兽用灭活纯化狂犬病疫苗生产工艺的优化_吕宏亮

【预防制品】
兽用灭活纯化狂犬病疫苗生产工艺的优化
吕宏亮 1* 王栋 2* 杨培豫 3 张万林 4 何海蓉 3 付秀花 4 崔松奇 4 程婷 4 高彤民 4 杨晓明 1 胡启毅 3
【 摘要 】 目的 优化兽用灭活纯化狂犬病疫苗的生产工艺。方法 建立 BHK21 C13 细胞主细胞库、工作细胞库，狂犬病 病毒疫苗株 LEP-Flury 主种子批、工作种子批，并进行鉴定。优化悬浮培养工艺参数，并分析病毒原液浓缩、纯化和灭活过程中抗 原及成品的稳定性。结果 主细胞库、工作细胞库无外源因子污染，细胞形态、生长良好；狂犬病病毒主种子批和工作种子批无 外源因子污染，病毒滴度最高可达 107.8 logLD50 ／ ml。采用 15 L 生物反应器，在优化的培养工艺条件下，细胞密度可达 4. 5 × 106 个 ／ ml， 病毒按 0. 3 MOI 接种，灌流培养 5 次，病毒滴度平均可达 106. 8 logLD50 ／ ml。病毒原液合并后，经 750 KD 中空纤维柱 30 倍浓缩， Sepharose Fast Flow 6 层析柱纯化，1 ／ 4 000 β-丙内酯灭活，期间加入稳定剂，纯化疫苗效价平均达（5. 03 ± 1. 84）IU ／ 头份，纯 化的抗原量达（11. 75 ± 0. 70）μg ／ 头份，在 4℃可保存 24 个月，在 37℃可保存 30 d，在 45℃可保存 12 h。结论 优化的兽用灭 活狂犬病疫苗的生产工艺可提高疫苗的安全性、有效性及稳定性。
* 共享第一作者 通讯作者：胡启毅，E-mail：huqy@
活疫苗。减毒活疫苗能够模拟自然感染，诱发机体的 全身免疫，但有返祖的危险。灭活疫苗安全性好，但 免疫原性较差。灭活疫苗的细胞残余 DNA 存在潜在 的致癌性，牛血清白蛋白等可引发不良反应，液体疫 苗稳定性较差，这些问题影响了灭活疫苗的使用及 免疫效果。本文对灭活纯化狂犬病疫苗生产工艺中 影响疫苗安全性、有效性及稳定性的因素进行了分 析，现将结果报道如下。
狂犬病病毒疫苗株 LEP-Flury 第 6 代，由中国 兽医药品监察所鉴定、保管、分发，用于疫苗的制备； 主种子批和工作种子批毒株各传 5 代，分别按 WHO［5］ 和《中国药典》三部（2005 版）要求进行各项质量指 标检测，合格的疫苗株种子批置-80℃保存备用。 1. 3 实验动物
昆明种小白鼠，清洁级，购自北京实验动物中心。 毒力测定采用 9 ～ 11 g 小鼠，安全性检测采用 11 ～ 13 g 小鼠，效力测定采用 12 ～ 14 g 小鼠。 1. 4 主要试剂及仪器
对微载体 Cytodex3 浓度、培养基种类、培养模 式、血清浓度进行优化，并分析其对 BHK21 C13 细 胞密度、形态及代谢的影响。5 ml 悬浮培养细胞液离 心后，用 PBS 洗涤 3 次，加入 5 ml 染色液（含 0. 1 mol ／ L 枸橼酸、0. 1%结晶紫和 0. 1% Triton X-100），37℃孵
每个批次的病毒原液在浓缩、纯化、灭活时，加 入终浓度为 0. 5%的甘氨酸、1%的山梨醇作为稳定 剂［6］，检测病毒滴度、抗原效价，并与未加稳定剂的 样品进行比较。毒力检定合格的病毒液合并后，用 0. 45 μm 的中空纤维柱进行澄清，经 100、500 和 750 kD 的中空纤维柱 30 倍浓缩，浓缩前后测定病 毒毒力、牛血清白蛋白含量及病毒液抗原含量。采用 Sepharose 6 FF 凝胶介质层析，平衡液及洗脱液均 为 0. 02 mol ／ L 的 PBS，收集第 1 峰，即为纯化的病 毒液［7］。将 β-丙内酯按 1 ／ 4 000（v ／ v）终浓度加入 纯化的病毒液中，4℃灭活 16 h，37℃水解 2 h，进行 效力试验［8］。 1. 8 病毒液及成品检定
【Abstract】 Objective To optimize the production procedure for inactivated purified rabies vaccine for animal use. Methods The master and working BHK-21 CB cell banks as well as mater and working seed lots of rabies vaccine virus strain LEP-Flury were established and identified, the parameters of suspension culture procedure were optimized, and the stabilities of antigen during con － centration, purification and inactivation and final product were analyzed. Results Both master and working cell banks were free from contamination with adventitious factors, and the morphology and growth of cells were normal. Both master working virus seed lots were free from contamination with adventitious factors, and the virus titer reached 107. 8 logLD50 ／ ml at most. The cell density cultured in 15 L bioreactor under optimized condition reached 4. 5 × 106 cells ／ ml. The mean titer of virus inoculated at a MOI of 0. 3 and in－ cubated by 5 rounds of perfused culture reached 106. 8 logLD50 ／ ml. After the virus bulk was pooled and 30-fold concentrated with a 750 KD hollow fiber column, then purified by Sepharose Fast Flow 6 chromatography and inactivated with 1 ／ 4 000 β-propiolactone, during which stabilizer was added, the obtained purified vaccine reached a mean titer of （5. 03 ± 1. 84） IU ／ dose and an antigen content of（11. 75 ± 0. 70）μg ／ dose, and showed good stability after storage at 4℃ for 24 months, at 37℃ for 30 d and after 45℃ for 12 h. Conclusion By the optimized production procedure, the safety, effectiveness and stability of inactivated rabies vaccine for ani － mal use were enhanced.
将 BHK21 C13 细胞接种于 15 L 转瓶中培养， 待细胞长成单层，细胞浓度达 0. 5 × 106 个 ／ ml 时， 用胰酶消化，收集，经 1 000 × g 离心 5 min，重悬于 新鲜细胞培养液中，取 2 × 109 个细胞，接种生物反 应器。悬浮培养阶段主要参数为：pH 7. 2，DO 50%， 温度 37℃，转速 30 r ／ min。2 d 后循环培养，接种约 24 h 后采用循环加液。病毒接种时，停止灌注。病毒 培养阶段主要参数为：pH 7. 4，DO 30%，温度 34℃， 转速 30 r ／ min。接种病毒 2 h 后，开始灌注，按 3. 0 L ／ d 进行灌注培养，每天取样测定细胞密度、细胞活力、 葡萄糖、乳酸及铵的浓度，观察细胞病变，并检测病 毒滴度。 1. 6 细胞培养条件的优化
【关键词】 兽用狂犬病疫苗；生物反应器；生产工艺；稳定性
Optimization of Production Procedure for Inactivated Purified Rabies Vaccine for Animal Use
LU Hong-liang △, WANG Dong, YANG Pei-yu, et al （△Wuhan Institute of Biological Products, Wuhan 430060, China）
【Key words】 Rabies vaccine for animal use; Bioreactor; Production procedure; Stability
狂犬病是一种严重的动物疫源性疾病，每年可 致全世界 4 万 ~ 7 万人死亡［1］，每年至少有 1 千万 人进行暴露后预防［2］。家犬是狂犬病病毒的主要贮 存宿主和传播媒介，99%人的狂犬病病例均来源于 狗的咬伤。尽管狗的狂犬病在发达国家已得到有效 控制，但仍有 80 多个发展中国家流行狗的狂犬病［3，4］。
DOI：10.13200/j.cjb.2009.09.48.lvhl.004
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中国生物制品学杂志 2009 年 9 月第 22 卷第 9 期 Chin J Biologicals September 2009，Vol. 22 No. 9
中国图书分类号 R94 Q813 文献标识码 A 文章编号 1004-5503（2009）09-0882-05
细胞培养基 MEM（Hanks 盐，含非必需氨基酸） 购自 Invitrogen 公司；胎牛血清（FCS）、M199 和胰蛋 白酶均购自 Thermo-Fisher 公司；葡萄糖浓度检测试 剂盒购自瑞士 Chrenolab 公司；乳酸浓度测定试剂盒 826-UV 和铵浓度试剂盒 171-UV 均购自美国 Sigma 公司；15 L 生物反应器（工作体积 11 L）购自荷兰 Ap－ plicon 公司；微载体 Cytodex3、中空纤维柱、Sepharose 6 FF 凝胶介质和 INDEX20 ／ 100 层析柱均购自 GE 公司。 1. 5 细胞及病毒培养