第七章凝胶色谱法
凝胶层析法
聚丙烯酰胺凝胶的性质
生物凝胶的编号反映出它的分离界限。 如Bio-Gel P-100。
42
四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ）
（一）琼脂糖凝胶
结构是由β-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖以α-1，3和β-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。
43
Sepharose
琼脂糖凝胶（agarose gel）可以分离葡聚糖凝
胶和生物胶所不能分离的大分子，使凝胶层析的分
离区间扩大到大分子和病毒颗粒，其最大范围可达 相对分子质量108，但是由于琼脂有强烈的吸附作用， 给使用造成了困难，后来，基；另一组分叫琼脂糖，它不含有带电基团，
其结构是有β-D-吡喃半乳糖和3，6脱水-L-吡喃半乳 糖相结合的链状多糖。
这种琼脂糖被用来进行凝胶层析，它既具有琼脂凝 胶相同的分离区间，又没有吸附作用。但其稳定性
远不如葡聚糖凝胶和生物胶P，强酸强碱能引起结构
破坏。最好使用条件控制在pH 4～9之间，温度0～ 40℃，超出此范围,可能被破坏。
（3）分离条件缓和。
（4）应用广泛。 （5）分辨率不高，分离操作较慢。
20
第二节 凝胶的结构和性质
一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) 三、聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P） 四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas) 六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
分离的目的。
（一）平衡排除理论
当溶质层流过一个填料颗料这段距离时，溶 质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。
第七章 色谱分离技术
④ 设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件， 因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子 有机化合物。
缺点： 处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此 主要用于实验室，工业生产上应用较少。
3.色谱法的分类 吸附色谱法
分配色谱法
分离机理
离子交换色谱法 凝胶色谱法
亲和色谱法
（一）基本原理
溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表 面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。
1.发生吸附作用的原理：
固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子） 所处的状态不同：
固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是 对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处 于平衡状态。
界面上的分子所受的力不对称，作用力总和不等于零， 合力指向固体内部。
小分子
（二）凝胶过滤介质
基本要求：
不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相 互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用
高物理强度、高化学稳定性 耐高温高压、耐强酸强碱 高化学惰性 内孔径分布范围窄 颗粒大小均一度高
常用的凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
1. 葡聚糖凝胶
pH、缓冲液浓度、离子强度
③ 柱操作 柱的大小、长短 ④ 流速的控制 高速度、高效率 ⑤ 清洗 除去不结合的所有物质 ⑥ 洗脱 特异性洗脱（竞争性置换目的物） ⑦ 柱的再非生特异性洗脱（调节pH、离子强度和种类、温度）
（五）亲和色谱法的应用
1.亲和色谱法的特点： 专一、高效、简便、快速
2.应用 ① 分离和纯化各种生物分子 纯化生物大分子，适于从组织或发酵液中分离
色谱法应运而生。
色谱分离是一组相关技术的总称，又叫做色 谱法、层析法，是一种高效而有用的生物分离 技术。
凝胶色谱法
凝胶色谱法添加摘要凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。
凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。
凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。
目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。
凝胶色谱法-分类根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC ）和凝胶渗透色谱（GPC ）。
凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。
凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。
凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。
近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。
化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。
凝胶渗透色谱技术原理凝胶色谱法-分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。
大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这Array种现象叫分子筛效应。
凝胶色谱法分离原理
凝胶色谱法分离原理
在凝胶色谱法中，样品溶液滴加在凝胶柱中，随后样品分子将自由扩散进入凝胶基质内，形成一定的扩散层。
扩散层内的样品分子将受到凝胶基质的孔道大小限制，较大分子会较快地被孔道阻断，无法进一步扩散，而较小的分子则能较容易地扩散到较深的凝胶基质内。
由于扩散系数和凝胶孔道大小的关系，不同分子尺寸的物质在固定时间内扩散距离不同。
因此，通过调节色谱柱的选择性和操作条件，可以分离目标样品和其他杂质。
凝胶色谱法还可通过改变溶剂系统中的组分来调节管柱内的溶剂力和吸附条件，以改变物质在凝胶色谱柱中的保留时间。
例如，可以通过改变聚丙烯酰胺凝胶中的丙烯酰胺浓度来调节凝胶孔道的大小，从而实现对特定分子尺寸的选择性分离。
此外，凝胶色谱法还可以根据分子的电荷性质进行分离。
例如，对于蛋白质的分离，可以使用聚丙烯酰胺凝胶和SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，SDS（阴离子型表面活性剂）可以使蛋白质分子全部带上负电荷，从而根据其电荷大小进行分离。
总的来说，凝胶色谱法的分离原理是基于样品分子在凝胶柱中的扩散和滤过作用，通过调节凝胶孔道大小、溶剂组分和电荷性质等因素，可以实现对分子尺寸和性质的选择性分离。
凝胶色谱法在分析和纯化生物大分子方面具有广泛应用，并且可与其他技术相结合，如质谱联用、核酸测序等。
凝胶色谱法的原理和目的
凝胶色谱法的原理和目的
凝胶色谱法是一种分离和分析生物大分子的常用方法，其原理是利用凝胶（如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶）作为固定相，通过分子在凝胶中的大小和形状差异，使样品分子在凝胶中以不同的速率进行迁移，从而实现分离。
目的是通过凝胶色谱法可以实现以下几个目标：
1. 分离和纯化目标分子：凝胶色谱法可以将混合的生物大分子混合物分离成单一的成分，从而实现对目标分子的纯化。
2. 获得目标分子的大小和形状信息：不同大小和形状的分子在凝胶中的迁移速率不同，通过测定其迁移距离或迁移时间，可以获得目标分子的大小和形状信息。
3. 分析样品中不同组分的含量和相对分子量：通过凝胶色谱法可以定量分析样品中不同组分的含量，并通过与已知相对分子量的标准物质进行比较，可以得到目标分子的相对分子量。
总之，凝胶色谱法是一种用于分离和分析生物大分子的常用方法，既可以用于纯化目标分子，又可以获得目标分子的大小、形状以及相对分子量等信息。
凝胶色谱法
凝胶色谱法凝胶色谱法添加摘要凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需凝胶色谱系统要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。
凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。
凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。
目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。
凝胶色谱法-分类根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。
凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。
凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱凝胶色谱仪溶剂主要是水。
凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。
近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。
化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。
凝胶渗透色谱技术原理凝胶色谱法-分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。
大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。
凝胶色谱法的原理高中生物
凝胶色谱法的原理高中生物什么是凝胶色谱法？凝胶色谱法是一种常用于生物分子分离与分析的实验技术。
它基于不同组分在凝胶基质内的迁移速率差异，利用凝胶作为分离介质，通过色谱柱将混合物中的不同成分分离出来。
凝胶色谱法的原理凝胶色谱法的分离原理基于分子在凝胶基质中的迁移速率差异。
凝胶是一种多孔的材料，分子可以通过孔隙进入凝胶内部，并在凝胶中扩散。
不同大小、形状及电荷的分子由于其与凝胶相互作用的力不同，会表现出不同的迁移速率。
通常，凝胶色谱法使用分子量作为分离依据，在实验中，较大分子会在凝胶中扩散的速度相对较慢，而较小分子则扩散得更快。
这样，当混合物在色谱柱中通过凝胶时，不同大小的分子将被逐渐分离出来，形成不同的峰。
凝胶色谱法的应用凝胶色谱法在许多生物分析和研究领域中得到广泛应用。
以下是几个常见的应用示例：•蛋白质分离：凝胶色谱法可用于分离不同大小和电荷的蛋白质，有助于研究蛋白质的结构和功能。
•核酸分析：凝胶色谱法可用于分离DNA或RNA的片段，用于基因测序、突变检测等。
•糖类分析：凝胶色谱法可用于分离和分析不同种类和结构的糖类。
•药物分析：凝胶色谱法可用于药物代谢产物的分离和分析，以及药物纯度的检测。
凝胶色谱法的优缺点优点：•简单易操作，成本较低。
•适用于各种样品类型，包括蛋白质、核酸等。
•可实现高分辨率的分离。
缺点：•分离速度较慢。
•对样品的要求较高，一些复杂样品可能需要额外的预处理。
•无法直接得到纯度较高的单一成分。
结语凝胶色谱法作为一种常用的生物分析技术，广泛应用于科研和实验室中。
通过了解凝胶色谱法的原理和应用，我们可以更好地理解生物分子的特性，并且在生物学研究中起到重要的分离和分析作用。
高分子材料研究方法-凝胶色谱法PPT课件
-
16
6.2.1 HPLC
Classification
Ion-exchange chromatography
Direct Methods:
Correction by monodispersive standards
Exclusion limit / permeation limit
Asymptote method: correction curves for wide distribution samples
① Concentration: refraction, UV
② Light Scattering / Viscosity
-
25
GPC系统之温度控制
Mobile phase pump
auto-injector column(s) detector(s) data acquisition Temperature control
-
26
6.2.3 Separation Mechanisms
The Fundamental Equation:
① C: the elution volume
② VM: the void volume of the mobile phase
③ VS: the calculative internal volume within the porous particles
-
2
6.1 Background
Significance of Molecular Weight Distribution (MWD)
凝胶色谱法的原理高中生物
凝胶色谱法的原理高中生物凝胶色谱法是一种非常重要的分离和纯化大分子生物分子的方法，这里重点介绍凝胶色谱法的原理和基本操作。
一、凝胶色谱法的原理凝胶色谱法基本原理是通过凝胶状填料的孔隙（毛细管结构），分析物在填料矩阵中的分布，根据各分子在填料孔隙中的滞留时间（即停留时间）进行分离。
由于不同类型的生物分子具有不同的分子量和形状，其在凝胶中运动速度不同，因此可以通过这种方法实现生物分离和纯化。
凝胶色谱法中主要有两种类型的填料，即吸附剂和分子筛。
吸附剂可以以不同方式将目标分子分离和纯化，一般使用离子交换剂、亲和剂和蛋白A / G填料。
而分子筛多用于纯化蛋白质，由于不同重量和形状的蛋白质溶液经过分子筛时速度不同，这样就可以实现不同蛋白质的分离。
二、凝胶色谱法的基本操作凝胶色谱法的实现需要如下的操作步骤：1.凝胶的膨胀：首先将凝胶与生物样品混合并定量离心分离，然后用缓冲液使各种细胞组分均匀地分布在凝胶孔内。
2.样品的加载：将样品通过凝胶床，最后将可溶进凝胶的目标分子钦定在凝胶内。
3.洗脱复合物：通过浸泡梁的方法，清洗凝胶上不想要的组分。
4.脱落复合物：使用其它金属离子替换离子交换剂以进行脱脂，或改变分子筛孔径实现纯化。
5.再生凝胶：再生过程包括将凝胶用硫酸和乙醇混合物进行回收，再用缓冲液洗净，最后用纯水冲洗干净。
三、凝胶色谱法的应用凝胶色谱法广泛应用于生物化学实验中，如蛋白质、DNA、RNA、多糖、孢子等的分离纯化。
例如，蛋白质纯化的几乎所有方法都有凝胶色谱法的应用，如膜过滤、离心法和年龄夹层法等。
总之，凝胶色谱法是一种非常有用的生物学分离方法，能够分离和纯化大分子生物细胞中的多种生物分子，应用广泛，能够帮助科学家更好地理解生命科学。
第七章 凝胶层析
15
物质的Kd值
16
3. 排阻极限
排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子 的分子量。
所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部， 直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出 来。
排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大 于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分 离。
⑵外水体积（V0） ：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积 称外水体积，亦称间隙体积，常用V0表示。
⑶内水体积Vi ：因凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空 间，液体可进入颗粒内部，水的总和为内水体积，又称 定相体积，常用Vi表示。 不包括基质的体积（Vg）。
VA=V0+Vi+Vg V柱内空间＝Vo＋Vi
39
六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。 Styragel商品, 分离范围为1 600～40 000 000。 生物珠（Bio-Bead S），适于分离分子量较小的物质。 分离不溶水的有机物质。
40
一
41
第三节 凝胶层析的实验条 件和操作
31
四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ）
（一）琼脂糖凝胶
1.结构 是由β-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖以α-1，3-和
β-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。
32
2.琼脂糖凝胶特点
1、没有共价键的交联。 2、孔径 琼脂糖的浓度。 3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。 4、颗粒强度差。 5、非特异性吸附力低。 6、分离范围大。
第一节 凝胶层析的基本原理
一、凝胶层析原理 凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透
凝胶色谱法
凝胶色谱法凝胶色谱法是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，尤其适用于蛋白质和核酸的分离。
该方法基于样品分子在凝胶介质中的迁移速度差异，实现了不同分子间的分离。
原理凝胶色谱法的原理基于分子在凝胶介质中迁移的速度差异。
凝胶是一种高分子物质，可以分为聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等多种类型。
凝胶的孔隙大小决定了分子在其中的迁移速度，较大的孔隙适合分离较大分子，而较小的孔隙则适合分离较小分子。
样品被加载到凝胶柱或凝胶片上，然后通过某种方法施加电场或重力。
根据分子的大小和电荷等因素，样品分子会在凝胶中以不同的速度迁移。
较小的分子会更快地穿过凝胶，而较大的分子则会相对滞留在凝胶中。
这样，不同大小的分子就会被分离开来。
实验步骤凝胶色谱法的实验步骤如下：1.准备凝胶：选择合适的凝胶介质，根据需求制备凝胶柱或凝胶片。
2.加载样品：将待分离的混合物加载到凝胶柱或凝胶片上。
3.施加电场或重力：根据需要选择适当的方法，施加电场或重力使样品开始迁移。
4.迁移和分离：根据分子的大小和电荷，在凝胶中进行分离。
较小的分子会迁移得更快，而较大的分子会滞留在凝胶中。
5.结果分析：根据需要，可以使用染色或其他特定的方法来可视化样品在凝胶上的分离结果。
应用领域凝胶色谱法广泛应用于生物化学、生物技术和分子生物学等领域，常用于蛋白质和核酸的纯化和分离。
具体应用领域包括但不限于以下几个方面：•蛋白质纯化：凝胶色谱法可以根据蛋白质的大小、电荷和亲水性等特性，实现蛋白质的纯化和分离。
•核酸分离：凝胶色谱法可以根据核酸的长度、序列和二级结构等特性，实现核酸的分离和纯化。
•生化分析：凝胶色谱法可以用于分析样品中的混合物，如酶活性检测、荧光标记分析等。
•质谱前处理：凝胶色谱法可以用于质谱前处理，如去除杂质、富集目标物等。
优点与局限性凝胶色谱法在生物大分子的分离和纯化中有许多优点，但也存在一些局限性。
优点：•高分辨率：凝胶色谱法可以实现较高的分辨率，因为凝胶提供了一种固定的介质，分子在其中以不同速度迁移。
凝胶色谱法的原理
凝胶色谱法的原理
凝胶色谱是一种分离和分析生物大分子的常用技术。
其基本原理是利用凝胶矩阵的孔隙结构和大分子的尺寸来分离不同大小或不同结构的分子。
在凝胶色谱中，通常使用的凝胶矩阵是由交联聚合物或聚琼脂糖等材料制成的，其孔隙大小可以根据分析目标进行调整。
大分子在凝胶矩阵中会受到孔隙的限制，进一步会导致其在矩阵中的滞留时间增加。
而小分子则可以较快地通过孔隙，具有较短的滞留时间。
当样品被加至凝胶柱上后，样品中的分子会在凝胶矩阵中通过弥散和分子筛作用进行分离。
较大的分子会在凝胶中滞留更久，而较小的分子则会相对迅速地通过凝胶。
因此，不同大小或不同结构的分子会被分离开来。
为了更好地分析和观察分离后的样品，可以使用染色剂或探针来标记目标分子，使其在色谱柱中呈现出可见的特征。
凝胶色谱法可用于分离和纯化蛋白质、核酸和多肽等生物大分子，有广泛的应用领域，如生物医学研究、生物工程、食品科学等。
它是一种简单、经济、可靠的技术，并且具有高效分离能力和操作灵活性。
凝胶色谱
3. 凝胶的制备
• 商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗 脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸 水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速 膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软 胶时， 自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几 小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还 可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。
1. 葡聚糖凝胶
• 葡聚糖凝胶是应用最广泛的一类凝胶，国 外商品名为Sephadex。它由葡聚糖 Dextran交联而得。交联剂在原料总质量 中所占的百分数叫交联度。交联度越大， 网状结构越紧密，吸水量越小，吸水量越 小，吸水后体积膨胀越少；反之，交联度 越小，网状结构越疏松，吸收量越多，吸 水后体积膨胀越大。
色谱柱的使用下限就是当聚合物中最大尺寸的分子链 比凝胶孔的最小孔径还要小，这时也没有达到分离不同相 对分子质量的目的。所以在使用凝胶色谱仪测定相对分子 质量时，必须首先选择好与聚合物相对分子质量范围相配 的色谱柱。
溶剂的选择：
能溶解多种聚合物 不能腐蚀仪器部件 与检测器相匹配
四、实验技术
• ②高分子材料中小分子的 定性鉴别
• 和其他色谱方法一样， GPC也可以用保留体积来 鉴别或分离后用IR等方法 鉴定中小分子物质。这里 介绍一种便利方法。如果 能预测某未知峰属于某种 化合物，则将该化合物加 入该试样中，比较前后的 谱图变化，如果未知峰强 化，则很可能就是该物质。
• 2）在高分子材料生产过 程中的检测
• A:高分子 B:添加剂和齐聚 物C：未反应的单体和低 分子的污染物如水。
• ①环氧树脂中树脂和齐聚 物的同时分析
• 普通双酚A型的环氧树脂 有很宽的分子量范围，包 括低分子量的，中等分子 量的，高分子量的产品。 GPC能快速可靠的鉴别不 同类型环氧树脂的分子量 特性。
凝胶色谱法的原理高中生物
凝胶色谱法的原理高中生物凝胶色谱法是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，常被应用于蛋白质和核酸的分离和纯化。
它的原理是利用凝胶材料的孔隙结构，根据不同分子的大小、形状、电荷等性质在凝胶中的迁移速率的差异，将混合物中的分子分离开来。
1. 凝胶材料的制备：凝胶材料通常由聚丙烯酰胺（polyacrylamide）或琼脂糖（agarose）制备而成。
聚丙烯酰胺通常用于较小的分子，如蛋白质的分离，而琼脂糖通常用于较大的分子，如核酸的分离。
凝胶材料的制备通常需要使用交联剂将聚合物交联成凝胶状态，从而形成孔隙结构。
2.样品的加载：待分离的混合物通常是在溶液中的，可以通过直接注射或溶液浸渍的形式加载到凝胶柱或凝胶片上。
样品的加载可以使用特定的缓冲液来增加样品的稳定性。
3.柱/片的运行：凝胶柱或凝胶片通常是放置在色谱仪中，通过重力或外部压力的作用，待分离的分子会在凝胶孔隙中进行迁移。
在迁移的过程中，较小的分子会因为孔隙结构的限制迁移更慢，而较大的分子则会迁移得相对较快。
4.分析/检测：分离后的分子可以通过各种方法进行检测和分析，常用的方法包括染色技术、融点测定、紫外线吸收、放射性标记、荧光等。
1.分离效果较好：凝胶色谱法适用于大分子的分离和纯化，其孔隙结构可以提供较大的分离容量和分辨力，使得分子能够在孔隙中得到较好的分离。
同时，凝胶柱或凝胶片也具有选择性，可以根据分子的大小、电荷等属性进行分离。
2.操作简单：凝胶色谱法的实验操作相对简单，无需复杂的仪器和技术设备。
只需准备好凝胶材料和相应的缓冲液，加载样品后即可进行分离。
3.对样品损伤小：相对于其他分离技术，凝胶色谱法对样品的损伤较小。
由于分子是在凝胶材料中进行迁移，不会受到高温、高压等极端条件的影响，使得生物大分子能够得到较好的保护。
凝胶色谱法PPT课件
-
21
-
11
泵系统：
包括一个溶剂储存器、一套脱气装置和 一个高压泵。它的工作是使流动相（溶 剂）以恒定的流速流入色谱柱。泵的工 作状况好坏直接影响着最终数据的准确 性。越是精密的仪器，要求泵的工作状 态越稳定。要求流量的误差应该低于 0.01mL/min。
-
12
色谱柱：
GPC仪分离的核心部件。是在一根不锈钢空心 细管中加入孔径不同的微粒作为填料。
聚合物在分离柱上按分子流体力学体积大小被分离开基本原理基本原理分离原理流动分离分离原理体积排除色谱secsizeexclusionchromatography让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱柱中可供分子通行的路径有粒子间的间隙较大和粒子内的通孔较小
凝胶渗透色谱法
Gel Permeation Chromatography (GPC)
[η]1M1=[η]2M2 k1M1α1+1=k1M2α2+1 两边取对数：lgk1+(α1+1)lgM1=lgk2+(α2+1)lgM2 即如果已知标准样和被测高聚物的k、α值，就可 以由已知相对分子质量的标准样品M1标定待测样品的 相对分子质量M2。
-
10
实验部分
GPC仪的组成：
泵系统、（自动）进样系统、凝 胶色谱柱、检测系统和数据采集 与处理系统。
-
7
校正原理
用已知相对分子质量的单分散标准聚合物 预先做一条淋洗体积或淋洗时间和相对分子质 量对应关系曲线，该线称为“校正曲线”。聚 合物中几乎找不到单分散的标准样，一般用窄 分布的试样代替。在相同的测试条件下，做一 系列的GPC标准谱图，对应不同相对分子质量 样品的保留时间，以lgM对t作图，所得曲线即 为“校正曲线”。通过校正曲线，就能从GPC 谱图上计算各种所需相对分子质量与相对分子 质量分布的信息。
凝胶色谱法的制作
（1）凝胶色谱柱的制作：①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。
【注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底】③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。
④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体并安装其他附属结构。
（2）凝胶色谱柱的装填①过程计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量。
凝胶溶胀：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬液。
固定：将色谱柱装置垂直固定在支架上。
填充：将凝胶悬浮液一次性缓慢装填入色谱柱内。
洗涤平衡：用20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时，使凝胶装填紧密。
②注意事项a.商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需要在洗脱液中膨胀。
为了加速膨胀，可以在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温到近沸，则溶涨时间可以缩短到1~2小时。
热溶涨法不但节约时间，还可以杀死凝胶中产生的细菌、脱掉凝胶中的空气。
b.在色谱柱中填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。
一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；二是凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。
一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。
（3）样品加入与洗脱①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
④再调整缓冲液面：关闭出口，小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度。
⑤洗脱：打开下端出口，连接缓冲液洗脱瓶，用磷酸缓冲液洗脱。
⑥收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第一节 引言
2008 Spring 2008
b. 保留时间 ： 试样 保留时间tr： 从进样到出现峰极大 值时的时间。 值时的时间 。 它包括 组份随流动相通过柱 子的时间t0和组份在 子的时间 和组份在 固定相中滞留的时间 。 c. 保留体积 ：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通 保留体积Vr： 过的流动相的体积。 过的流动相的体积。
第七章 GPC
第二节 机理
2008 Spring 2008
载体是GPC产生分离作用的关键 载体是GPC产生分离作用的关键 GPC
仪器对载体的要求： GPC 仪器对载体的要求： 1.良好的化学稳定性和热稳定性； 1.良好的化学稳定性和热稳定性； 良好的化学稳定性和热稳定性 2.有一定的机械强度 2.有一定的机械强度 3.不易变形 不易变形; 3.不易变形; 4.流动阻力小 4.流动阻力小 5. 对试样没有吸附作用 6.分离范围越大越好 取决于孔径分布) 分离范围越大越好（ 6.分离范围越大越好（取决于孔径分布)等 7.载体的粒度愈小 愈均匀，堆积的愈紧密， 载体的粒度愈小， 7.载体的粒度愈小，愈均匀，堆积的愈紧密，色谱柱分离 效率愈高。 效率愈高。
第七章 GPC
第一节 引言
2008 Spring 2008
凝胶色谱法是一种新型的液体色谱 (Gel Permeation Chromatography 简称 GPC GPC) Gel 别名：体积排除色谱(Size 别名：体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography 简称 SEC) 凝胶过滤色谱(Gel 简称GFC) GFC)等 凝胶过滤色谱(Gel Filtration Chromatography 简称GFC)等。 从分离机理看，使用体积排除色谱(SEC)较为确切。 (SEC)较为确切 从分离机理看，使用体积排除色谱(SEC)较为确切。
第二节 机理
2008 Spring 2008
GPC色谱柱选择 GPC色谱柱选择 按照样品所溶解的溶剂来选择柱子所属系列 THF、氯仿、 THF、氯仿、DMF 必须选择合适的溶剂来溶解聚合物 按照样品分子量范围来选择柱子型号 样品分子量应该处在排阻极限和渗透极限范围内， 样品分子量应该处在排阻极限和渗透极限范围内，并且 最好是处在校正曲线线性范围内
第七章 GPC
第一节 引言
2008 Spring 2008
3 ） 保 留 值 (Retention
value, R) a. 死 时 间 (Dead time, t0) ： 不与固定
相作用的物质从进样到 出现峰极大值时的时间 ，它与色谱柱的空隙体 积成正比。 积成正比。由于该物质 不与固定相作用， 不与固定相作用，因此 ，其流速与流动相的流 速相近。 速相近。 第七章 GPC
• 间接方法
–GPC (for Mn, Mw and Mz) GPC 用标准品进样得到分子量校正曲线， 用标准品进样得到分子量校正曲线，间接算出聚合物 样品的相对分子量。如和标准品结构不同， 样品的相对分子量。如和标准品结构不同，还需进行 相应的计算才能得到聚合物样品自身的分子质量。 相应的计算才能得到聚合物样品自身的分子质量。
评价色谱柱性能的两个重要参数 柱效率N： 柱效率 ： 色谱柱的效率可借用“理论塔板数” 进行描述。 色谱柱的效率可借用“理论塔板数”N进行描述。 测定N的方法：用一种相对分子量均一的纯物质， 测定N的方法：用一种相对分子量均一的纯物质，如邻二氯 苯甲醇、乙腈、苯等， GPC测定 得到色谱峰， 测定， 苯、苯甲醇、乙腈、苯等，作GPC测定，得到色谱峰，从图 上可以求得从样品加入到出现峰顶位置的淋洗体积VR，以及 由峰的两侧曲线拐点出作出切线与基线所截得的基线宽度即 峰底宽W，然后按照下式进行计算N：
第七章 GPC
第一节 引言
2008 Spring 2008
1964年由J. Moore首先研究成功 1964年由J. C. Moore首先研究成功 年由 (J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 1964 2(2): 1964, 835~843) 在总结前人经验的基础上， 在总结前人经验的基础上，结合大网状结构离子交换 树脂制备的经验，将高交联度聚苯乙烯凝胶用作柱填料， 树脂制备的经验，将高交联度聚苯乙烯凝胶用作柱填料，同时 配以连续式高灵敏度的示差折光仪， 配以连续式高灵敏度的示差折光仪，制成了快速且自动化的高 聚物分子量及分子量分布的测定仪， 聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的 凝胶渗透色谱技术。 凝胶渗透色谱技术。
第七章 GPC
第二节 机理
2008 Spring 2008
当被分析的试样随着淋 洗溶剂引入柱子后， 洗溶剂引入柱子后，溶质分 子即向填料内部孔洞扩散。 子即向填料内部孔洞扩散。 较小的分子除了能进入大的 孔外，还能进入较小的孔； 孔外，还能进入较小的孔； 较大分子则只能进入较大的 孔；而比最大的孔还要大的 分子就只能留在填料颗粒之 间的空隙中。因此， 间的空隙中。因此，随着溶 剂的淋洗， 剂的淋洗，大小不同的分子 就得到分离， 就得到分离，较大的分子先 被淋洗出来， 被淋洗出来，较小的分子较 晚被淋洗出来。 晚被淋洗出来。
第一节 引言
2008 Spring 2008
色谱流出曲线（色谱图） 色谱流出曲线（色谱图）
混合组分的分离过程 及检测器对各组份在 不同阶段的响应
第七章 GPC
第一节 引言
2008 Spring 2008
色谱术语： 色谱术语： 1）基线：在实验条 基线： 件下， 件下，色谱柱后仅 有纯流动相进入检 测器时的流出曲线 称为基线，S/N大的 称为基线，S/N大的 、稳定的基线为水 平直线。 平直线。 2）峰高：色谱峰顶 峰高： 点与基线的距离。 点与基线的距离。
第七章 GPC
第一节 引言
2008 Spring 2008
主要特点 操作简便快捷、进样量小、 操作简便快捷、进样量小、 数据可靠且重现性好、自动化程度高等。 数据可靠且重现性好、自动化程度高等。 应用领域 应用于聚合物分子量及其分布、聚合物的支化度、 应用于聚合物分子量及其分布、聚合物的支化度、共聚 物及共混物的组成、聚合物分级及其结构分析、 物及共混物的组成、聚合物分级及其结构分析、高聚物中微 量添加剂的分析等。 量添加剂的分析等。如果配以在线的绝对分子量检测器 LALLS、MultiLS、DualLS等），凝胶 （如：LALLS、Multi-Angle LS、Dual-Angle LS等），凝胶 渗透色谱可以测定高聚物的绝对分子量。 渗透色谱可以测定高聚物的绝对分子量。
VR 2 N = 16( ) W
第七章 GPC
第二节 机理
2008 Spring 2008
VR 2 N = 16( ) W
对于相同长度的色谱柱， 值越大 意味着柱效率越高。 值越大， 对于相同长度的色谱柱，N值越大，意味着柱效率越高。
分离度R： 分离度 ：
2(V2 - V1 ) R= (W1 + W2 )
第七章 GPC
第二节 机理
2008 Spring 2008
Ve＝V0＋KVi K= Ve - Vi Vi
Ve: 溶质的淋出体积； 溶质的淋出体积； K : 分配系数 (孔体积 i中可以被溶质分子进入的部分与 i之比 孔体积V 孔体积 中可以被溶质分子进入的部分与V 之比) 特别大的溶质分子： 特别大的溶质分子：Ve＝V0，K＝0； ＝ ； 特别小的溶质分子： 特别小的溶质分子：Ve＝V0＋Vi，K＝1 ＝ 中等大小的溶质分子：V0 < Ve< V0+Vi，0 < K <1 中等大小的溶质分子：
第七章 GPC
第二节 机理
2008 Spring 2008
为什么要用GPC方法？ 方法？ 为什么要用 方法 相对分子量分布(多分散性指数) 相对分子量分布(多分散性指数)对聚合物的性质有重要影响 。 在相对分子质量分布（多分散性指数） 在相对分子质量分布（多分散性指数）成为人们关注的热点 经典方法却不能同时测定聚合物的相对分子质量分布。 后，经典方法却不能同时测定聚合物的相对分子质量分布。 凝胶渗透色谱(GPC)的应用改善了测试条件， (GPC)的应用改善了测试条件 凝胶渗透色谱(GPC)的应用改善了测试条件，并提供了可以同 时测定聚合物的相对分子质量及其分布的方法， 时测定聚合物的相对分子质量及其分布的方法，使其成为测 定高分子相对分子质量及其分布最常用、快速和有效的技术 定高分子相对分子质量及其分布最常用、 。
第二节 机理 平均分子量计算公式
2008 Spring 2008
Σ Hi 数均分子量 Mn = Σ (Hi / Mi)
重均分子量 Mw =
Hi： 峰高 ： Mi：分子量 ：
Σ Mi Hi Σ Hi
第七章 GPC
第二节 机理 测定聚合物分子量的方法
2008 Spring 2008
• 直接方法
–渗透压方法 (for Mn) 渗透压方法 –光散射方法 (for Mw) 光散射方法 –粘度方法 (for Mv) 粘度方法 –超速离心方法 (for Mz) 超速离心方法
第七章 GPC
第二节 机理
2008 Spring 2008
泵
进样器 进样器
色谱柱 柱温箱
检测器 检测器
示差检测器 示差检测器 检测 THF, 氯仿, DMF
GPC系统配置 GPC系统配置
第七章 GPC
第二节 机理
2008 Spring 2008
Waters 1515型凝胶渗透色谱仪 第七章 GPC
第二节 机理
2008 Spring 2008
排阻极限 渗透极限
GPC柱 柱
第七章 GPC
第二节 机理
2008 Spring 2008
GPC术语 术语 排阻极限 排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的 分子量。 分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒 内部，直接从凝胶颗粒外流出， 内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗 脱出来。 脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子 量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得 到分离。随固定相不同， 400至 到分离。随固定相不同，排阻极限范围约在 400至 60× 之间。 60×106之间。 渗透极限 能够完全进入凝胶颗粒孔穴内部的最大分子的分子量。 能够完全进入凝胶颗粒孔穴内部的最大分子的分子量。 在选择固定相时， 在选择固定相时，应使欲分离样品粒子的相对分子质量落在 固定相的渗透极限和排阻极限之间。 固定相的渗透极限和排阻极限之间。 第七章 GPC