培训课件：菌落总数的测定GB4789.2-2010-

计数琼脂培养基注入平皿约15～20ml，并转动平 皿，使其混合均匀。
（二）培养
1.1琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。
水产品30℃±1℃培养72h±3h。
1.2如样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌
落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基 （约4毫升），凝固后培养。
即：样品原液和所有稀释度平板均无菌生长，以<1
乘以最低稀释倍数计算
1. 6、若所有稀释度的平板菌落数均不在30～300CFU
之间（其中一部分>300或<30）时，则以最接近300 或30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
即：所有稀释度平板菌落数均不在均不在30～300之
间有些>300，有些<30，则以最接近30～300的平均 菌落数乘以稀释倍数计算。
如样品ph值较低，建议使用磷酸盐缓冲液，以免影响
培养基的凝胶强度。
1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL
磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预臵 适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样 品匀液。
常见做法：以无菌操作取检样25g（mL），放于 225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液 的灭菌玻璃 瓶内（瓶内预臵适量的玻璃珠）或均质袋内，经充 分振荡或拍击制成1:10的均匀稀释液。
菌落总数计算公式的改变
统计学依据：
平板菌落数越多，结果越具有代表性；
（不考虑稀释倍数和培养基的营养状况等） 取样量越大，结果越具有代表性； （同等取样条件、排除其他方面的干扰因素）
计算范例1
稀释度 菌落数 1:100（第一稀释度） 232，244 1:1000（第二稀释度） 33，35
N
C
( n1 0.1n2 ) d
232 244 33 35 544 24727 25000 2 2 [2 (0.1 2)]10 2.2 10
计算范例2
稀释度 菌落数 1:100（第一稀释度） 232，244 1:1000（第二稀释度） 33，29
本例中，n1 2而n 2 1，
二、试验材料
1、 食品检样
2、 培养基和试剂
2.1平板计数琼脂培养基；
2.2无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液
3、 设备和器具 无菌培养皿、无菌吸管/移液枪及无菌枪头、电磁炉、 均质器、电子天平、恒温培养箱、生物安全柜、冰箱、 蒸汽灭菌器等。
三、试验流程
1、检样
2、做几个适当倍数的稀释液
3、选择2~3个适宜稀释度各1 mL,分别加入灭

4 检样稀释： 4.1检样稀释时，应以无菌操作称取或量取有代表性在 样品25g（25mL）臵225mL灭菌稀释液中。固体样品应 剪碎，以拍打式样品处理器做成样品悬液（1：10）。 4.2根据食品卫生标准和对样品污染情况的估计，再进 行10倍递增稀释。注意每递增稀释一次，必须另换1支 吸管，以保证样品稀释倍数的准确性。 4.3从吸管筒内取出灭菌吸管时，注意不要将管尖碰到 手或其他沾污物可能触及的部位。（如玻璃瓶口、试 管品、仍留在容器内的吸管的外露部分）。
五 菌落总数的报告方法
1、菌落数在< 100CFU时，按四舍五入原则修约，以
整数报告。 2、菌落数≥ 100CFU时，第3位数字按四舍五入修约 后，取前面两位有效数字，后面用0代替位数，也可 用10的指数形式来表示，按四舍五入原则修约后， 采用两位有效数字。
3、若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落
应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌 落分开计数。
四、结果与报告
1、菌落总数的计算方法： 1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜 计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值， 再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL） 样品中菌落总数结果。

1.2、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围
内时，按下列公式计算： N = ∑C / [n1 + (0.1 × n2) ] × (d) N ： 样品中菌落数 ∑C ：含适宜范围CFU的平板菌落数之和 n1：适宜范围菌落数的第一稀释度（低稀释度）平板个数 n2：适宜范围菌落数的第二稀释度（高稀释度）平板个数 d： 第一稀释度（低稀释度）
公式使用的前提：有两个连续稀释度在适宜计数范围内 （30～300个菌落数）
菌落计数 报告
四、 试验步骤
1 样品的稀释： 1.1固体和半固体样品：称取25g （mL）样品至盛有 225 mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌均质杯内， 8000r/min～10000 r/min均质1min～2min，或放入盛有 225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1min～2min，制成1:10的样品匀液。
食品卫生微生物学检验
菌落总数测定
Gb4789.2-2010
平板计数法
一、定义
1 菌落（colony）： 是指细菌在固体培养基上经培 养后生长繁殖而形成的能被肉眼所识别的生长物集 落，它是由数以万计的相同细菌集聚而成的。
2菌落总数：是指食品检样经过处理，在一定条件下
(如培养基、培养温度和时间)培养后，所得1g或 1mL检样中形成的微生物菌落总数。以 CFU/g （mL）来表示。
即：所有平板菌落数均>300，则计最高稀释度平
板的菌落数
1.4、若所有稀释度平板菌落数均<30，则应按稀释
度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
即：所有平板菌落数均<30 ，则计最低稀释度平板
的菌落数 1.5、若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无 菌落生长，则以<1乘以最低稀释倍数计算。

计数规则 1
选取菌落数在30cfu～300cfu之间、无蔓延菌落 生长的平板计数菌落总数。
低于30cfu的平板记录具体菌落数； 大于300cfu的可记录为多不可计； 每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
计数规则2： 有较大片状菌落生长的平板，不宜采用，应以无片
状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数； 若片状菌落不到平板的一半，而另一半平板菌落分 布又很均匀，则可以计算分布均匀的半个平板上的 菌落数，再乘以2，以代表一个平板的菌落数。
计数规则3： 当平板上出现菌落间无明显界限的链状生长时，
则将每条单链作为一个菌落计。
注意：如存在有几条不同来源的链，则每条链均
2、采样的代表性 如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多 采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体 样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。

3、稀释液 样品稀释液主要是灭菌生理盐水，或磷酸盐缓 冲液，后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保 护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀 释，可以采用灭菌蒸馏水。
C 菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，也不能
区分其中细菌的种类，只包括一群在计数平板琼脂中 生长发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数， 所以有时被称为杂菌数、需氧菌数等。

3、区分定义：细菌总数
指一定数量或面积的食品样品．经过适当的 处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包 括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称 细菌直接显微镜数。通常以1 g或1 mL样品中的细 菌总数来表示。
过高会造成已受损伤的菌细胞死亡，影响细菌生长， 过低琼脂易于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水浴， 应以皮肤感受较热而不烫为宜。
b倾注的厚度：直径9cm的平皿一般要求15~20mL培养
基，一般以15ml较为适宜。 平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。若培养基太 薄，在培养过程中还可能因水分蒸发而影响细菌的生 长。 倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免 与菌落混淆而影响计数观察。
1.3、用1 mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，沿
管壁徐徐注入含有9 mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓 冲液的试管内（注意吸管或吸头尖端不要触及稀 释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹 打使之混合均匀，制成1:100的稀释液。
1.4 按上述操作制备10倍系列稀释样品匀液。
每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。
N C ( n1 0.1n2 ) d
232 244 33 509 24238 24000 2 2 [2 (0.11)]10 2.110
1.3、 若所有稀释度的平板菌落数均>300，则对
稀释度最高的平板进行计数，其他平板可以记录 为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍 数计算。

a 在GB4789.2-2010的培养条件下所得结果，只 包括一群在平板计数琼脂上生长的嗜中温需氧 或兼性厌氧菌的菌落总数。
b 按国家标准方法规定，即在需氧情况下， 36
±1℃培养48±2 h，能在平板计数琼脂上生长发育 的细菌菌落总数。所以厌氧或微需氧菌、有特殊营 养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能 满足其生理需求，故难以繁殖生长。
蔓延。
4、 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 5、称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以
CFU/mL 为单位报告。
记录方式
样品 稀释液及 菌落数 选择稀 释度 报告(CFU/g,ml)
10-2 10-3 10-4
原始
计算公式
报告
样品 名称
数据
平均
报告方式
编号
1
菌落总数
95.5
4 菌落总数测定的卫生学意义 食品本身的新鲜程度 加工储存运输过程中是否受到污染—卫生质量 卫生学指标：必须配合大肠菌群的检验和其他病原
菌项目的检验，才能做出比较全面准确的评定。
---菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一 方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学 评价时提供依据。 --食品中细菌菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品 质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须 配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较全面的评价。