原材料&生产工艺、反应体系 • 分析性能评估&稳定性评价 • 阳性判断值
预期用途—限定性要求
基因分型的考虑 对HPV阳性结果的分流（如16、18型）
验证临床意义 用于流行病学调查、疫苗评价、科学研究
不建议盲目扩大分型范围
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预期用途—方法学
PCR-荧光探针法 杂交捕获法
PCR-杂交法
其他：酶切信号放大法等。
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要点
• 适用范围
HPV基因型均应具有一定的阳性例数。
不同的样本采集方式：
同源样本的比较研究试验，2家以上（含两家
）临床试验机构，样本例数不少于100例。
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临床试验
统计学分析
拟申报产品
阳性 对比方法/测序 阳性 阴性
总计
阴性
可检测到 不可检测到 总计
基因分型检测试剂：不同基因型分别统计
7.人乳头瘤病毒核酸分型检测-透景
1.Intended Use目的通过病毒核酸扩增定性检测人体宫颈脱落细胞中人乳头瘤病毒分型。
2.Sphere of Application适用范围人乳头瘤病毒分型定性检测。
3.Principle of T est检验方法及原理采用多重PCR技术对检测样品的核酸DNA进行扩增，并用包被有核酸探针的多种编码微球和扩增产物进行杂交，结果用流式阵点仪检测分析。
流式荧光杂交法是将PCR扩增产物盒微球液进行混和，并经过杂交、荧光素标记、Luminex流式分析仪阅读得到相应的检测结果。
微球杂交液中包含多种荧光编码微球，每种荧光荧光编码微球的表面都共价交联有与亚型对应的寡核苷酸探针，在杂交过程中探针特异性识别并结合PCR产物中的靶序列，经过和荧光素反应后形成微球-探针-扩增产物-荧光素的复合物，经Luminex流式分析仪阅读时，可获得每种复合物的微球编码及其对应的荧光强弱信号，最后经过透景HPV专用的分析软件判读相应的检测结果。
4.Specimen Collection使用的样本4.1.样本种类：阴道或尿道分泌物。
4.2.收集方法：医护人员先以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去。
取出宫颈刷置于宫颈口，单方向旋转4-5周以获得足量的上皮细胞样本，然后将宫颈刷头部放入洗脱管中，沿刷柄折痕处将宫颈刷柄折断，旋紧洗脱管盖，做好样本标识，保持洗脱管直立放置。
4.3.病人准备要求：月经正常妇女，在月经来潮后10-18天为最佳检查时间；检查前三天内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物；检查前24小时不应有性行为；检查前不进行醋酸或碘液涂抹。
4.4.样本容器的要求：专用样本保存液的容器。
4.5.样本用量：50-200μl，应保证有足够的量用于检测。
4.6.拒收样本的规定：除阴道或尿道分泌物以外的样本，应予以拒收。
4.7.样本的处理方法：高速冷冻离心机13000转/min离心5min备用。
4.8.样本的储存规定：4.9.样本的外送规定：4.9.1.仪器故障不能立即维修及试剂断货导致不能在报告周期内准时发出检测报告时，样本可外送至其他有医疗资质的单位进行检测。