凝胶层析法
凝胶层析法(凝胶过滤)脱盐和分离蛋白质-1
凝胶层析法(凝胶过滤)脱盐和分离蛋白质-1原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。
脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。
前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。
所以，要根据具体情况选择使用。
凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。
凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatograph y）、分子筛过滤（molecularsieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。
它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。
其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。
网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。
人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。
凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。
分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。
这样被分离物质即被按分子的大小分开。
用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio–gel）及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。
凝胶层析实验报告结论
一、实验目的本次实验旨在通过凝胶层析技术，对混合溶液中的不同组分进行分离，验证凝胶层析法的原理，并探讨影响分离效果的因素。
二、实验原理凝胶层析是一种基于分子筛效应的分离技术。
凝胶作为一种具有多孔结构的材料，其孔径大小可以调节，从而实现对不同分子量物质的分离。
实验中，混合溶液中的组分通过凝胶层析柱时，分子量较大的物质由于无法进入凝胶孔道，只能沿着凝胶颗粒之间的缝隙流出，而分子量较小的物质则可以进入凝胶孔道内部，从而在凝胶层析柱中停留更长时间，最终实现分离。
三、实验结果与分析1. 实验现象（1）观察实验过程中，不同组分在凝胶层析柱中的洗脱顺序。
根据实验结果，分子量较大的组分先流出，而分子量较小的组分后流出。
（2）观察凝胶层析柱中凝胶颗粒的吸附情况。
实验过程中，凝胶颗粒对分子量较大的组分吸附作用较弱，而对分子量较小的组分吸附作用较强。
2. 实验数据分析（1）通过计算不同组分的洗脱时间，可以得出其分子量大小。
实验结果表明，分子量较大的组分先流出，而分子量较小的组分后流出，与理论预期相符。
（2）分析凝胶层析柱中凝胶颗粒的吸附情况，可以发现分子量较小的组分在凝胶层析柱中停留时间较长，说明凝胶颗粒对其吸附作用较强。
四、实验结论1. 凝胶层析法可以有效地对混合溶液中的不同组分进行分离，实现不同分子量物质的分离。
2. 凝胶层析法的分离效果受分子量大小、凝胶孔径、洗脱液等因素的影响。
在本实验中，分子量较大的组分先流出，而分子量较小的组分后流出，与理论预期相符。
3. 凝胶层析柱中凝胶颗粒对分子量较小的组分吸附作用较强，导致其在凝胶层析柱中停留时间较长。
4. 实验过程中，凝胶层析柱的装填、洗脱液的选择、流速的控制等操作对实验结果有较大影响。
在实际操作中，应严格控制实验条件，以提高分离效果。
五、实验展望1. 在今后的实验中，可以尝试改变凝胶孔径、洗脱液等因素，进一步优化实验条件，提高分离效果。
2. 探索凝胶层析技术在生物、医药、化工等领域的应用，为相关领域的研究提供技术支持。
凝胶层析_实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理和操作方法。
2. 掌握凝胶层析分离混合物中不同组分的基本技能。
3. 分析实验结果，验证实验原理。
二、实验原理凝胶层析是一种基于分子筛效应的分离技术。
该技术利用凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛，分子量不同的物质通过凝胶柱的速度也不同。
在凝胶层析实验中，样品被注入凝胶柱，随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱，从而实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：混合样品、葡聚糖凝胶、洗脱液（如蒸馏水、乙醇等）。
2. 实验仪器：凝胶层析柱、注射器、恒流泵、收集器、滤纸、烧杯等。
四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱，轻轻敲打柱底，使凝胶均匀分布。
2. 洗脱液平衡：将凝胶层析柱放入盛有洗脱液的烧杯中，使凝胶充分浸泡。
3. 样品制备：将混合样品与洗脱液按一定比例混合，制成样品溶液。
4. 注射样品：将样品溶液注入凝胶层析柱。
5. 收集分离组分：随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱。
将收集器放置在凝胶柱下方，收集分离组分。
6. 分析实验结果：观察收集到的组分，分析实验结果。
五、实验结果与分析1. 分离效果：通过凝胶层析实验，成功分离出混合样品中的不同组分。
2. 分组情况：根据收集到的组分，分析其分子量大小，确定分离效果。
3. 实验原理验证：实验结果表明，凝胶层析能够有效分离混合物中的不同组分，验证了实验原理。
六、实验讨论1. 凝胶层析的原理：凝胶层析的原理是基于分子筛效应，通过凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
2. 影响分离效果的因素：实验过程中，洗脱液的种类、流速、凝胶的孔径等因素会影响分离效果。
在实验中，应严格控制这些因素，以确保分离效果。
3. 实验结果分析：通过分析实验结果，可以了解不同组分在混合样品中的含量和分子量大小，为后续研究提供数据支持。
生物制药：凝胶层析法
像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干 粉，它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在 溶剂中能自动溶胀成胶。
根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不 同，可分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿 拉伯数字表示，从Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P 后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度（按球 蛋白或肽计算）。目前，美国Bio-Rad Laboratories 生产并出售多种规格的Bio-Gel P。
葡聚糖凝胶（G类）的规格
25
葡聚糖凝胶（G类）特点
1、孔径。 2、稳定性。 3、吸附作用。 4、芳香族化合物和杂环化合物。
26
性质与特点
1、Sephadex在水、盐、碱、弱酸以及有机溶 液中都比较稳定，可以多次重复使用。
2、稳定工作pH为2－10，强酸溶液和氧化剂 会使交联的糖苷键水解断裂。
3、在高温下稳定，可煮沸消毒，在100 °C下 40 min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。
如引入磺乙基（SE-Sephadex）、羧甲基（CM-Sephadex） 及二乙胺基乙基（DEAE-Sephadex A）等。葡聚糖凝胶离子交 换剂具有离子交换和分子筛双重作用。其结构多孔、疏松、非 特异性吸附很少，层析时流速易控制，特别适用于蛋白质、酶、 激素、多核苷酸等的分离纯化，以及生化制剂的除热原。
最后流出物质C，它分子量最小，其分子可 以自由进出凝胶颗粒， “全渗入”。流经 体积是外水体积与内水体积之和V0+Vi。
物质B分子量介于渗入限与排阻限之间，其
分子能够部分地进入凝胶颗粒中。 “部分
排阻”或“部分渗入”。流径体积Ve是全部 外水体积加上内水体积的一部分，即
Ve=V0+KdVi
凝胶层析法专题培训
4．聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶也是一种人工合成凝胶，其 商品名为生物凝胶P（Bio-gel-P），和交联 葡聚糖一样，为颗粒状干粉，在溶剂中能自 动吸水溶胀成凝胶。其由单体丙烯酰胺
和交联剂甲叉双丙烯酰胺
经过自由基引起聚会形 成聚丙烯酰胺凝胶。
（见下图）。只要控制单体用量和交联剂 旳百分比，就能得到不同型号旳凝胶。
3．葡聚糖凝胶离子互换剂
在G类凝胶上引入某些酸性或碱性基团后， 则制得多种葡聚糖凝胶离子互换剂 。
如引入磺乙基（SE-Sephadex）、羧甲基 （CM-Sephadex）及二乙胺基乙基（DEAESephadex A）等。葡聚糖凝胶离子互换剂具有 离子互换和分子筛双重作用。其构造多孔、疏 松、非特异性吸附极少，层析时流速易控制， 尤其合用于蛋白质、酶、激素、多核苷酸等旳 分离纯化，以及生化制剂旳除热原。
像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒 状旳干粉，它有十分明显形成块状并粘附在一 起旳倾向，在溶剂中能自动溶胀成胶。
根据聚丙烯酰胺凝胶旳溶胀性质和分离范 围旳不同，可提成10种类型。多种类型均以英 文字母P和阿拉伯数字表达，从Bio-Gel P-2至 Bio-Ge1 P-300。P背面旳阿拉伯数字乘以1000 即相当于排阻程度（按球蛋白或肽计算）。目 前，美国Bio-Rad Laboratories生产并出售多 种规格旳Bio-Gel P。
式中Ve为脱体积，它涉 Kd为每个溶质分子在流动相和固定相之间旳 一种特定旳分配系数，它只与被分离物质分 子大小和凝胶颗粒内孔隙大小分布有关。Kd 可经过试验由Ve、Vo和Vi求得。
Ve＝Vo＋Kd.Vi
可改写为：
（Ve-Vo） Kd=－－－－
一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使 流量增长，移动速率慢而最终流出层析柱。 而中档大小旳分子，它们也能在凝胶颗粒 内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子 物质与小分子物质之间被洗脱。这么，经 过层析柱，使混合物中旳各物质按其分子 大小不同而被分离。
凝胶层析法的原理及应用
凝胶层析法的原理及应用原理凝胶层析法是一种分离和纯化生物大分子的常用方法。
它利用凝胶的孔隙结构和生物大分子的大小、形状、电荷等特性来实现分离。
凝胶通常是由聚丙烯酰胺、琼脂糖等材料制成，形成了一种类似于海绵状的结构。
在凝胶层析法中，样品首先加载到凝胶柱或凝胶板上，然后通过加入缓冲液，使样品在凝胶中进行扩散。
扩散的速率取决于生物大分子的特性和凝胶的孔隙大小。
较大的分子会更慢地扩散，而较小的分子则会更快地扩散。
分离的原理基于这样的事实：样品中的生物大分子在凝胶中扩散并与凝胶中的孔隙进行互相排斥。
较大的分子会受到较大的阻力，因此在凝胶中停留的时间更长。
而较小的分子则会更快地通过凝胶孔隙。
通过调整凝胶的孔隙大小和选择合适的缓冲液pH值、离子强度等条件，可以实现按照分子大小和形状的分离。
应用凝胶层析法广泛应用于生物化学、分子生物学、蛋白质组学等领域的分离和纯化工作。
以下是一些常见的应用：1.蛋白质分离与纯化：凝胶层析法是蛋白质分离与纯化的常用方法之一。
可以根据不同的分子量选择不同的凝胶柱或凝胶板，实现蛋白质按照分子量的分离纯化。
2.DNA/RNA分离和纯化：凝胶层析法也可以用于DNA和RNA的分离和纯化。
通过选择合适的凝胶孔隙大小和调整缓冲液条件，可以实现不同大小的DNA/RNA分子的分离和纯化。
3.脱盐和浓缩：在凝胶层析过程中，可以通过透析和洗涤步骤去除样品中的盐和其他杂质。
此外，也可以利用凝胶的亲水性来浓缩目标分子。
4.药物分子筛选：凝胶层析法也可用于药物分子筛选。
通过以目标分子为模板，筛选出与其有特异性亲和力的分子。
5.分析性凝胶层析：凝胶层析法还可以用于生物大分子的定量分析。
通过将样品和标准分子一同加载到凝胶中，可以通过测量样品和标准分子的扩散距离来确定样品中特定分子的含量。
结论凝胶层析法是一种重要的生物大分子分离和纯化的方法。
它基于凝胶的孔隙结构和生物大分子的特性，实现了按照分子大小、形状和电荷的分离。
实验报告 蛋白质分子的测定
实验一蛋白质分子的测定─凝胶层析法一、实验原理凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。
将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，小分子可以进入凝胶内部，流苏缓慢，一直最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得以分离。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，其内部都具有很微细的多空网状结构。
凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（Sepharose），人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel-P）和葡聚糖凝胶（Sephadex G）。
其中葡聚糖凝胶是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。
将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。
Vt由V o，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+V o。
V o为“孔隙体积”、“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积；Vg为凝胶本身体积；Ve为洗脱体积，即自加入样品时算起到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积，Ve与V o及Vi之间的关系为：Ve=V o+K d Vi，；K d为样品组分在二相间的分配系数，Kd=(Ve-V o)/Vi，有效分配系数为Kav，Kav=(Ve-V o)/(Vt-V o)。
在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析的特点，与一般层析方法不同。
Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。
Ve与分子量的关系为：Ve=K1-K2logM，K1与K2为常数，M为分子量，通常用Kav代替V e，建立标准蛋白质分子式量LgM与Kav的标准曲线，称为“选择曲线”。
《凝胶层析法》课件
改进方向
提高分离速度
通过改进凝胶介质或优化操作条件，提高凝 胶层析法的分离速度。
减少小分子物质的损失
研究新型的凝胶介质和操作条件，减少小分 子物质的损失。
增强对大分子的分离效果
开发新型凝胶介质，提高对大分子物质的分 辨率。
提高温度稳定性
通过改进凝胶介质或优化操作条件，提高凝 胶层析法对温度变化的稳定性。
装柱
将凝胶颗粒装入层析柱中，确 保填充均匀。
上样
将待分离样品加入层析柱的顶 部，确保样品与凝胶颗粒充分 接触。
检测
对洗脱液进行检测，观察分离 效果。
结果分析
对收集到的洗脱液进行定性和定量分 析，确定各组分的含量和纯度。
比较实验结果与预期结果，分析实验 误差和影响因素，总结实验结论。
03
CATALOGUE
告撰写非常重要。
采用适当的统计方法处理数据
对于实验数据，应采用适当的统计方法进行处理和分析， 以得出可靠的结论。
备份实验数据
为了防止数据丢失，应将实验数据备份并保存在安全的地 方。
04
CATALOGUE
凝胶层析法实验案例
实验一：分离蛋白质
总结词
通过凝胶层析法分离蛋白质，可以获得高纯度的蛋白质样品，为后续的生化分析提供高 质量的原料。
原理
基于分子大小和形状差异，利用凝胶孔径对不同大小分子进行选择性分离，大 分子不能进入凝胶孔洞，而小分子可以进入凝胶孔洞，从而实现大小分子的分 离。
发展历程
起源
现状
凝胶层析法起源于20世纪40年代，最 初用于蛋白质的分离。
目前，凝胶层析法已成为一种广泛应 用于分离纯化技术领域的进和分离技术 的提高，凝胶层析法逐渐应用于更多 领域，如生物技术、制药、环境科学 等。
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聚丙烯酰胺凝胶的性质
生物凝胶的编号反映出它的分离界限。 如Bio-Gel P-100。
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四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ）
（一）琼脂糖凝胶
结构是由β-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖以α-1，3和β-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。
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Sepharose
琼脂糖凝胶（agarose gel）可以分离葡聚糖凝
胶和生物胶所不能分离的大分子，使凝胶层析的分
离区间扩大到大分子和病毒颗粒，其最大范围可达 相对分子质量108，但是由于琼脂有强烈的吸附作用， 给使用造成了困难，后来，基；另一组分叫琼脂糖，它不含有带电基团，
其结构是有β-D-吡喃半乳糖和3，6脱水-L-吡喃半乳 糖相结合的链状多糖。
这种琼脂糖被用来进行凝胶层析，它既具有琼脂凝 胶相同的分离区间，又没有吸附作用。但其稳定性
远不如葡聚糖凝胶和生物胶P，强酸强碱能引起结构
破坏。最好使用条件控制在pH 4～9之间，温度0～ 40℃，超出此范围,可能被破坏。
（3）分离条件缓和。
（4）应用广泛。 （5）分辨率不高，分离操作较慢。
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第二节 凝胶的结构和性质
一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) 三、聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P） 四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas) 六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
分离的目的。
（一）平衡排除理论
当溶质层流过一个填料颗料这段距离时，溶 质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。
平衡条件只是在流速很慢时的一个极端情况。
13
（二）扩散分离理论
溶质分子在流经色谱柱 的过程中，在流动相和 固定相之间没有达到平 衡，存在着流速依赖性。
聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线 的流速依赖性 1．流速为0.65ml/min； 2．流速为2.0ml/min溶剂为甲 苯
像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干 粉，它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在 溶剂中能自动溶胀成胶。 根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不 同，可分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿 拉伯数字表示，从Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P
后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度（按球
2、内水体积：指凝胶颗粒中孔穴的体积，即凝胶层析中 固定相体积。（用Vi表示）
3、骨架体积：指凝胶颗粒实际骨架体积。（用VGM表示）
4、柱的总体积：指凝胶柱所能容纳的总体积。（用VA 表 示） 5、洗脱体积：指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液 的体积。（用Ve 表示）
流动相体积
固定相体积
总体积
则：
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葡聚糖凝胶性能与编号的关系
编号 交联 吸液量 度 膨胀 速度 凝胶 孔径 分离限 凝胶 强度
大 （ Sephadex G－150 ） 小 （ Sephadex G－ 50 ）
小
大
慢
大
大
小
大
小
快
小
小
大
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葡聚糖凝胶（G类）的规格
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葡聚糖凝胶（G类）特点
1、孔径。 2、稳定性。 3、吸附作用。 4、芳香族化合物和杂环化合物。
各异。
琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝 胶。它的商品名因生产厂家不同而异。
瑞典的商品名称为Sepharose，有3种型号，即 Sepharose 2B，4B和6B（同中国相同）。阿拉伯数 字表示凝胶中干胶的百分含量。
美国的为Bio－GA，有6个型号，即Bio-G 0.5M，
。
1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯数字乘以106表 示排阻限度。
28
性质与特点
1、Sephadex在水、盐、碱、弱酸以及有机 溶液中都比较稳定，可以多次重复使用。
2、稳定工作pH为2－10，强酸溶液和氧化剂
会使交联的糖苷键水解断裂。 3、在高温下稳定，可煮沸消毒，在100 °C 下40 min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。
4、含有羟基，呈弱酸性，有可能与分离物中 的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。 但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸 附作用。 5、有各种颗粒大小（粗、中、细、超细）可 以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗 粒流速慢，但分辨率高。
英国的称为Sagavac，又分为Sagavac 2F，4F， 6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿 拉伯数字表示凝胶中干胶的百分数，F代表粉末状， C代表颗粒状。
低级醇为溶剂时，对芳香族、杂环族化合物仍有吸附作 用。但用氯仿时则可去除对上述化合物的吸附作用，而
对含羟基与羧基的化合物却有吸附作用 。
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国产Sephadex LH－20可用于分子筛层析、吸附 层析和分配层析。很适用于脂肪酸、甘油脂、类固
醇、维生素、激素类生化产品的分离。洗脱剂可用
单一有机溶剂如甲醇、氯仿等，也可用混合溶剂如 氯仿与甲醇的混合液。
代表特水量。X数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于
分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联度越小，网孔 越大，适用于分离高分子生化产品。X数字也代表凝胶的持
水量，如G-25表示1g干胶持水2.5mL，G-100表示 1g干胶持
水10mL，依次类推。
Sephadex G
编号意义： 1、吸液量； 2、溶涨时间； 3、凝胶孔径； 4、分离范围 蛋白质、多糖
14
（三）流动分离理论
红细胞在毛血细管中流动时比
血浆流得快。 较大的分子较先通过或绕过这 个填料颗粒，使溶质能按其大 小进行分离。
15
分离过程
三种不同分子量物质 的混合样品用某种规
格的凝胶柱进行分离。
样品加入，以水或其 他溶液进行洗脱，即 得洗脱曲线 。
16
分离过程
最先流出物质A，A分子量最大，完全不能 进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过， “全排阻”。其流经体积最小，等于外水体 积V0。 最后流出物质C，它分子量最小，其分子可 以自由进出凝胶颗粒， “全渗入”。流经 体积是外水体积与内水体积之和V0+Vi。 物质B分子量介于渗入限与排阻限之间，其 分子能够部分地进入凝胶颗粒中。 “部分 排阻”或“部分渗入”。流径体积Ve是全部 外水体积加上内水体积的一部分，即 Ve=V0+KdVi
交联葡聚糖离子交换剂
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（三）Supperdex系凝胶
由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成。
（四）Sephacryl系凝胶
是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共价交联
制成的。 理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭菌。
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Supperdex系凝胶
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Sephacryl系凝胶
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三、聚丙烯酰胺凝胶
17
分配系数Kd
排阻系数： 当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。
当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。
0＜Kd ＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi ，为部分渗 入。
18
物质的Kd值
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凝胶层析的特点
（1）凝胶层析操作简便，所需设备简单。
（2）分离效果较好，重复性高。
商品名为生物凝胶-P（Bio-Gel P）。 该凝胶由丙烯酰胺组成；以亚甲基双 丙烯酰胺为交联剂，聚合而成。只要 控制单体用量和交联剂的比例，就能 得到不同型号的凝胶。 特点： 1、孔径； 2、稳定性、强度； 3、无非特异吸附，保存方便； 4、编号反映出它的分离界限。
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在聚丙烯酰胺凝胶的合成过程中，单体和交联剂的配比 可以任意改变。以（T）代表100mL凝胶溶液中含有的单体和 交联剂总克数，称为凝胶浓度。而其中交联剂占单体和交联 剂总量的百分比称为交联度，以（C）表示，交联度越大，网 孔越小，交联度越小，则网孔越大。聚丙烯酰胺凝胶全是由 碳一碳骨架构成，稳定性较好，适合于做凝胶层析的载体。 只有在极端pH条件下酰胺键才被水解为羧基，使凝胶带有一 定的离子交换基团，故一般只在pH2～11的范围内使用。
31
二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex)
（ 一 ） 亲 脂 性 葡 聚 糖 凝 胶 （ Lipophilic Sephadex）
骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟丙基，
使呈亲脂性，同时保留亲水性。
这种凝胶既亲脂又亲水，可在多种有机溶剂中膨
胀。这种凝胶在pH＞2的不含氧化剂的溶液中稳定。用
第七章 凝胶层析（色谱） （Gel chromatography）
1
凝胶层析（gel chromatography）也称：
分子筛层析
分子排阻层析 凝胶过滤 凝胶色谱等
是指混合物随流动相经过凝胶层析柱时，由于 各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分 得以分离的层析方法。
简介
凝胶色谱是以各种多孔性凝胶填料为固定相， 利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同 而达到物质分离的一种技术。 突出优点是：凝胶不带电荷、吸附力弱、不 需再生处理可反复使用、操作条件温和、对分离 成分不变性和破坏、对高分子物质有很好的分离 效果。
第一节 凝胶层析的基本原理
凝胶层析的分离过程是在装有 多孔物质填料的柱中进行的。 柱的总体积为VA，它包括填料 的骨架体积 VGM ，填料的孔体 积Vi(内水体积)以及填料颗粒 之间的体积V0（外水体积）。 VA=Vi+V0+VGM