油菜蜂花粉中不同分子量级分清除羟自由基的研究_孙丽萍

１．２．３ 蜂花粉酶解液的膜分离
采用卷式膜小型实验机进行花粉酶解物不同分子量 级分的分离。选用截留相对分子质量分别为 １００００、５０００、 １０００ 和 ２００Ｄ 的超滤膜和纳滤膜，操作压力为 ０．２０ＭＰａ，操 作温度为 ２ ０ ℃。分别将各膜的滤余液冻干保存。
１．２．４ 清除羟自由基的测定［１１］ 试管中依次加入 ０．４ｍｌ 的磷酸缓冲液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、
２．Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂａｉｈｕａ Ｂｅｅ－ｐｒｏｄｕｃｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ． Ｌｔｄ．， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１７６， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ｒａｐｅ ｂｅｅ ｐｏｌｌｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｂｙ ａｌｃａｌａｓｅ， ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎａｎｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｆｉｎａｌｌｙ ｔｈｅ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｆｅｎｔｏｎ ｓｙｓｔｅｍ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ ｈａｖｅ ｈｉｇｈｅｒ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ｏｒｉｇｉｎ． Ｔｈｅ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ２００ Ｄ ａｎｄ １０ ｋＤ ｓｈｏｗ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｔｈｅ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ５ ｋＤ ｔｏ１０ ｋＤ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ． Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｅｐ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｐｅ ｂｅｅ ｐｏｌｌｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｎ ｅｎｈａｎｃｅ ｉｔｓ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｒａｐｅ ｂｅｅ ｐｏｌｌｅｎ；ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ；ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ；ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ 中图分类号：Ｓ８９６．４；ＴＳ２０５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００８）０８－０５６５－０４
收稿日期：２００８－０４－２２ 基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目（ ２ ０ ０ ６ Ｂ Ａ Ｄ ０ ６ Ｂ ０ ４ ）；中国农业科学院科技经费项目 作者简介：孙丽萍（１９６３－） ，女，副研究员，研究方向为蜂产品功能因子的分离纯化。Ｅ－ｍａｉｌ ：ｃａａｓｕｎ＠１２６．ｃｏｍ
566 2008, Vol. 29, No. 08
Ｆ ｅ ２＋－ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ ＋ Ｈ ２Ｏ ２ → Ｆ ｅ ３＋－ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ ＋ Ｏ Ｈ － ＋ ·Ｏ Ｈ ＯＨ － ＋ ２－ 脱氧核糖→氧化产物（如丙二醛等） 氧化产物 ＋ Ｔ Ｂ Ａ →有色化合物 不加清除剂时吸光度为 Ａ 测定，加入样品若有清 除·Ｏ Ｈ 的作用，则能抑制氧化产物的生成，其吸光 度减少，测得吸光度为 Ａ 样品，试剂空白吸光度以 Ａ 对照 表示，则清除能力（ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ＳＡ）可按下式 计算： Ａ测定－Ａ样品 ＳＡ＝１ －———————× １００％ Ａ对照 研究表明，未水解的花粉水提物具有一定的清除羟 自由基的活性，将蜂花粉用碱性蛋白酶酶解反应 ３ｈ，其 酶解物对羟自由基的清除作用比花粉水提物有较大提
为确定花粉酶解物及不同相对分子质量级分对羟自 由基的清除能力，利用 Ｆｅｎｔｏｎ 体系产生的羟自由基，通 过考查分析自由基对 ２ － 脱氧核糖分子的氧化、破坏情 况，来确定样品的存在是否对羟自由基具有清除作用，保 护 ２－ 脱氧核糖分子不被羟自由基氧化、破坏。按 １．２．４ 的 方法检测清除·Ｏ Ｈ 的机理［ １ ２ ］：
生物在生理代谢过程中不断地产生各种自由基（ 如 Ｈ ２ Ｏ ２ 、·Ｏ Ｈ 和 Ｏ ２ ·等） 。在正常情况下，体内的自 由基的产生和清除处于动态平衡之中，但若是体内自由 基产生过多或清除过慢，在机体内达到一定的浓度时， 会对人体造成损害。如它们可以引发不饱和脂肪酸发生 脂质过氧化反应，损伤膜的结构，它们还进攻碳水化 合物、蛋白质、脂类、核酸等物质，加快机体的衰 老过程，并可诱发癌症、心血管疾病等诸多疾病［ １ － ２ ］。 在众多的自由基中，羟自由基是对机体危害最大的。羟 自由基是已知的最强的氧化剂，它比高锰酸钾和重铬酸 钾的氧化性还强，是氧气的三电子还原产物，反应性
极强，寿命极短，在水溶液中仅为 １ ０ －６ｓ ［３］。因此，羟 自由基的清除，对维持生物机体正常的生理活动和抗衰 老具有重要意义。
近年来有关生物活性肽清除羟自由基能力的研究已 经引起学术界的高度关注，其中包括：肌肽、谷胱甘 肽［ ４ ］ 、大豆蛋白酶解物［ ５ ］ 、扇贝多肽［ ６ ］ 、羊脾脏多肽［ ７ ］ 都已有相关研究证实它们都具有很强的抗氧化能力。油 菜蜂花粉含有近 ３０％ 的蛋白质，但水溶性蛋白含量低［８］， 尤其是小分子肽的含量更低，在很大程度上影响了其功 效的发挥。酶解蜂花粉的研究开展的比较晚，酶解物 生物活性的报道也比较少。但蜂花粉富含氨基酸、蛋
ｐＨ７．４），０．１ｍｌ 一定浓度的样品，０．１ｍｌ 的 ＥＤＴＡ 溶液 （１．０４ｍｍｏｌ／Ｌ），０．１ｍｌ 的 ＦｅＳＯ４ 溶液（１ｍｍｏｌ／Ｌ），０．１ｍｌ 的 ＶＣ 溶液（１ｍｍｏｌ／Ｌ），０．１ｍｌ 的 Ｈ２Ｏ２（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），０．１ｍｌ 的 ２－ 脱氧 －Ｄ－ 核糖溶液（ＤＲ，６０ｍｍｏｌ／Ｌ），定容到 １．０ｍｌ， 混合后置于 ３７℃恒温水浴中反应 ６０ｍｉｎ，然后加入 ２．０ｍｌ 的 ＴＣＡ－ＴＢＡ－ＨＣｌ 混合液，混匀、置沸水浴反应 １５ｍｉｎ， ５０００ｒ／ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ，以蒸馏水作空白，在波长 ５３２ｎｍ 处测吸光度。
本研究采用酶解技术将蜂花粉中大分子蛋白转化成 不同相对分子量的活性肽，并采用相对分子质量分级的 办法将有效组分同无效组分进行分离，去除蜂花粉中的 小分子糖、加工过程中的离子成分以及大分子蛋白等不 具有清除羟自由基功能的成分，达到浓缩有效组分的目 的。最后用 Ｆｅｎｔｏｎ 体系研究了蜂花粉的不同相对分子质 量级分抑制羟自由基的能力，对膜分离技术在蜂花粉分 离中的应用作出评价。
２ 结果与分析
２．１ 花粉酶解物对羟自由基的清除作用 本研究通过酶解技术将蜂花粉中的大分子蛋白（水溶
性和水不溶性） 转化为可溶性小分子肽，多肽的溶解性 大于大分子的蛋白，可以提高提取得率并增加其生物活 性，实验显示通过酶解，花粉的提取率得到显著增加， 普通水提物的提取率为 ３ ９ ％ 而花粉酶解物的提取率为 ４ ９ ％ ，酶解液中可溶性氮的比率由未水解前的 ８ ％ 增加 到 ３４％ 以上，说明花粉中一些大分子的难溶性或水不溶 性蛋白已经降解为可溶性小分子肽了，使提取率提高了 １０％。
近年来，膜分离方法在天然产物有效部位的分离方 面已崭露头角，其中超纳滤膜技术特别适用于不同相对 分子质量混合物的分离，已在药业和保健行业中得到广 泛的应用。大量实验结果表明［１３－１５］，膜分离方法操作简 单、能耗低，分离过程中不与功效成分发生作用，能 明显降低损耗和成本，越来越受到人们的青睐。实验 中为避免花粉酶解液中含有的固体颗粒在膜分离过程中 对超纳滤膜带来不利的影响，酶解液先用孔径为 １ ０μｍ 的微孔滤膜进行预处理得微滤液，然后用截留相对分子 质量（ＭＷ）为 １００００Ｄ 和 ５０００Ｄ 的超滤膜和截留相对分子质 量为 １０００Ｄ 和 ２００Ｄ 的纳滤膜依次对蜂花粉酶解微滤液进 行分离，经上述膜分离后最终得到相对分子质量不同的 四个级分，即：Ｍ ＞ １００００，５０００ ＜ Ｍ ＜ １００００，１０００ ＜ Ｍ ＜ ５ ０ ０ ０ ，２ ０ ０ ＜ Ｍ ＜ １ ０ ０ ０。
食品科学
※营养卫生
白质、维生素、矿物质、脂肪酸、碳水化合物、黄 酮类物质等多种营养和功效成分，是许多具有营养价值 和药效价值的物质所组成的复杂浓缩物［ ８ ］ ，在营养、保 健、化妆品、医疗等领域得到广泛的应用。蜂花粉是 一种混合物，从药学的角度而言，混合物中小的相对 分子质量化合物是使中药具有药理作用的主要成分［ ９ ］ ， 而相对分子质量高的化合物中的绝大多数（ 如淀粉、胶 质、纤维素等成分） 对疾病的治疗并没有太大的作用。 这些成分增加了药物的用量，带来服用时的不便。对 于蜂花粉而言同样存在这种情况，过去一些年，研究 较多的是全花粉的功效，对于有效组分的研究进行的较 少，特别是按相对分子质量的大小分离有效成分的研究 鲜有报道。
１ 材料与方法
１．１ 材料、试剂与仪器 超滤膜和纳滤膜：截留相对分子质量分别为
１００００、５０００、１０００ 和 ２００Ｄ，其中 ５０００Ｄ 和 １００００Ｄ 膜 的材质为聚醚砜，１ ０ ０ ０ Ｄ 膜的材质为聚醚酮，２ ０ ０ Ｄ 膜 的材质为聚酰胺。
油菜蜂花粉由北京中蜜科技开发有限公司提供，经 低温微粉破壁后备用；碱性蛋白酶（２０ 万 Ｕ／ｇ，食品级） 南宁东恒华道生物科技有限பைடு நூலகம்任公司；其余试剂均为市 售分析纯。
膜及卷式膜小型实验机 大连屹东膜工程设备有限 公司。 １．２ 方法
１．２．１ 花粉水提物的制备［１０］ 选用破壁油菜蜂花粉，脱脂后加去离子水室温进行
震荡提取、离心、收集清液、冻干保存。
１．２．２ 蜂花粉酶解液的制备［１０］ 破壁油菜蜂花粉脱脂后加去离子水和碱性蛋白酶
３０００Ｕ／ｇ，在 ｐＨ９．０、５０ ℃条件下酶解 ３ｈ ，灭酶，离 心，收集的清液即为花粉酶解液。将花粉酶解液通过 １０μｍ 的微孔滤膜去除微粒，滤液保存以备膜分离之用。 取部分酶解液冻干保存。
※营养卫生
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