凝胶色谱法要点
凝胶色谱的实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶色谱（GPC）的原理和操作技术。
2. 掌握GPC在测定高分子聚合物分子量及其分布方面的应用。
3. 学会GPC数据的处理和分析方法。
二、实验原理凝胶色谱法（GPC）是一种基于分子大小分离的色谱技术，主要用于高分子聚合物的分子量及其分布的测定。
GPC利用具有不同孔径的凝胶作为固定相，将高分子聚合物按照分子大小进行分离。
分子量较小的高分子聚合物能够进入凝胶颗粒内部，流动路径较长，所需时间也较长；而分子量较大的高分子聚合物则无法进入凝胶颗粒内部，流动路径较短，所需时间也较短。
实验过程中，高分子聚合物在流动相（通常是溶剂）的作用下，通过凝胶色谱柱，分子量不同的高分子聚合物在色谱柱中的保留时间不同，从而实现分离。
通过检测器记录不同分子量高分子聚合物的出峰时间，即可得到高分子聚合物的分子量分布曲线。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 高分子聚合物样品- 标准高分子聚合物样品- 溶剂（如四氢呋喃、苯等）2. 实验仪器：- 凝胶色谱仪- 凝胶色谱柱- 检测器- 计算机及数据采集软件四、实验步骤1. 样品准备：将高分子聚合物样品溶解于溶剂中，制成一定浓度的溶液。
2. 准备凝胶色谱柱：将凝胶色谱柱安装在凝胶色谱仪上，用溶剂冲洗色谱柱，去除杂质。
3. 进样：将高分子聚合物溶液注入凝胶色谱柱。
4. 流动相：设置流动相的流速，使高分子聚合物在色谱柱中流动。
5. 检测：检测器记录高分子聚合物的出峰时间，并将数据传输至计算机。
6. 数据处理：利用数据采集软件，对GPC数据进行处理和分析。
五、实验结果与分析1. 标准高分子聚合物样品的GPC曲线：通过标准高分子聚合物样品的GPC曲线，可以确定凝胶色谱柱的分离范围和适用性。
2. 实验样品的GPC曲线：根据实验样品的GPC曲线，可以分析高分子聚合物的分子量分布情况。
3. 计算分子量及其分布：根据GPC曲线，可以计算出高分子聚合物的数均分子量、重均分子量、多分散指数等参数。
凝胶渗透色谱法测试标准
凝胶渗透色谱法测试标准凝胶渗透色谱法是一种常用的生物分析技术，可以用于分离和测定分子的大小、形状和分子量。
目前，凝胶渗透色谱法已经成为生物医药、食品科学、环境监测等领域中不可或缺的分析手段之一。
为了保证测定结果的准确性和可比性，有必要制定相应的测试标准。
凝胶渗透色谱法测试标准主要包括以下几个方面：1.样品准备：样品准备是凝胶渗透色谱法测试的首要步骤。
样品的准备是否得当，直接影响到测试结果的准确性。
测试标准应包括样品采集、保存和处理的方法，以及样品的浓度、pH值和溶解剂的选择等。
2.凝胶选择：凝胶是凝胶渗透色谱法分析的载体，不同的凝胶具有不同的渗透特性。
测试标准应包括凝胶的选择原则、规格要求和质量控制方法。
同时，还应指明凝胶的维护和保养方法，以保证凝胶的稳定性和再现性。
3.仪器操作：凝胶渗透色谱法需要一系列的仪器和设备来进行操作，包括色谱柱、检测器、泵浦和数据处理软件等。
测试标准应包括这些仪器的选型和校准要求，以及操作人员的培训和资质要求。
此外，还应指明每个仪器的使用方法和维护保养要求。
4.方法验证：为了保证凝胶渗透色谱法测试结果的可靠性，需要进行方法验证。
测试标准应包括方法验证的原则、步骤和指标。
常见的方法验证指标包括线性范围、灵敏度、准确度、重复性和稳定性等。
5.数据分析和结果表达：凝胶渗透色谱法测试结果的准确性和可靠性，不仅取决于仪器和方法的选择，还取决于数据的分析和结果的表达。
测试标准应包括数据处理和分析的方法，以及结果的正确解读和报告要求。
总之，凝胶渗透色谱法测试标准是确保该技术准确、可靠和可比的重要保障。
只有制定和遵守科学合理的测试标准，才能保证凝胶渗透色谱法在实践中的正确应用和推广。
高效凝胶渗透色谱法
高效凝胶渗透色谱法
高效凝胶渗透色谱法（Gel Permeation Chromatography，GPC），又称凝胶过滤色谱，是一种分离大分子化合物的色谱技术。
该技术基于样品分子在凝胶纳米孔道中的渗透性差异，通过溶液中大分子与凝胶孔道的相互作用，实现溶液中分子的分离。
高效凝胶渗透色谱法主要包括以下步骤：
1. 样品制备：将待分离的大分子溶于适当的溶剂中，并使用过滤器或超滤器去除杂质。
2. 色谱柱选择：根据溶液中分子的分子量范围选择合适的高分子凝胶柱。
常用的凝胶材料包括聚合物和硅胶。
3. 柱温控制：根据样品性质，可选择恒温柱柱温控制，提高分离效果。
4. 流动相选择：根据样品的性质选择合适的流动相，常用的流动相包括有机溶剂和缓冲溶液。
5. 柱体填充：将凝胶填充到柱体中，保证凝胶均匀分布。
6. 样品进样：将样品溶液注入柱体，通过凝胶孔道渗透分离。
7. 分离分析：样品分子在凝胶孔道中的渗透速度不同，根据渗透速度的大小进行分离分析。
8. 检测器检测：通过检测器检测分离后的样品，常用的检测器包括紫外-可见光谱仪和光散射检测器。
高效凝胶渗透色谱法广泛应用于聚合物、蛋白质、天然高分子等大分子的分离和纯化。
与其他色谱技术相比，高效凝胶渗透色谱法具有分辨率高、选择性好、样品制备简单等优点，是一种重要的分离技术。
凝胶色谱优化方法
凝胶色谱优化方法
凝胶色谱，又称体积排阻色谱或分子排阻色谱，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术。
它是以多孔凝胶为固定相，利用凝胶孔的空间尺寸效应，使不同大小的分子按照由大到小的洗脱顺序达到分离的高效液相色谱（HPLC）方法。
凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。
凝胶色谱优化方法主要包括以下几个方面：
选择合适的凝胶：凝胶的选择是凝胶色谱优化的关键。
凝胶的类型、孔径大小和孔径分布等都会影响分离效果。
应根据待分离物质的分子量和性质选择合适的凝胶。
优化洗脱条件：洗脱条件是凝胶色谱分离效果的重要因素。
洗脱剂的种类、浓度、pH 值和洗脱速度等都会影响分离效果。
应根据待分离物质的性质优化洗脱条件，以获得最佳的分离效果。
控制进样量：进样量的大小会影响分离效果和色谱柱的寿命。
应根据色谱柱的容量和待分离物质的浓度控制进样量，避免过载或欠载。
柱温控制：柱温会影响分子的扩散和吸附等过程，从而影响分离效果。
应根据待分离物质的性质和控制柱温，以获得最佳的分离效果。
柱前预处理：柱前预处理可以去除样品中的杂质和干扰物质，提高分离效果。
常见的柱前预处理方法包括过滤、离心、沉淀等。
综上所述，凝胶色谱优化方法涉及多个方面，需要根据具体的实验条件和待分离物质的性质进行综合考虑和优化。
凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱目录一、基本原理 (2)1.1 凝胶的特性 (2)1.2 色谱的分离原理 (3)1.3 凝胶渗透色谱在分离技术中的应用 (5)二、仪器设备 (6)2.1 凝胶渗透色谱仪的主要组成部分 (7)2.2 主要性能指标及选择 (9)2.3 仪器设备的清洁与维护 (9)三、样品前处理 (11)3.1 样品的选择与制备 (11)3.2 样品浓缩与净化 (12)3.3 样品检测方法的建立 (13)四、实验操作流程 (14)4.1 样品进样 (16)4.2 柱塞泵的设置与调节 (17)4.3 检测器的选择与校准 (18)4.4 数据处理与结果分析 (19)五、理论基础与数学模型 (20)5.1 凝胶渗透色谱的理论基础 (22)5.2 数学模型在凝胶渗透色谱中的应用 (23)5.3 实验数据的解释与处理 (24)六、应用领域 (26)6.1 在化学领域中的应用 (28)6.2 在生物医学领域中的应用 (29)6.3 在环境科学领域中的应用 (30)七、常见问题与解决方案 (31)7.1 常见问题及原因分析 (32)7.2 预防措施与解决策略 (33)八、实验安全与防护 (34)8.1 实验室安全规程 (36)8.2 个人防护装备的使用 (37)8.3 应急处理措施 (38)九、最新研究进展 (39)9.1 新型凝胶材料的研究与应用 (40)9.2 色谱技术的创新与发展 (41)9.3 聚合物凝胶渗透色谱法的探索 (43)一、基本原理它的基本原理是利用具有不同孔径大小的多孔凝胶颗粒作为固定相，将待分离的混合物通过凝胶柱进行分离。
在色谱过程中，待分离的混合物会与凝胶颗粒发生相互作用，从而导致不同成分在凝胶颗粒之间的分配系数和扩散速率的差异。
根据这些差异，混合物中的各个成分可以通过不同的时间顺序依次通过凝胶柱，从而实现对混合物中各组分的高效分离。
GPC的关键参数包括：凝胶颗粒的大小和形状；溶液流速；压力；洗脱剂的选择和浓度。
蛋白纯化方法—凝胶过滤色谱
活性蛋白整体方案凝胶过滤色谱摘要：本文主要讲解了凝胶过滤色谱法（分子筛）在蛋白纯化实验中的应用，包括纯化原理、实验方案设计、技术操作以及相关案例介绍和问题分析。
基本原理凝胶过滤色谱蛋白纯化法，又称为空间排阻色谱，分子筛等。
其原理是应用蛋白质分子量或分子形状的差异来分离。
当样品从色谱柱的顶端向下运动时，大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒从而被迅速洗脱；而较小的蛋白质分子能够进入凝胶颗粒中，且进入凝胶的蛋白在凝胶中保留时间也不同，分子量越大，流出时间就越早，最终分离分子大小不同的蛋白质。
凝胶过滤色谱原理通常，多数凝胶基质是化学交联的聚合物分子制备的，交联程度决定凝胶颗粒的孔径。
常用的色谱基质有：葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）、聚丙烯酰氨凝胶（Bio-Gel P）等。
高度交联的基质可用来分离蛋白质和其他分子量更小的分子，或是除去低分子量缓冲液成分和盐，而较大孔径的凝胶可用于蛋白质分子之间的分离。
选用合适孔径的凝胶很大程度取决于目标蛋白的分子量和杂蛋白的分子量。
实验方案设计1.凝胶介质的选择凝胶介质的选择主要是根据待分离的蛋白和杂蛋白的分子量选择具有相应分离范围的凝胶，同时还需要考虑到分辨率和稳定性的因素。
比如，如果是要将目的蛋白和小分子物质分开，可以根据他们分配系数的差异，选用Sephadex G-25和G-50；对于小肽和低分子量物质的脱盐，则可以选用Sephadex G-10、G-15以及Bio-Gel P-2或P-4；如果活性蛋白整体方案是分子量相近的蛋白质，一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。
具体凝胶过滤色谱介质应用如下：常用凝胶过滤色谱介质的分离范围凝胶介质蛋白质的分离范围/103凝胶介质蛋白质的分离范围/103Sephadex G25 Sephadex G50 Sephadex G100 Sephadex G200 Sepharose6B Sepharose4B1~51.5~304~1505~60010~400060~20000Sepharose2BBio-Gel P-4Bio-Gel P-10Bio-Gel P-60Bio-Gel P-150Bio-Gel P-30070~400000.5~45~1730~7050~150100~4002.凝胶介质的预处理凝胶在使用前应用水充分溶胀（胶：水=1：10），自然溶胀的耗时较长，可采用加热的方法使溶胀加速，即在沸水浴中将凝胶升温至沸，1~2h即可达到溶胀。
凝胶渗透色谱法
凝胶渗透色谱法（GPC）一、凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱Gel Permeation Chromatography（GPC)，一种新型的液体色谱，原理是利用高分子溶液通过一个装填凝胶的柱子，在柱子中按分子大小进行分离。
柱子为玻璃柱或金属柱，内填装有交联度很高的球形凝胶。
其中的凝胶类型有很多，都是根据具体的要求而确定（常用的有聚苯乙烯凝胶）。
然而，无论哪一种填料，他们都有一个共同点，就是球形凝胶本身都有很多按一定分布的大小不同的孔洞（见图1）。
图1 GPC分离原理不仅可用于小分子物质的分离与鉴定，而且可作为用来分析化学性质相同但分子体积不同的高分子同系物。
可以快速、自动测定高聚物的平均分子量及分子量分布。
现阶段，已经成为最为重要的测定聚合物的分子量与分子量分布的方法。
二、测定原理凝胶色谱法的固定相采用凝胶状多孔性填充剂，是根据样品中各种分子流体力学提及的不同进行分离的。
比凝胶孔径大的分子完全不能进入孔内，随流动相沿凝胶颗粒间流出柱外，而娇小的分子则可或多或少地进入孔内。
因此大分子流程短，保留值小；小分子流程长，保留值大，所以凝胶色谱是按分子流体力学体积的大小，从大到小顺序进行分离的。
（见图2）图2 GPC淋出曲线溶质分子的体积越小，其淋出体积越大，这种解释不考虑溶质与载体间的吸附效应以及溶质在流动相和固定相中的分配效应，其淋出体积仅仅由溶质分子的尺寸和载体的孔径尺寸决定，分离完全是由于体积排除效应所致。
凝胶色谱的特点是样品的保留体积不会超出色谱柱中溶剂的总量，因为保留值的范围是可以推测的，这样可以每隔一定时间连续进样而不会造成谱峰的重叠，提高了仪器的使用率。
三、分子量校正曲线（LogM-V曲线）凝胶色谱图计算样品的分子量分布的关键是把凝胶色谱曲线中的淋洗体积V转化成分子量M，这种分子量的对数值与淋洗体积之间的曲线(LogM-V)称之为分子量校正曲线（见图3）。
图3 分子量校正(LogM-V)曲线➢排阻极限排阻极限是指不能进入凝胶颗粒空穴内部的最小分子的分子量。
凝胶色谱法分离原理
凝胶色谱法分离原理
凝胶色谱法（Gel Chromatography，GC）是一种定性和定量分析技术，用于分离复杂化合物中的性质相同或相近，或难以区分的组分。
它是将样品分散在凝胶基质（有机材料或无机材料）中，再以一定流速和浓度的溶剂进行缓慢的移动，使各种分子按其大小和亲合力对离子电偶极度以及其他有关因素，而在凝胶基质中分离和迁移，再经过检测，获得样品中各类成分物质的检测分析结果。
下面是凝胶色谱法分离原理：
一、凝胶色谱的基本原理
1 、凝胶色谱（GC）的原理是根据样品的分子大小和比重不同，在不同的凝胶相中的分布密度互不相同，将样品分散在凝胶基质中，经过一定的移动和积累而实现分离的。
2 、凝胶色谱的分离过程即按分子大小和比重的不同，在不同黏度或介电常数的凝胶相中以慢性分离的方式（通常为梯度流相分离），将分子分开，从而隔离分离不同分子组分。
二、凝胶色谱迁移原理
1 、凝胶色谱的样品分子在凝胶基质中的运动受到凝胶基质与溶剂耗散势所控制，通过在凝胶相空腔中形成液体膜上的均匀溶解才得以实现。
2 、凝胶色谱中，样品重性物质的运动速度更快，轻性物质的运动速度较慢，但同一样品中的各物质之间的运动速度差别很小，所以它们能在同一迁移时间内分离出来。
三、凝胶色谱检测原理
1 、在凝胶色谱的分离过程中，样品的各分子迁移到柱的不同位置，并发出不同的信号，检测系统根据这些信号就可以推测出样品中分子的种类、数量和浓度大小。
2 、样品分子通过一种叫做极性紫外分光光度计（PVOD）的检测装置获得，根据它的信号大小，就可以推测出样品中分子的浓度。
实验七凝胶渗透色谱法测定聚合物分子质量和其散布
实验七凝胶渗透色谱法测定聚合物的相对分子质量及其散布一、实验目的1.了解凝胶渗透色谱法测定聚合物相对分子质量及其散布的原理。
2.了解凝胶渗透色谱仪的仪器构造和初步把握凝胶渗透色谱仪的实验技术。
3．测定聚苯乙烯样品的相对分子质量及其散布。
二、实验原理聚合物的相对分子质量量及其散布是聚合物性能的重要参数之一，它对聚合物材料的物理机械性能和可加工性等阻碍专门大。
测定聚合物的相对分子质量及其散布的最经常使用、快速和有效的方式是凝胶渗透色谱法（gel permeation chromatography，简称GPC）。
1. GPC分离机理GPC是一种新型液相色谱，除能用于测定聚合物的相对分子质量及其散布外，还普遍用于研究聚合物的支化度、共聚物的组成散布及高分子材料中微量添加剂的分析等方面。
同各类类型的色谱一样，GPC具有分离功能，其分离机理比较复杂，目前还未取得一致的意见。
但在GPC的一样实验条件下，体积排除分离机理被以为起要紧作用。
体积排除分离机理的理论以为：GPC的分离主若是由于大小不同的溶质分子在多孔性填料中能够渗透的空间体积不同而形成的。
装填在色谱柱中的多孔性填料（凝胶）的表面和内部散布着大小不同的孔洞和通道。
当被测试的多分散性试样随淋洗溶剂进入色谱柱后，溶质分子即向填料内部孔洞渗透，渗透的程度取决于溶质分子体积的大小。
体积较大的分子只能进入较大的孔洞，而体积较小的分子除能进入较大的孔洞外还能进入较小的孔洞，因此体积不同的分子在流过色谱柱时实际通过的路程是不同的，分子体积越大，路程越短。
随着溶剂淋洗进程的进行，体积最大的分子最先被淋洗出来，依次流出的是尺寸较小的分子，最小的分子最后被淋洗出来，从而达到使不同大小的分子取得分离的目的。
以上为GPC机理的一样说明。
依照一样的色谱理论，试样分子的保留体积V R（或淋出体积V e）可用下式表示：V e=V o+KV i式中，V e为淋出体积，即指溶液试样从进色谱柱到被淋洗出来的淋出液整体积；V o为柱中填料粒子的粒间体积；V i为柱中填料粒子内部的孔洞体积；K为分派系数，即能够被溶质分子进入的粒子孔体积与粒子的总孔体积之比。
凝胶色谱层析
凝胶色谱层析
凝胶色谱层析（Gel Chromatography）是一种常用的分离和分析
生物大分子的技术。
它基于不同分子的大小和形状差异，通过凝胶的
分子筛效应来实现分离。
凝胶色谱层析通常包括以下步骤：
1. 凝胶的选择：选择适当的凝胶，如琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶，根据待分离物质的大小和性质选择合适的凝胶孔径。
2. 柱子的制备：将凝胶填充到柱子中，确保凝胶均匀且无气泡。
3. 上样：将待分离的混合物加载到柱子的顶部。
4. 洗脱：使用适当的洗脱液，通常是缓冲液，将混合物通过柱子
进行洗脱。
大分子物质由于不能进入凝胶的孔径，会首先被洗脱出来，而小分子物质则会被凝胶保留较长时间。
5. 检测：在洗脱过程中，通过检测柱子出口处的洗脱液，可以监
测不同物质的洗脱时间和浓度。
6. 收集和分析：根据洗脱时间和检测结果，收集不同组分的洗脱液，并进行进一步的分析和鉴定。
凝胶色谱层析的优点包括分离效果好、操作简单、可重复性高，适用于分离和分析蛋白质、核酸、多糖等生物大分子。
它是生物化学、分子生物学和生物技术等领域中常用的分离和分析技术之一。
高效凝胶渗透色谱法测定多糖纯度及分子量
高效凝胶渗透色谱法测定多糖纯度及分子量一、本文概述多糖作为一种重要的生物大分子，广泛存在于自然界中，具有多种生物活性，如免疫调节、抗病毒、抗肿瘤等。
因此，对多糖的纯度及分子量的准确测定对于其研究和应用具有重要意义。
高效凝胶渗透色谱法（High Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）是一种常用的多糖纯度及分子量测定方法，具有操作简便、分辨率高、重现性好等优点。
本文旨在介绍HPGPC法测定多糖纯度及分子量的原理、实验步骤、数据处理及注意事项，以期为多糖的研究和应用提供参考。
二、实验材料与方法1 多糖样品：选择待测定的多糖样品，确保其来源清晰，无杂质污染。
2 高效凝胶渗透色谱（HPGPC）柱：选择适当型号的HPGPC柱，以适用于待测多糖样品的分子量范围。
3 流动相：通常选用适当的溶剂或缓冲液作为流动相，以保证多糖样品在色谱柱上的良好分离。
4 检测器：使用示差折光检测器（RI）或紫外检测器（UV）等，以监测多糖样品在色谱柱上的分离情况。
5 其他试剂与仪器：包括样品制备所需的试剂、色谱仪、注射器、进样针等。
1 样品制备：将多糖样品溶解在适当的溶剂中，制备成一定浓度的溶液，以便进行后续分析。
2 色谱条件优化：通过预实验，优化色谱条件，包括流动相的选择、流速、柱温等，以获得最佳的分离效果。
3 进样与分离：将制备好的多糖样品溶液通过注射器注入HPGPC 仪中，通过色谱柱进行分离。
在分离过程中，利用检测器监测多糖样品的分离情况。
4 数据收集与处理：收集分离过程中的数据，利用相应软件对数据进行处理和分析，包括分子量计算、纯度分析等。
5 结果评价：根据分析结果，评价多糖样品的纯度及分子量分布情况，为后续研究提供依据。
通过以上实验材料与方法，可以高效地进行多糖纯度及分子量的测定，为后续多糖的结构研究、质量控制等提供重要支持。
三、实验结果与讨论在本研究中，我们采用了高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）对多糖样品的纯度和分子量进行了测定。
色谱分析第六章凝胶色谱法
第六章空间排阻色谱法第七章第一节概述一、定义空间排阻色谱法又名尺寸排阻色谱法（SEC）也叫凝胶色谱法，是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。
它是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便、不需要有机溶剂、对高分子物质有很高的分离效果，被广泛应用于大分子分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。
空间排阻色谱法固定相为化学惰性多孔物质——凝胶。
二、基本原理分子筛效应：凝胶色谱的原理为分子筛效应，即凝胶具有区分分子大小不同的物质的能力。
在凝胶色谱中，作为固定相的凝胶是一种不带电荷的具有三维空间网状结构的基质，每个颗粒的细微结构如同一个筛子，所有筛孔的直径是一致的。
凝胶的这种结构使得小分子可在筛孔中自由地扩散、渗透，而大分子则被排阻于颗粒之外，如此起到筛分大小分子的作用。
当含有大小分子的混合物样品加入到层析柱中后，这些物质随洗脱液的流动而向前移动；相对分子质量大小不同的物质受阻滞的程度不同。
相对分子质量大的物质沿凝胶颗粒间的孔隙随洗脱液移动，流程短，移动速度快，先流出层析柱；相对分子质量小的物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，后流出层析柱。
样品中分子大小不同的物质如此逐渐分离。
其分离过程如下： 1、混合物上柱； 2、洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子则被排阻于凝胶颗粒之外；3、小分子被滞留，大分子向下移动，大小分子开始分开；4、大小分子完全分开；5、大分子行程较短，已洗出层析柱，小分子尚在行进中。
三、特点：1、设备简单、操作方便、周期短、样品回收率高；2、层析后，无需对凝胶进行再生处理，减少了工作量；3、凝胶是一种不带电荷的惰性载体，与溶质不发生化学反应，分离效果好，重复性高；4、洗脱条件温和，一般采用低离子强度（0.01mol/L）的洗脱剂，有些情况下甚至可以用水，所以不易使有效成分失活变性。
凝胶色谱的缺点：1、分辨率不高，分离操作较慢 2、分离时必须严格控制流速 3、样品黏度不宜过高 4、存在非特异性吸附现象应用： 1、分子的组别分离、分级分离及制备； 2、测定生物大分子的相对分子质量；3、高效率样品脱盐，一次脱盐达95％以上；4、去除热源物质；5、吸水，分批法浓缩样品；6、更换样品缓冲液。
第九章凝胶渗透色谱讲解
第九章凝胶渗透⾊谱讲解凝胶⾊谱分析⼆〇⼀⼀年九⽉九⽇第九章凝胶⾊谱分析凝胶渗透⾊谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），⼜称尺⼨排阻⾊谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）⽽实现物质的分离。
GPC可⽤于⼩分⼦物质和化学性质相同⽽分⼦体积不同的⾼分⼦同系物等的分离和鉴定。
凝胶渗透⾊谱是测定⾼分⼦材料分⼦量及其分布的最常⽤、快速和有效的⽅法[1]。
凝胶渗透⾊谱（GPC）的创⽴历程如下[2,5]：1953年Wheaton和Bauman⽤多孔离⼦交换树脂按分⼦量⼤⼩分离了苷、多元醇和其它⾮离⼦物质，观察到分⼦尺⼨排除现象；1959年Porath和Flodin⽤葡聚糖交联制成凝胶来分离⽔溶液中不同分⼦量的样品；1964年J. C. Moore将⾼交联密度聚苯⼄烯-⼆⼄烯基苯树脂⽤作柱填料，以连续式⾼灵敏度的⽰差折光仪，并以体积计量⽅式作图，制成了快速且⾃动化的⾼聚物分⼦量及分⼦量分布的测定仪，从⽽创⽴了液相⾊谱中的凝胶渗透⾊谱。
近年来，光散射技术（如图9-1所⽰，⼀束光通过⼀间充满烟雾的房间，会产⽣光散射现象。
）⼴泛应⽤于⾼分⼦特征分析领域[3]。
将光散射技术和凝胶渗透⾊谱（GPC）分离技术相结合，可以测定⼤分⼦绝对分⼦量、分⼦旋转半径、第⼆维⾥系数，也可测定分⼦量分布、分⼦形状、分枝率和聚集态等。
⽬前，该技术在⾼分⼦分析领域已成为⼀种⾮常有效的⼯具，在美国，⽇本及欧洲⼴为使⽤，国内近年来亦引进了此项技术。
⼊射光散射光图9-1光散射现象9.1 基本原理9.1.1凝胶渗透⾊谱分离原理让被测量的⾼聚物溶液通过⼀根内装不同孔径的⾊谱柱，柱中可供分⼦通⾏的路径包括粒⼦间的间隙（较⼤）和粒⼦内的通孔（较⼩）。
如图9-2、图9-3所⽰，当待测聚合物溶液流经⾊谱柱时，较⼤的分⼦只能从粒⼦间的间隙通过，被排除在粒⼦的⼩孔之外，速率较快；较⼩的分⼦能够进⼊粒⼦中的⼩孔，通过的速率慢得多。
凝胶过滤色谱法
凝胶过滤色谱法
凝胶过滤色谱法（Gel Filtration Chromatography），也被称为分子筛色谱或凝胶渗透色谱，是一种常用的生物分离和纯化技术。
它基于样品分子在凝胶填料中的分子尺寸差异来实现分离。
工作原理是通过在色谱柱中填充具有特定孔径大小的凝胶填料，较大的分子在凝胶中较快通过孔隙，而较小的分子由于进入填料内部的孔隙较多而较慢通过。
因此，分子的分离程度取决于其尺寸，大分子被排除在凝胶颗粒外部，较小分子则更容易渗透到凝胶颗粒内部。
凝胶过滤色谱法通常用于分离和纯化蛋白质、多肽、核酸等生物大分子。
它可以去除小分子杂质，同时可以根据分子大小分离具有不同尺寸的目标分子。
该方法操作简单，无需特殊的溶剂，对生物大分子具有较好的保护性，不会对其结构和活性产生显著影响。
在凝胶过滤色谱法中，填料的孔径大小是一个重要的参数，需要根据目标分子的分子量范围选择适当的凝胶填料。
常用的填料包括琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等，它们具有不同的孔径范围，可满足不同分子大小的分离需求。
高效凝胶色谱法测试标准
高效凝胶色谱法测试标准一、高效凝胶色谱法原理及应用领域高效凝胶色谱法（High Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）是一种基于分子大小分离的色谱技术。
它利用凝胶颗粒形成的色谱柱作为固定相，根据不同分子大小通过色谱柱的速度不同来实现分离。
HPGPC适用于分离大分子物质，如蛋白质、多糖、聚合物等，广泛应用于生物医药、食品、化工等领域。
二、试剂与设备选择及使用1.试剂：根据待测样品的性质选择合适的溶剂，如水、甲醇、乙醇等。
2.设备：高效凝胶色谱仪（包括输液泵、色谱柱、检测器等）、超声波清洗器、微量注射器等。
3.使用方法：参照设备说明书安装设备，根据实验要求设置实验参数，如流速、波长、温度等。
三、实验前准备工作与操作注意事项1.准备样品：将待测样品准备成适当浓度的溶液。
2.准备色谱柱：根据实验要求选择合适的色谱柱，安装前确认色谱柱接口正确，避免漏液。
3.操作注意事项：操作过程中避免样品污染，注意保持色谱柱的清洁，避免压力过高导致色谱柱损坏。
四、高效凝胶色谱法测试流程及步骤1.按照设备说明书安装调试设备，设置实验参数。
2.启动输液泵，使流动相稳定流经色谱柱。
3.待基线稳定后，将样品溶液通过微量注射器注入进样阀。
4.记录每个时间点的光谱图和电信号变化，观察色谱峰的变化。
5.样品测试完毕后，关闭输液泵和检测器，结束实验。
6.根据实验数据绘制凝胶色谱图，标定各组分及其含量。
五、数据记录与分析方法1.记录每个时间点的光谱图和电信号变化，观察色谱峰的变化。
2.根据凝胶色谱图，可以得出样品的分离效果、各组分分子量等信息。
3.采用归一化法、外标法或内标法计算各组分的含量。
4.分析实验数据，评估分离效果和样品纯度。
六、实验结果讨论及改进措施1.根据实验结果讨论样品的分离效果和纯度，分析实验参数对分离效果的影响。
2.如果分离效果不理想，可以尝试调整实验参数如流速、波长等，或者选择不同的色谱柱进行优化。
凝胶色谱法
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1.原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决
于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。
2. SDS作用机理:
SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成 的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链， 因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各 种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷 的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩 盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完 全取决于分子的大小。
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用SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质 分子量的方法
使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋 白质的分子量时，可选用一组已知分子量 的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子 量的标准蛋白的电泳区带位置，可以测定 未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、 次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出 售。
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2.原理①：许多重要的生物大分子，如多肽、
核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下， 这些基团会带上正电或负电。 ②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所 带电荷相反的电极移动。 ③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的 差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电 分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种 分子的分离。
维持PH基本不变。
2.缓冲溶液的通配常制由:1－2 种缓冲剂溶解于水
中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不 同PH范围内使用的缓冲液。
3. 在本课题中使用的缓冲液是:磷酸缓冲液, 成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠
如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？
.8Βιβλιοθήκη （三） 电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
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凝胶色谱法的制作
（1）凝胶色谱柱的制作：①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。
【注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底】③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。
④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体并安装其他附属结构。
（2）凝胶色谱柱的装填①过程计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量。
凝胶溶胀：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬液。
固定：将色谱柱装置垂直固定在支架上。
填充：将凝胶悬浮液一次性缓慢装填入色谱柱内。
洗涤平衡：用20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时，使凝胶装填紧密。
②注意事项a.商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需要在洗脱液中膨胀。
为了加速膨胀，可以在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温到近沸，则溶涨时间可以缩短到1~2小时。
热溶涨法不但节约时间，还可以杀死凝胶中产生的细菌、脱掉凝胶中的空气。
b.在色谱柱中填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。
一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；二是凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。
一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。
（3）样品加入与洗脱①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
④再调整缓冲液面：关闭出口，小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度。
⑤洗脱：打开下端出口，连接缓冲液洗脱瓶，用磷酸缓冲液洗脱。
⑥收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。
制备型凝胶渗透色谱法
制备型凝胶渗透色谱法（Size-Exclusion Chromatography, SEC）是一种液相色谱技术，用于分
离和纯化各种大小的有机或无机分子。
该方法基于分子的大小和形状来分离样品，大分子不能通过凝胶而只能停留在凝胶床中，而小分子可以自由通过凝胶床，因此达到分离的效果。
制备型凝胶渗透色谱法在实验过程中需要注意以下事项：
1. 保证设备清洗干净：每次使用完制备型凝胶渗透色谱系统后，一定要用去离子水和异丙醇冲洗干净。
这样可以保证在下次使用时不会污染样品。
2. 保证样品纯净：在进样前，一定要保证样品的纯净，避免引入杂质。
3. 保证进样量准确：进样量一定要准确，否则会影响分离效果。
4. 保证操作规范：在操作过程中，一定要按照规范进行，避免出现操作失误。
制备型凝胶渗透色谱法在生物医药、高分子材料、纳米材料等领域都有广泛的应用，尤其在生物医药领域，它可以用来分离纯化蛋白质、多肽等生物分子，以及分离不同大小的核酸分子等。
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简介
凝胶色谱技术是上世纪六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，对高分子物质有很好的分离效果。
在生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域被广泛采用，工业生产上也有非常广泛的应用。
一、分离原理
一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。
大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。
具有多孔的凝胶就是分子筛。
各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。
分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。
两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。
直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。
如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。
因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。
综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。
大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。
对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。
于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。
另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。
分子量
大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队，凝胶表现分子筛效应。
二．色谱柱参数
⑴柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。
在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因引柱体积又称“床”体积，常用Ｖｔ 表示。
⑵外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Ｖｏ表示。
⑶内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用Ｖｉ表示。
不包括固体支持物的体积（Ｖｇ）。
⑷峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液有体积，常用Ｖｅ 表示。
当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ｖｅ。
当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。
当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。
三、凝胶的种类及性质
（一）交联葡聚糖凝胶（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）
⑴Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ交联葡聚糖的商品名为Ｓｅｐｈｎｄｅｘ，不同规格型号的葡聚糖用英文字母Ｇ表示，Ｇ后面的阿拉伯数为凝胶得水值的１０倍。
例如，Ｇ－２５为每克凝胶膨胀时吸水２．５克，同样Ｇ－２００克每克千胶吸水２０克。
交联葡聚糖凝胶的种类有Ｇ－１０，Ｇ－１５，Ｇ－２５，Ｇ－５０，Ｇ－７５，Ｇ－１００，Ｇ－１５０，和Ｇ－２００。
因此，“Ｇ”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
⑵Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ－２０，是─Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５的羧丙基衍生物， 能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。
（二）琼脂糖凝胶：
商品名很多，常见的有，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（瑞典，ｐｈａｒｍａｃｉａ ），Ｂｉｏ－Ｇｅｌ－Ａ（美国Ｂｉｏ－Ｒａｄ）等。
琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。
一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许
多条件下使用（如水，ｐＨ４－９范围内的盐溶液）。
琼脂糖凝胶在４０℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
（三）聚丙烯酰胺凝胶：
是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。
交联剂越多，孔隙越小。
聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－Ｐ （Ｂｉｏ－Ｇｅｌ Ｐ），由美国Ｂｉｏ－Ｒｏｄ厂生产，型号很多，从Ｐ－２至Ｐ－３００共１０种，Ｐ 后面的数字再乘１０００就相当于该凝胶的排阻限度。
（四）聚苯乙烯凝胶商品为Ｓｔｙｒｏｇｅｌ ， 具有大网孔结构， 可用于分离分子量１６００到４０，０００，０００的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。
四、实验技术
（一）层析柱 层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。
层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于２厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。
此外， 直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。
分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过１米。
分族分离时用短柱，一般凝胶柱长２０－３０厘米，柱高与直径的比较５：１─１０：１，凝胶床体积为样品溶液体积的４－１０倍。
分级分离时柱高与直径之线为２０：１─１００：１，常用凝胶柱有５０×２５厘米，１０×２５厘米。
层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。
在精确分离时，死体积不能超过总床体积的１／１０００。
（二）凝胶的选择 根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。
一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的２倍，例如Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２０的吸水量为２０，１ 克Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ─２００吸水后形成的凝胶体积约４０ｍｌ。
凝胶的粒度也可影响层析分离效果。
粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。
一般实验室分离蛋白质采用
１００－２００号筛目的的Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２００效果好， 脱盐用Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５、Ｇ－５０，用粗粒，短柱，流速快。
（三）凝胶的制备 商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。
为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在１－２小时内即可完成。
特别是在使用软胶时， 自然膨胀需２４小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。
这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。
（四）样品溶液的处理 样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５短柱除去。
样品的粘度不可大，含蛋白为超过４％，粘度高影响分离效果。
上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。
分离蛋白质样品的体积为凝胶床的１－４％（一般约０．５－２ｍｌ），进行分族分离时样品液可为凝胶床的１０％，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的２０－３０％。
分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。
（五）防止微生物的污染 交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有：
⑴叠氨钠（ＮａＮ３）在凝胶层析中只要用０．０２％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶一水，在２０℃时约为４０％；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。
叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。
⑵可乐酮［Ｃｌ３Ｃ－Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）２］在凝胶层析中使用浓度为０．０１－０．０２％。
在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于６０℃时易引起分解而失效。
⑶乙基汞代巯基水杨酸钠 在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为０．０５－０． ０１％。
在微酸性溶液中最为有效。
重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。
⑷苯基汞代盐 在凝胶层析中使用浓度为０．００１－０．０１％。
在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。
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