大鼠重组腺病毒载体RP105的构建和鉴定
多药耐药基因-腺病毒重组表达载体的构建及鉴定
多药耐药基因－腺病毒重组表达载体的构建及鉴定【摘要】目的构建多药耐药（multidrug resistance，MDR）基因-腺病毒重组表达载体。
方法将MDR1基因插入到腺病毒载体，用磷酸钙沉淀法将此重组载体转染到293细胞，制备重组病毒悬液并感染靶细胞进行鉴定。
结果构建的MDR1-腺病毒载体在293细胞中大量产生，病毒滴度达109 PFU/ml，此病毒感染靶细胞后，在靶细胞中有MDR1基因的表达。
结论成功构建了MDR1-腺病毒重组表达载体。
【Abstract】Objective Construction of multi-drug resistance gene (MDR) - adenoviral recombinant expression vector．Methods MDR1 gene will be inserted into the adenovirus vector，by calcium phosphate precipitation method the recombinant plasmidtransfect into 293 cells．Recombinant virus suspension is made and infeced target cells and to indentify．Results Constructed MDR1- adenovirus vector produces a large number in 293 cells，the virus titer is up to 109 PFU/ml．After the recombinant virus infectedtarget cells in the target cells have the expression of MDR1 gene．Conclusion MDR1- recombinant adenorirus vector has been successfully constructcd．【Key words】Multi-drug resistance gene (MDR1)；Adenovirus vector；Transfection多药耐药性（multidrug resistance，MDR ）是指肿瘤细胞能对多种结构、功能及杀伤机制均不同的化疗药物产生耐受。
大鼠CREB结合蛋白RNA干扰重组慢病毒载体的构建与鉴定
ｓｇ ｄ ａ ｙ ｈ ｓｚ ｄ， ｎｄ ｔ ｅ ｂｅ ｔｏｎ ａ ｌ ｅ ｎｔ ｈｅ ｐＦＵ — Ｗ —ＲＮ Ａ ｅ ｔ ｒ ｔ ｏ ｓ ｒ ｃ ｉ ｎｅ ｎｄ ｓ ｎｔ ｅ ｉｅ ａ ｈ ｓ ｅ ｗ ｓ ｃｏｎ ｄ ｉ ｏ ｔ Ｇ ｉ ｖ ｃｏ ｏ ｃ ｎ ｔｕ ｔ
ＣＲＥ ｉ ｄ ｎ ｒ ｔ ｉ （ Ｐ） ｇ ｎ ， ｎ ｂ ｅ ｖ ｈ ｆ ｅ ｔ ｆＣＢＰ ｇ ｎ ｉ ｎ ｉ ｇ ｉ ａ ａ ｃ ｌｒ Ｂ ｂ ｎ ｉ ｇ ｐ ｏ ｅ ｎ ＣＢ ｅ ｅ ａ ｄ ｏ ｓ ｒ ｅ ｔ ｅ ｅｆｃ ｓｏ ｅ ｅ ｓｌ ｃｎ ｎ ｒ ｔｖ ｓ ｕ ａ ｅ
ｔ ｅ ｉ ｒ ｌｅ ｐ ｅ ｓｏ ｅ ｔ ｒ ｃ ｎｔ ｉ ｎ ｈｅ ｌｎｔｖｉａ ｘ ｒ ｓ ｉ ｎ ｖ ｃ ｏ ｏ ａｎｉ ｇ ＣＢＰ ｓ ｈＲＮＡ （ ＬＶ— ＣＢＰ ｈ ｓ ＲＮＡ） ．ＬＶ— ＣＢＰ ｈＲＮＡ ｏｎ ｓ ｃ — ｆｒ ｄ ｂ ｉｍｅ ｙ ＰＣＲ ｎ ａ ｄ ＤＮＡ ｅ ｕ ｎｃｎ ｓ ｑ ｅ ｉ ｇ ｗａｓｓ ｓ ｑ ｎ ｌ ｏ ｒ ｎ ｆ ｃ ｅ ｔ ａ ｋ ｇ ｎｇ ｐｌ ｓ ｄ ｎ ｏ ｕｂ ｅ ｕｅ ｔｙ ｃ ｔ ａ ｓ ｅ ｔ ｄ ｗｉｈ ｐ ｃ ａ ｉ ａ ｍｉ ｓ ｉ ｔ ２ ３ ｃ ｌｓ ｂｙ Ｌｉ ｏｆ ｃ ａ ｎ ００ ． ｅ ｔｔ ｒ ｏ ｒ ｓ ｗａ ｔ ｃ ｅ ｃ ｏ ｄｉ ｇ ｔ ｈｅ ｅ ｒ ｓ ｉ ｆ ９ Ｔ ｅ ｌ ｐ ｅ ｔ ｍｉ ｅ ２ ０ Ｔｈ ｉｅ ｆｖｉｕ ｓ ｄｅ ｅ ｔ ｄ ａ ｃ ｒ ｎ ｏ ｔ ｘｐ ｅ ｓｏｎ ｏ
大鼠IP-10-PE38KDEL重组免疫毒素原核表达载体的构建及表达
大鼠IP-10-PE38KDEL重组免疫毒素原核表达载体的构建及表达1林媛1，祁志荣1，李明远1，孙岚1，蒋忠华1，张林2，李虹1＊1 四川大学基础医学与法医学院微生物学教研室，成都（610041）2 四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，成都（610041）E-mail：linyuan1982@摘要：目的构建大鼠γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)基因和绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL基因的原核融合表达载体，并对其表达进行鉴定。
方法通过PCR获得本实验所需要的IP-10基因片段，通过酶切含有PE38KDEL的质粒PRKL459K获得绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL基因，再通过适当的酶切及连接反应，构建IP-10与PE38KDEL融合基因的原核表达载体pET-32a(+)-IP-10-PE38KDEL，重组质粒经限制性内切酶、PCR及DNA 序列测定证实构建成功后，转化感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE及Western-blotting分析证实其相对分子质量和特异性。
结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实，IP-10-PE38KDEL融合基因被成功克隆入原核表达载体pET-32a(+)，并在大肠杆菌中稳定表达，表达产物的相对分子质量与预期值相符，且所表达蛋白可被抗PE 的特异性抗体识别。
结论成功构建了原核表达载体pET-32a(+)-IP-10-PE38KDEL，其融合基因在大肠杆菌中高效表达，为进一步研究其功能奠定了基础。
关键词：IP-10，绿脓杆菌外毒素，重组免疫毒素，原核表达中图分类号：R392.11 文献标识码：Aγ干扰素诱导蛋白-10(IFN-γ-inducible protein,IP-10)，是CXC家族类趋化因子之一，又名CXC趋化因子配体10(CXCL10)，在体内由IFN-γ诱导产生。
IP-10是由Luster等在1985年用IFN-γ刺激U937细胞株后，通过杂交的方法从cDNA基因库中筛选出来的〔1〕。
大鼠瘦素基因重组腺相关病毒的构建及在原代神经元细胞中的过表达
中 国实 验 动 物 学 报
ＡＣＴ Ａ Ｌ ＡＢ ＯＲ Ａ ＴＯＲＩ ＵＭ ＡＮＩ ＭＡＬ Ｉ Ｓ Ｓ Ｃ Ｉ ＥＮＴ Ｉ Ａ Ｓ Ｉ ＮＩ Ｃ Ａ
Ｏｃ ｔ ｏ ｂ ｅ ｒ ， ２ ０ １ ３ Ｖ０ １ ３ ８ ０ ８ ）
【 摘要 】 目的
构建携带 大 鼠瘦 素（ １ ｅ ｐ ｔ ｉ ｎ ） 基 因的重组 腺相关病 毒 （ ａ ｄ ｅ ｎ ｏ — ａ ｓ ｓ ｏ ｃ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ， Ａ Ａ Ｖ） ， 并 鉴定 其
在 原代 鼠 神 经元 细胞 中介 导 的 瘦 素 过 表 达 ， 为 肥 胖 症 基 因 治 疗 研 究 奠 定 实 验 基 础 。 方 法 提 取 大 鼠脂 肪 组 织 总 Ｒ Ｎ Ａ， 利用 Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ技 术 ， 获取 目的基 因瘦 素 ｃ Ｄ Ｎ Ａ， 通过重组 Ｄ Ｎ Ａ技 术 ， 得 到瘦 素 ｃ Ｄ Ｎ Ａ与 ｐ Ｇ Ｅ Ｍ— Ｔ载 体 的 重 组 质 粒， 阳性 重 组 子 用 Ｐ Ｃ Ｒ及 测 序 分 析 鉴 定 。用 Ｓ ｐ ｅ Ｉ 和Ｅ ｃ ｏ Ｒ Ｖ双酶切将 ｐ Ｇ Ｅ Ｍ— Ｌ ｅ ｐ ｔ ｉ ｎ中 的瘦 素基 因 片 段 切 出 ， 再 克 隆到 Ａ Ａ Ｖ ２表 达 质 粒 ｐ Ｔ Ｒ — Ｕ Ｆ ２ ２中 ， 构建瘦素重组 Ａ Ａ Ｖ ２载 体 ｐ Ａ Ａ Ｖ ２ － Ｃ Ｂ Ａ — ｌ ｅ ｐ ｔ ｉ ｎ 。以 ｐ Ｄ Ｇ作 为 辅 助 质 粒 用 Ｈ Ｅ Ｋ ２ ９ ３ 细胞包装 Ａ Ａ Ｖ ２ 一 Ｃ Ｂ Ａ — Ｌ ｅ ｐ ｔ ｉ ｎ ， 并用一步重力流柱法纯化病毒 ， 由荧光定量 Ｐ Ｃ Ｒ 测 定 病 毒 基 因组 Ｄ Ｎ Ａ 的拷 贝 数 即 为 病毒滴度。然后将 Ａ Ａ Ｖ ２ ． Ｃ Ｂ Ａ— Ｌ ｅ ｐ ｔ ｉ ｎ及 对 照 病 毒 Ａ Ａ Ｖ ２ 一 Ｃ Ｂ Ａ — Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ感 染 大 鼠原 代 神 经 元 细 胞 ， 分 别 用 免 疫 染 色 和
大鼠降钙素基因相关肽重组腺病毒的构建与鉴定
【 ｂｔ ｃ】 Ｏ ｊ ｔ ｅ ｏ ｏｓｕｔ ｃｍ ｉ ｎ ａｅｏ ｒ ｅ ｏ ｏ ｒ ａ ｉｎ ｅｅ ｒａ ｄｐｐｄ Ａ ｓ ａｔ ｒ ｂｅ ｉ Ｔ ｎ ｒ ｒ ｏ ｂ ａｔ ｄｎｖｕ ｖｃｒ ｆａ ｅ ｅｏｉ ｇｎ ・ ｌｅ ｔｅ ｃｖ ｃ ｔｃａｅ ｎ ｉ ｓ ｔ ｔ ｌｔ ｎ ｅｔ ｅ ｉ
ｔｃ ｎ ｑ ｅ ａ ｌ ｙ ｔｒ ｅ ｅ ｅ． ｅ ｆ ｌ ｌｎ ｈ ｏ ＲＰ Ｈｉ ｅ ｅ ｅ ＮＡ ａ ｌｎ ｎｏ ｔ ｅ ｈ ｔ ｅ ｐａ ｍｉ ｅ ｈ ｉｕ ｍｐ ｉ ａｇ ｔ ｇ ｎ Ｔｈ ｕｌ ｅ ｇ ｆ ＣＧ ／ ｓ ｇ ｎ Ｄ ｆ ・ ｔ ｓ ｗ ｓ ｃ ｏ ｅ ｉ ｔ ｈ ｓ ｕ ｔ ｌ ｓ ｄ－ ｄ ｌ ｐ ＤＣ３ ６， ｅ ｅｏ ｅ ｔ ｅ ｒ ｏ ｉａ ｔ ｌ ｍｉ ＤＣ３ ６ Ｃ Ｐ Ｈｉ ｓｆ ａ ｄ Ｃｈ ｏ ｅ ｔ ｅ ｒ ｈ ｌ ｓ ｄ ｂ ｑ ｅ ｃｎ １ ｔ ｒ ｆｒ ｅ ｍｂ ｎ ａ ｄ ｐ ｈ ｈ ｃ ｎ ｐｓ １ － ＧＲ ／ ｓｗａ ｍｅ ． ｏ ｓ ｉ ｔ ａ ｍｉ ｙ ｓ ｕ ｎ ｉ ｇ ｏ ｈ ｇ ｐ ｅ ｎ ｅ ｔ Ｏ ｔ ｎ ｆ ｅ ９ Ａ ｃ ｌ ｗ ｔ ｔ ｅ ｓ ｅｅ ｏ ｌｓ ｄ— Ｂ ａ ｄ ｌｔ ｉ Ｃ — ａ ｓｅ ｔ ２ ３ ｅｌ ｉ ｈ ｋｌ ｔ ｎ ｐａ ｍｉ ｐ ＨＧ ｏ ｄ ｌ ３ ｒ ．Ｐ ｃ ａ ｅ ｒ ｃ ｍｂ ｎ ｔ ａ ｅ ｏ ｉ ｓ ｒ ｓ ｈ ｌｘ ｅ Ｅ１ ｅ ｅ ａ ｋ ｇ ｅ ｏ ｉ ａ ｄ ｎ ｖｒ ｎ ｕ
VEGF_(121)重组腺相关病毒载体的构建与鉴定
VEGF_(121)重组腺相关病毒载体的构建与鉴定
基因治疗是目前治疗多种疾病的一种新兴领域，而腺相关病毒（Adenovirus，Ad）是作为基因治疗载体的热门选择之一。
其中，VEGF_（121）是一种血管内皮生长因子，已证明在血管
生成和血管再生上具有重要作用。
因此，VEGF_（121）重组
腺相关病毒载体的构建与鉴定具有重要意义。
首先，基于Ad常见的载体pAdEasy-1，使用PCR扩增的方法
获得VEGF_（121）基因的DNA序列，并构建出VEGF_（121）的表达质粒。
然后，将VEGF_（121）的DNA序列克隆到pAdEasy-1载体上，利用从BHG-10细胞中提取到的腺病
毒全长基因组，采用电穿孔法将表达质粒转染到细胞中，经过筛选和扩增，得到表达VEGF_（121）的重组腺相关病毒载体。
接下来，为了验证得到的重组病毒是否达到预期效果，需要进行病毒鉴定工作。
首先，通过PCR和测序等手段鉴定重组载
体里VEGF_（121）的插入位点是否正确，并进一步检查重组
病毒的序列信息是否与预期一致。
然后，将获得的重组病毒接种于细胞培养基中，观察细胞内是否有VEGF_（121）的表达，以及血管生成和血管再生是否有一定的增加。
最后，通过动物试验验证重组病毒是否具有较好的生物学活性和安全性。
总之，VEGF_（121）重组腺相关病毒载体的构建与鉴定是一
个复杂的过程，需要综合运用分子生物学、细胞生物学和动物学等相关知识和技术，才能保证重组病毒达到预期效果，并在基因治疗中发挥重要作用。
重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定的开题报告
重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定的开题报告一、研究背景和意义腺病毒是一种广泛存在于哺乳动物中的DNA病毒，能够感染多种类型的细胞，具有高效的基因转导能力和良好的安全性。
因此，腺病毒已经成为了重要的基因转导载体，被广泛应用于基因治疗、基因工程和生物学研究等领域。
其中，重组腺病毒作为基因转导载体具有如下的优点：（1）能够稳定地表达外源基因：腺病毒具有较高的基因转导率，可以长时间稳定地表达外源基因，从而实现目标蛋白的大量表达。
（2）病毒颗粒结构复杂：腺病毒颗粒结构复杂，能够有效地包装外源基因，从而保证表达的效率和精度。
（3）有良好的生物安全性：腺病毒基因组不会整合到宿主细胞基因组中，从而减少对宿主基因组的影响，有良好的生物安全性。
本研究主要针对重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定展开，主要研究内容包括以下几个方面：1. 进一步优化pAd-CD载体的构建，提高其基因转导效率。
2. 针对pAd-CD载体的具体应用领域，开展针对性的效果评价和分析。
3. 探索pAd-CD载体在基因治疗、基因工程和生物学研究等方面的应用潜力。
本研究的开展能够拓展腺病毒在基因转导载体方面的应用范围，对基因治疗、生物学研究等领域具有一定的应用前景。
二、主要研究内容和研究方案1. 重组腺病毒载体pAd-CD的构建（1）提取并纯化腺病毒：采用经典的离心法等分离技术，从已知类型的腺病毒细胞株中提取并纯化腺病毒。
（2）选择并设计适合的pAd-CD载体：根据研究方向选择并设计适合的重组腺病毒载体。
（3）克隆外源基因：将目标基因与pAd-CD载体进行克隆，形成包含外源基因的载体。
（4）包装重组腺病毒：使用适当的技术和装置，将载体转化为重组腺病毒并包装成病毒颗粒。
2. 重组腺病毒载体pAd-CD的鉴定（1）DNA测序鉴定：使用合适的方法对构建出的pAd-CD载体进行测序鉴定。
（2）病毒包装率检测：测定包装率，评估重组腺病毒的制备质量。
（2）病毒的基因转导效率检测：采用不同的检测方法检测病毒的基因转导效率，分析重组腺病毒的基因转导效率及其影响因素。
腺病毒载体的构建和应用
腺病毒载体的构建和应用随着生物工程技术的不断发展，越来越多的生物医学研究领域开始趋向于基因治疗和基因编辑等方向。
这些技术的实现需要一种特殊的工具——腺病毒载体。
腺病毒（Adenovirus）是一种不包含RNA病毒的DNA病毒，其表面包裹着许多蛋白质，使其具有较好的基因导入能力。
这使得腺病毒成为一种常用的基因载体，被广泛应用于细胞遗传学、基因治疗等领域。
腺病毒的构成腺病毒包含一个大小为36 kb的线性双链DNA，这条DNA上编码了丰富的基因信息，其中大约包含40个基因左右。
腺病毒分为革兰氏正染色体和非冠状病毒两种类型，目前在研究中应用最多的是非冠状病毒型腺病毒。
腺病毒载体构建的两种方法目前有两种主要的构建腺病毒载体的方法，分别是端到端的法和质粒基因重组的法。
端到端的法端到端的法在构建腺病毒载体时需要把目标基因全长克隆进腺病毒的基因组中。
这种方法在基因克隆、重组和转染等方面比较复杂，对实验人员的操作技能要求较高。
同时，这种方法的构建产物相对来说比较容易受到细胞内DNA修饰和限制性酶的影响。
质粒基因重组的法对比之下，质粒基因重组的法相对来说较为容易，需要构建的重组质粒包括表示目标基因的转录单元以及与腺病毒DNA重组所需的旁路序列等。
通过将质粒DNA转染至腺病毒蛋白质、酶和基因表达产物等组分共同构成的细胞核中，将质粒DNA与腺病毒DNA进行重组，从而构建出目标腺病毒载体。
质粒基因重组法不仅可以有效克服端到端法受到限制性酶和DNA修饰的影响，而且富于设计灵活度，从而满足更多的实验需求。
腺病毒载体的应用腺病毒载体广泛应用于人类和动物细胞体内的基因传递、基因治疗和基因工程方面。
通过腺病毒载体可进行基因敲除、基因转录和基因转译等一系列基因编辑操作。
基因敲除基因敲除是研究腺病毒载体理解生命过程和信号转导途径的重要手段之一。
通过基因敲除的方法可以对特定基因进行敲除，从而寻找与该基因相关联的复杂的生物学催化剂。
目前腺病毒载体敲除方法尤其得到广泛应用，对于生命科学研究者来说具有重要的意义。
大鼠carabin腺病毒干扰载体构建及功能鉴定
［文章编号］1000-2200(2021)03-0291-04-基础医学•大鼠carabin腺病毒干扰载体构建及功能鉴定程阔菊1，吴庆2，罗健华「，魏谭军「，周殿儒1，肖成1，黄河2，罗云1，王毅1［摘要］目的：构建高滴度大鼠carabin腺病毒干扰载体(Ad-carabin-shRNA)。
方法：设计3对carabin-shRNA寡核苷酸序列，分别构建3个ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA腺病毒穿梭质粒，将构建好的ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA和pHBAd-BHG质粒共转染293A细胞，以包装Ad-carabin-shRNA,采用微量全细胞病变法检测病毒滴度。
Ad-carabin-shRNA感染H9C2心肌细胞，实时荧光定量PCR和Western blotting检测carabin mRNA及蛋白表达。
结果：3个ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA干扰质粒构建成功，相对应的Ad-carabin-shRNA包装顺利，病毒滴度均为9X108TU/mL。
感染H9C2心肌细胞后，Ad-carabin-shRNA-l和Ad-carabin-shRNA-2均有显著干扰效果,carabin mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.01)。
结论:Ad-carabin-shRNA构建成功，在心肌细胞中具有干扰carabin的效应。
［关键词］腺病毒；carabin；干扰载体;心肌梗死;心肌缺血［中图法分类号］R373.1［文献标志码］A DOI：10.13898/ki.issn.1000-2200.2021.03.003Construction and function identification of rat carabin adenovirus interference vectorCHENG Kuo-ju1,WU Qing2,LUO Jian-hua1,WEI Tan-jun1,ZHOU Dian-ru1,XIAO Cheng1,HUANG He2,LUO Yun1,WANG Yi1(1.Department of Pharmacy,Dazhou Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine,Dazhou Sichuan635000；2.Department of Anesthesiology,The Second Affiliated Hospital,Army Medical University,Chongqing400037,China)［Abstract］Objective:To construct rat carabin adenovirus interference vectors(Ad-carabin-shRNA)with high titers.Methods：Three pairs of carabin-shRNA oligonucleotide sequences were synthesized to construct ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA shuttle plasmid.The ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA shuttle plasmid and pHBAd-BHG plasmid were co-transfected into293A cells to pack the Ad-carabin-shRNA.Viral titer was detected by whole-cell microlesion assay.H9C2myocardial cells were infected with the Ad-carabin-shRNA，and the expression of carabin mRNA and protein was detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting，respectively.Results:Three ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA interference plasmids were successfully constructed,and the package of ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA was successful.The titer of Ad-carabin-shRNA was9X108TU/mL.The expression of carabin mRNA and protein was significantly downregulated in H9C2myocardial cells after infected by Ad-carabin-shRNA-1and Ad-carabin-shRNA-2 (P<0.01).Conclusions：The construction of Ad-carabin-shRNA is successful，which exhibits interfering effect on carabin in H9C2 myocardial cells.［Key words］adenovirus；carabin；interference vector；myocardial infarction；myocardial ischemiacarabin是2007年在人T细胞中发现的一个新的钙调磷酸酶（calcineurin,CaN）结合蛋白，主要表达于脾脏及血液中［1］，同时可与Ras结合，基于其与CaN和Ras均能相互作用的特性，将其命名为carabin［1］。
一种利用腺病毒载体构建小肠降表达胰岛素大鼠模型的方法[发明专利]
![一种利用腺病毒载体构建小肠降表达胰岛素大鼠模型的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/a217c7d60912a2161579295e.png)
专利名称：一种利用腺病毒载体构建小肠降表达胰岛素大鼠模型的方法
专利类型：发明专利
发明人：郭刚,张瑞,孙蓓,陈皓
申请号：CN201810727184.X
申请日：20180705
公开号：CN108795984A
公开日：
20181113
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种利用腺病毒载体构建小肠降表达胰岛素的大鼠模型的方法。
主要包括腺病毒载体的构建，腺病毒载体转染大鼠小肠的方法。
本发明利用腺病毒载体携带大鼠反义mRNA胰岛素基因，通过灌胃大鼠，三个月可以造成大鼠小肠胰岛素降表达，而且能造成该大鼠胰岛素耐量和口服糖耐量降低。
这种动物模型，对于进一步开发治疗糖尿病的药物，具有广泛的应用前景。
申请人：天津医科大学
地址：300070 天津市和平区气象台路22号
国籍：CN
代理机构：天津市杰盈专利代理有限公司
代理人：朱红星
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腺病毒载体构建
腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白，分为早期达和晚 期表达。
早期表达的蛋白是功能蛋白，晚期表达的有功能蛋白也有结构蛋白，并 且早期的功能蛋白能够调控晚期蛋白的表达。
早期表达的E1区蛋白（甚至包括E2区蛋白）是腺病毒基因组复制、病毒 包装和其他蛋白表达翻译所必须的，但其对细胞毒性也是很强的。
•腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具 有严格的寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感冒 症状、呼吸系统不适等。
腺病毒 是一种大分子线性双链无包膜DNA病毒。它 通过 受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病 毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整 合进入宿主细胞基因组中.
腺病毒的基因及其功能
腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在 连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。
宿主范 可转入分裂后的非分裂细胞中发挥作用，可以感染处
围广
于分裂状态的细胞。
感染 性
强
可经不同途径进入不同组织(可以在肠道内繁殖，也可 以 在呼吸道内繁殖。
包装容量 改建腺病毒基因部分缺失载体的克隆容量可达10kb， 大 腺病毒基因完全缺失载体克隆容量可达37kb。
第二代腺病毒载体：一般将E2A或E4基因缺失的腺病毒载体成为二代
载体。产生的免疫反应较弱，其安全性和载体容 量有所改进，但病毒包装难度和出毒滴度下降厉 害，应用局限。
第三代腺病毒载体：缺失了全部的（无病毒载体等）或大部分腺病毒
基因，仅保留ITR和包装信号序列。这一载体系 统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
E2蛋白涉及AdDNA复制 E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统 E4蛋白调节有效的晚期基因转录
大鼠FXYD5基因的克隆及重组腺病毒载体的构建的开题报告
大鼠FXYD5基因的克隆及重组腺病毒载体的构建的开题报告一、研究背景和意义FXYD家族蛋白是一类调节离子通道和转运蛋白质的本体蛋白，FXYD5是其中一员，也称为dysadherin或者prostate-associated androgen-regulated gene 1 (PAGE-1)。
FXYD5在多种癌症中的异常表达与患者的预后密切相关，包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌、肾癌等。
对于FXYD5的研究能够揭示其在肿瘤发生和发展中的作用，为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路。
重组腺病毒作为一种传统基因工程技术，因其高效性、低毒性、大载荷和广谱转染等特点，已成为研究FXYD5功能和机制的重要工具，同时也为临床基因治疗提供了新的方法和途径。
因此，本研究旨在克隆大鼠FXYD5基因，并构建重组腺病毒载体，从而为深入研究FXYD5的功能和机制提供工具和手段。
二、研究内容和方法1. 克隆大鼠FXYD5基因：从大鼠基因组中设计引物，扩增大鼠FXYD5基因，将其克隆至质粒载体中，利用测序进行基因确认。
2. 构建重组腺病毒载体：将FXYD5基因与重组腺病毒载体进行重组，在适当的细胞中进行病毒包装和扩增，最终得到高纯度的重组腺病毒载体。
3. 鉴定重组腺病毒：通过PCR和Western blotting等方法对重组腺病毒进行鉴定和表达检测，确定重组腺病毒的纯度和活性，为后续的细胞转染和动物实验提供可靠的实验基础。
三、预期结果和意义1. 成功克隆大鼠FXYD5基因，为FXYD5功能和机制的研究提供了工具和手段。
2. 成功构建重组腺病毒载体，为进一步探究FXYD5在肿瘤发生和发展中的作用提供了新的思路和方法。
3. 通过鉴定和表达检测，确定重组腺病毒的纯度和活性，为后续的细胞转染和动物实验提供可靠的实验基础。
大鼠HSG基因重组腺病毒载体的构建及鉴定
大鼠HSG基因重组腺病毒载体的构建及鉴定郭晖;王占伟;郝文炯;赵巍;沈冰【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷),期】2013(0)6【摘要】目的构建大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene,rHSG)的腺病毒载体,观察其在转染大鼠C6胶质瘤细胞后的表达.方法由前期构建的pGM-T-rHSG质粒中酶切rHSG基因片段,亚克隆入 pShuttle-CMV-EGFP重组穿梭载体中,而后与腺病毒骨架质粒pAdxsi酶切连接,经过抗性筛选及酶切鉴定得到阳性的pAdxsi-GFP-rHSG重组质粒；pAdxsi-GFP-rHSG质粒经PacI线性化后转染293细胞,包装重组腺病毒,进行PCR鉴定和PCR产物测序鉴定,Westem-blot法检测C6胶质瘤细胞转染rHSG后的表达效果.结果酶切鉴定证实rHSG基因正确插入穿梭载体pShuttle-CMV-EGFP,收获病毒后的PCR及测序鉴定pAdxsi-GFP-rHSG重组成功,并能在C6胶质瘤细胞内高效表达.结论成功构建出了介导大鼠增殖抑制基因的腺病毒载体pAdxsi-GFP-rHSG,能在C6胶质瘤细胞内高效表达.%Objective To construct a recombinant adenovirs encoding rat hyperplasia suppressor gene (rHSG) and to investigate the the expression of it on rat C6 brain glioma cells.Methods The rHSG gene was extracted by enzymaticcuting the used pGM-T-rHSG and was identified in previous experiment.It was subcloned in the pShuttle-CMV-EGFP plasmid.The rHSG gene was transferred from pShuttle-rHSG to pAdxsi viral DNA by double enzymatcuting obtaining the recombinant plasmid pAdxsi-GFP-rHSG.The recombinant pAdxsi-GFP-rHSG was selected by kansmycin resistanc andrestriction endonuclease; After linearized by Pac Ⅰ,the recombinant adenovirus DNA pAdxsi-GFP-rHSG was transfected into 293 cells for packaging and amplification.Adxsi-GFP-rHSG was further identified by PCR analysis and PCR products sequencing analysis.The expression was detected by Western-blot analyses with rat C6 brain glioma.Results Restriction enzyme digestion confirmed that rHSG gene was correctly inserted into pShuttle-CMV-EGFP.After being packaged in 293 cells,the recombinant adenovirus Adxsi-GFP-rHSG was identified by PCR analysis and DNA sequencing analysis.The cells transfected with Adxsi-GFP-rHSG resulted in positive expressing the rHSG protein.Conclusion Recombinant adenovirus encoding rat hyperplasia suppressor gene (rHSG) Adxsi-GFP-rHSG was successfully constructed.The expression on rat C5 brain glioma cells was more effective.It wil be helpful to use it in the research of the role rHSG specific therapy in the spongioblastoma tissue.【总页数】5页(P679-682,封3)【作者】郭晖;王占伟;郝文炯;赵巍;沈冰【作者单位】宁夏医科大学,银川750004;宁夏医科大学总医院神经外科,银川750004;宁夏医科大学总医院神经外科,银川750004;郑州市第七人民医院神经外科,郑州450016;延安大学附属医院神经外科,延安716000;宁夏医科大学医学科学技术研究中心,银川750004;宁夏医科大学总医院神经外科,银川750004【正文语种】中文【中图分类】R318【相关文献】1.大鼠ZnT1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 胡英明;梅晰凡;宋长威;李谌2.大鼠TP73基因重组腺病毒载体构建及鉴定 [J], 黄玲玲;张云云;王滨;张瑞;万鹤鸣;洪侃3.大鼠神经母细胞特异性转移因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 袁静;葛坚;俞建雄;4.大鼠神经母细胞特异性转移因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 袁静;葛坚;俞建雄5.大鼠Otos基因重组腺病毒载体的构建和鉴定 [J], 卓贤露;姜振东;魏运军;鲁立;张学渊;袁伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大鼠黏结蛋白聚糖1基因重组腺病毒载体的构建及感染效率
大鼠黏结蛋白聚糖1基因重组腺病毒载体的构建及感染效率雷娟;伍卫;周淑娴;张玉玲;薛声能【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2008(012)042【摘要】背景:重组腺病毒质粒的构建方法主要有体外连接法和同源重组法.同源重组法有操作复杂、耗时长、效率低、纯化难的缺点.体外连接法又不可避免非特异性的基冈重组及基因突变.目的:应用改良体外连接法构建携带黏结蛋白聚糖1基因的重组腺病毒载体,测定其在心肌成纤维细胞中的感染效率.设计、时间及地点:单一样奉实验,于2007-08/2008-02在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.材料:穿梭载体pShuttle-CMV(含绿色荧光撒告基因)和腺病毒骨架质粒pAdxsi购自诺赛皋因组研究中心有限公司.方法:核苷酸序列鉴定pCMV-Sport6.1-Sdcl质粒:用Kpn Ⅰ+Xho Ⅰ从质粒pCMV.Sport6.1-Sdc1切出黏结蛋白聚糖1 基因片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,形成重组穿梭质粒.用Ⅰ-CeuI+I-SceI双酶切出重组穿梭质粒中CMV-Sdc1片段,亚克隆至腺病毒基因组质粒中,得到重组腺病毒质粒.将重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒AdCMVSdc1,转化体外培养的心肌成纤维细胞.主要观察指标:用DNA测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒,并测定重组腺病毒的滴度和感染效率.结果:①核苷酸序列分析表明,pCMV-Sport6.1-Sdc1质粒正确携带大鼠黏结蛋白聚糖1 cDNA;黏结蛋白聚糖1基因被克隆于载体pShuttle-CMV上,以Kpn Ⅰ+Xho Ⅰ双晦切可回收3 kb的克隆片段和5.1 kb的载体片段;重组腺病毒质粒用Xho Ⅰ酶切得到7个片段而空载体仅得到6个片段.②重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;提取病毒DNA行聚合酶链反应鉴定可扩增出1.13 kb的特异性片段:用病毒上清多次重复感染293细胞扩增重组腺病毒后,病毒滴度检测达2.0×1011 PFU/mL.③用纯化浓缩后的重组腺病毒以感染复数为100感染心肌成纤维细胞,24 h后所有细胞均表达绿色荧光.结论:成功构建了携带人鼠黏结蛋白聚糖l基因的重组腺病毒载体,经纯化浓缩后具有较高的滴度,能有效转染心肌成纤维细胞.【总页数】4页(P8290-8293)【作者】雷娟;伍卫;周淑娴;张玉玲;薛声能【作者单位】中山大学附属第二医院心血管内科,广东省广州市,510120;中山大学附属第二医院心血管内科,广东省广州市,510120;中山大学附属第二医院心血管内科,广东省广州市,510120;中山大学附属第二医院心血管内科,广东省广州市,510120;中山大学附属第二医院心血管内科,广东省广州市,510120【正文语种】中文【中图分类】R541【相关文献】1.hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究 [J], 李慧勇;袁志诚;陈波;陆培松;李巧玉;曹侃2.构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率 [J], 袁桂仪;伍卫;周淑娴;张玉玲;雷娟3.人骨保护素基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓基质细胞中的表达效率 [J], 王晓军;王爱民;张忠荣;吴思宇;郭庆山;贺伟峰;汤守营;张全顺4.HGF基因重组腺病毒载体构建及其转染对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和迁移的影响 [J], 罗晓红;曾雯;巨容5.大鼠蛋白聚糖Ⅱ重组腺病毒载体的构建及生物学功能的鉴定 [J], 吴芳;姚航平;董凤芹;李红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大鼠PEDF基因的克隆及腺病毒表达载体的构建
大鼠PEDF基因的克隆及腺病毒表达载体的构建于燕萍;崔靖;王颖;颜华【期刊名称】《中华实验眼科杂志》【年(卷),期】2007(025)004【摘要】目的构建PEDF基因腺病毒表达载体,为基因治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)奠定基础.方法从大鼠视网膜组织中提取总RNA,RT-PCR扩增PEDF基因cDNA,并将回收的PEDF基因克隆入质粒pGEM-Teasy载体中,亚克隆入腺病毒表达载体质粒pDC316中,DNA序列分析加以证实.利用腺病毒Admax系统,通过含有目的基因片段PEDF的穿梭载体pDC316/PEDF和病毒骨架质粒共转染293细胞的方法包装出重组腺病毒AdPEDF.Western Blot对重组腺病毒进行鉴定.结果基因测序表明PEDF基因包含了大鼠PEDF基因阅读框内的全部序列,与NCBI Sequence Viewer中公布的大鼠PEDF mRNA序列(NM-177927)完全一致.获得了表达PEDF蛋白的重组腺病毒.结论成功构建了PEDF基因腺病毒表达载体,为进一步研究基因治疗脉络膜新生血管奠定了基础.【总页数】4页(P265-268)【作者】于燕萍;崔靖;王颖;颜华【作者单位】300052,天津医科大学总医院眼科;300052,天津医科大学总医院眼科;300052,天津医科大学总医院眼科;300052,天津医科大学总医院眼科【正文语种】中文【中图分类】R774.5【相关文献】1.猪繁殖与呼吸综合症病毒E基因克隆及重组腺病毒表达载体的构建 [J], 刘光瑞;李宝玉;柳纪省;胡永浩2.猪白细胞介素2基因的克隆及腺病毒表达载体的构建 [J], 周庆丰;刘忠华;龚朋飞;周美华;苏润环;何津佳;毕英佐3.猪繁殖与呼吸综合征病毒E基因的克隆及其腺病毒表达载体的构建 [J], 邓碧亮;顾万军;黄毓茂4.猪促卵泡激素α和β亚基基因的克隆及其重组腺病毒表达载体的构建 [J], 李儒曙;汪涛;刘宇;伍时达5.猪瘟病毒E2基因的克隆及其重组腺病毒表达载体的构建 [J], 韩向敏;程小磊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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ｔ ａ ｒ ｇ ｅ ｔ ｉ ｎｇ ｇ ｅ ｎｅ ＲＰ１ ０５ ｗａ ｓ ｆ ｉ ｓ ｈｅ ｄ ｂｙ ＰＣＲ ａ ｎ ｄ ｌ ｉ ｎ ｋｅ ｄ ｔ ｏ ｔ ｈｅ ｓ ｈｕｔ ｔ ｌ ｅ ｖｅ ｃ ｔ ｏｒ ＧＶ１ ３５ （ ＣＭ Ｖ— Ｍ ＣＳ— ＥＧＦＰ）ｔ ｏ ｆ ｏ ｒ ｍ ａ ｌ ｉ ｎｋｅ ｒ ｐｒ ｏ ｄｕｃ ｔ ． Ａ ｌ ａ ｒ ｇｅ ｎｕ ｍｂ ｅ ｒ ｏ ｆ ｐ ｏｓ ｉ ｔ ｉ ｖｅ ｃ ｌ ｏ ｎｅ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｐｒ ｏ ｄｕ ｃ ｅ ｄ ｂ ｙ ｔ ｒ ａ ｎｓ ｆ ｏ ｒ ｍｉ ｎ ｇ
肌 缺 血 再 灌 注损 伤 的 保 护 作 用 及 分 子 机 制 奠 定 了 实验 基 础 。
关键词 ： 腺病毒科 ； 聚 合 酶链 反 应 ； 质粒 ； 转染 ； 基 因表 达
Ｃｏ ｎｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｉ ｄｅ ｎｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｎｔ
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔｏ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ ａ ｄ ｅ ｎ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ Ａｄ － ＲＰ１ ０ ５ 一 ＥＧＦＰ
酶 切 鉴 定及 测序 鉴 定 。 采 用 Ａ ｄ Ｍａ ｘ腺 病 毒 包装 系统 ， 将成功构建 的 Ｒ Ｐ １ ０ ５重 组 腺 病 毒 穿 梭 质 粒 与 辅 助 包装 质 粒 共 转 染 ＨＥ Ｋ２ ９ ３细胞 ， 通过 Ｃ ｒ ｅ ／ ｌ ｏ ｘ Ｐ重 组 酶 系统 的作 用 实现 重 组 ， 得 到 重组 腺 病 毒 ， 并进行 重组腺病毒 扩增 、 纯 化
ａ ｄ ｅ ｎ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ＲＰ１ ０ ５
ＹＡＮＧ Ｃｈ ａ ｏ ～ ｊ ｕ ｎ， ＹＡＮＧ Ｊ ｕ ｎ， ＹＡＮＧ Ｊ ｉ ａ ｎ， ｅ ｔ ａ １
（ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｃａ ｒ ｄｉ ｏ ｖ ａ ｓ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ Ｄｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ ｓ ， Ｄｅ ｐａ ｒ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｃ ａ ｒ ｄ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ Ｔｈ ｒ ｅ ｅ Ｇｏ ｒ ｇｅ ｓ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ Ｆｉ ｒ ｓ ｔ Ｃｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｃｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ Ｍｅ ｄｉ ｃ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ， Ｙｉ ｃ ｈ ａ ｎ ｇ ４ ４ ３ ０ ０ ３ ， Ｈｕ ｂ ｅ ｉ Ｐｒ ｏ ｖ ｉ ｎ ｃ ｅ， Ｃｈ ｉ ｎ ａ ）
及 滴度 测 定 。 结 果 重 组腺 病 毒 穿 梭 质 粒 酶 切 鉴 定 与 测 序 证 明本 实验 成 功 构 建 了 大 鼠 Ｒ Ｐ １ ０ ５重 组 腺 病 毒 载 体 。 Ｒ Ｐ １ ０ ５穿梭 质 粒 和腺 病毒 包装 质 粒 共 转 染 ＨＥ Ｋ ２ ９ ３细 胞 ２ ４ ｈ后 可见 大 量 绿 色 荧光 蛋 白 表 达 和 聚 集 ，１ ０ ｄ后 出现 典 型 的 细胞 病 变 ， 说 明 腺 病 毒 包装 成 功 。再 经 重组 腺 病 毒 扩 增 、 纯化及 滴度测定 ， 重组腺 病毒滴度 为 １ ×ｌ ０ Ｐ Ｆ Ｕ／ ｍｌ 。 结论 本 实验 成 功 构 建 了携 带 ＲＰ １ ０ ５基 因的 重 组 腺 病 毒 表 达 载 体 Ａｄ — Ｒ Ｐ １ ０ ５ 一 Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ。这 为 下一 步研 究其 对心
中华 老年 心 脑血 管病 杂 志 ２ ０ １ ５年 ８月 第 １ ７卷 第 ８ 期
Ｃ ｈ ｉ ｎ Ｊ Ｇ ｅ ｒ ｉ ａ ｔ ｒ Ｈｅ ａ ｒ ｔ Ｂ ｒ ａ ｉ ｎＶｅ ｓ ｓ ｅ ｌ Ｄ ｉ ｓ ， Ａ ｕ ｇ ２ ０１ ５ ， Ｖ ｏ ｌ １ ７ ， Ｎ ｏ ． ８
ｂ ｙ ｃ ｏｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｉ ｎ ｇ ａ ｎ ｄ ｉ ｄ ｅ ｎｔ ｉ ｆ ｙ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈｅ ｒ ａ ｔ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎｔ ａ ｄ ｅ ｎ ｏｖ ｉ ｒ ｕｓ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏｒ ＲＰ１ ０ ５．Ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｔｈｅ
－８ ５ ５ ・
基 础 研 究 ．
大 鼠重组 腺病 毒 载体 ＲＰ １ ０ ５的构 建 和 鉴 定
杨 超君 ， 杨俊 ， 杨简， 丁 家望 ， 范致 星 ， 郭鑫， 李馨欣 ， 喻 琴琴
摘要 ： 目的 构建和鉴定大 鼠 Ｒ Ｐ １ ０ ５重 组 腺 病 毒 载 体 ， 并 获 得 具 有 一 定 滴 度 的 重 组 腺 病 毒 表 达 载 体 Ａｄ — Ｒ Ｐ １ ０ ５ 一
ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎｔ ｖｅ ｃ ｔ ｏｒ ＣＭ Ｖ ＿ ＲＰ１ ０５ 一 Ｍ Ｃ ＥＧ ＦＰ ｔ ｏ Ｅ． ｃ ｏ ｌ ｉ ＤＨ ５ ａ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ， ａ ｎ ｄ ｃ ｏ ｎｆ ｉ ｒ ｍｅ ｄ ｂｙ ｅ ｎｚ ｙ ｍｅ
Ｅ ＧＦ Ｐ。方 法 Ｐ Ｃ Ｒ 钓 取 目的 基 因 Ｒ Ｐ １ ０ ５ ， 连接 入 穿 梭 载 体 ＧＶ１ ３ ５ （ Ｃ Ｍｖ ＿ ＭＣ Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ ） ， 形 成 连 接 产 物 。 连 接 好 的
重 组 腺 病 毒 载体 Ｃ ＭＶ— Ｒ Ｐ １ ０ ５ 一 ＭＣ Ｓ － Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ转化 大 肠 埃 希 茵 Ｄ Ｈ５ ａ感 受 态 细 胞 获 得 大 量 阳性 克 隆 ， 对 阳性 克 隆 进 行