衰老的生物学标志3

衰老的生物学标志3马　宏　张宗玉　童坦君(北京大学医学部生物化学与分子生物学系,北京100083)摘要　目前制约哺乳动物衰老研究的一个重要因素就是缺少可靠、易测的评估生物学年龄的衰老标志,本文论述了八项可作为衰老生物学标志的指标及其检测方法,它们是成纤维细胞的体外增殖能力、DNA损伤修复能力、线粒体DNA片段缺失、DNA甲基化水平、端粒的长度、衰老相关β2半乳糖苷酶活性、晚期糖基化终产物水平、基因表达谱。

关键词　生物学标志;复制衰老;生物体衰老;细胞增殖学科分类号　Q255;R592 人口老化是本世纪人类面临的一个主要难题,为了有效地延缓衰老,就必须在分子水平了解衰老的机制。

目前,制约哺乳动物衰老研究的一个重要因素就是缺少可靠、易测的评估生物学年龄的标志。

美国亚利桑大学Mooradin曾把衰老生物学标志概括为主要标准和辅助标准。

主要标准是(1)该标志与年龄有定量关系,相关性愈密切,灵敏度愈高;(2)该标志不因疾病而改变;(3)该标志不因代谢或营养状况的改变而改变;(4)能影响衰老进程的因素亦能影响该标志;(5)永生化的细胞不存在该标志的变化。

目前,在细胞水平,分子水平发现一些指标,可作为衰老生物学标志,但尚不能满足上述所有判断标准。

现概括如下:一、成纤维细胞的体外增殖能力1965年,Hayflick发现人二倍体成纤维细胞在体外培养的寿命有限,随体外培养所传代数的增加,细胞的增殖能力逐渐丧失,且发现胚胎的成纤维细胞增殖能力强于成人的成纤维细胞,基于这些实验, Hayflick提出细胞的衰老参与生物体衰老的整体进程,这就是衰老的细胞假说。

根据细胞的衰老假说,成纤维细胞体外增殖能力是可靠的估算供者衰老程度的指标。

1970年,Martin等取不同年龄人皮肤成纤维细胞体外培养发现,细胞的复制寿限与供者的年龄呈负相关,供者年龄每增加一岁,其细胞的体外复制寿限降低0.2代,人二倍体成纤维细胞体外复制寿限约为60代,由此推算人类的最高寿限约为120岁,这与实际情况相符。

1980年,Rohme证明不同物种的二倍体成纤维细胞体外的复制寿限与物种的生命寿限正相关,而一些早老症如Werner综合症患者其成纤维细胞的体外复制寿限明显低于正常人二倍体成纤维细胞的体外复制寿限。

目前,成纤维细胞体外增殖能力作为衰老生物学标志,广泛用于衰老研究,成为衰老研究的重要工具。

二、D NA损伤修复能力多种DNA损伤如:染色体移位、DNA单双链断裂、片段缺失,都随龄积累。

这一现象除与衰老过程中自由基生成率升高及抗氧化剂水平降低有关外,与DNA修复能力降低密切相关。

Hart及Set2 low研究7种哺乳动物的最高寿限与细胞DNA修复能力的关系,发现其皮肤成纤维细胞对紫外线诱导的DNA修复合成效率与动物的最高寿限有良好的线性关系。

为了排除DNA修复能力的种间差异,Hart研究了两种寿限相差2.5倍的小鼠细胞DNA修复合成能力,发现长寿白足小鼠的DNA修复合成较短寿家鼠高2.2倍。

人体的血细胞、淋巴细胞、皮肤成纤维细胞DNA修复能力随龄降低,一些早老症如Werner综合症和Cockayne综合症都具有某种DNA修复的缺陷,限食可提高啮齿类DNA 修复能力,以上实验说明DNA损伤修复能力可作为衰老的生物学标志。

作为估算DNA修复能力的指标包括非程序DNA合成(unscheduled DNA synthesis,UDS)、DNA聚合酶β及内切脱氧核糖核酸酶UV2DNase 和AP2DNase。

另外,检测各种DNA损伤的方法亦可用于检测该种DNA损伤的修复能力。

3国家重点基础研究发展规划资助项目(G2000057001);国家自然科学基金重点资助项目(39930170) 三、线粒体D NA片段缺失1980年,Miquel和Cowoker提出衰老的线粒体假说,认为线粒体的损伤是细胞衰老和死亡的分子基础。

线粒体DNA突变使线粒体呼吸链及氧化磷酸化功能受损,导致A TP水平及NAD与NADH比率的下降,受损的电子传递链使线粒体自由基的产生增多,从而加速线粒体DNA突变速率,A TP生成减少,细胞一切生理、生化活动所需能量供应不足,导致组织、器官功能的衰退。

有关检测线粒体DNA突变的大多数实验结果显示:在停止分裂的组织细胞中,线粒体DNA的多种突变随龄呈指数增加。

线粒体DNA突变以片段缺失最普遍,帕金森病、糖尿病、冠状动脉粥样硬化心脏病、阿尔采末病等老年常见病都与线粒体DNA 片段缺失有关。

线虫中,age21单基因突变,个体寿命明显延长,线粒体DNA片段缺失的速度亦低于野生型。

线粒体DNA片段缺失多种多样,迄今发现的已不下百种,其中4977bp片段缺失最常见,对应于鼠类4834bp片段缺失,与老年性耳聋的发生相关。

限食可使大鼠4834bp片段缺失生成率降低,并延缓耳聋的发生[1]。

线粒体DNA片段缺失的检测可以毛发为材料,应用甚为便利,是一项很好的衰老生物学标志。

目前,检测线粒体DNA片段缺失采用PCR方法,对线粒体模板定量的方法有三种:连续稀释PCR(serial dilution PCR)、动态PCR(kinetic PCR)、竞争PCR(competitive PCR)。

连续稀释PCR的技术简单,但同时进行多组PCR扩增,Taq DNA聚合酶消耗大,而且,多组PCR在不同的体系中进行会影响最后结果的准确性。

动态PCR是一种极其快速、敏感的方法,且费用较低,但模板浓度很低时,结果会有偏差。

竞争PCR被普遍认为是最准确的一种方法,但竞争物的构建却是一项非常费时的工作。

四、D NA甲基化水平DNA甲基化是真核生物基因表达渐成性调节的重要机制,主要发生在对称Cp G序列中的C碱基上,通过改变染色体的结构,影响DNA与蛋白质的相互作用,抑制基因表达。

20世纪80年代初,Wil2 son等测定了体外培养的人、田鼠及小鼠成纤维细胞DNA的52甲基胞嘧啶含量,发现均随细胞分裂次数的增加而降低,且下降速度以人、田鼠、小鼠的次序递减,而永生化细胞系的52甲基胞嘧啶含量则保持相对稳定。

以DNA甲基化酶抑制剂52氮杂胞苷或52氮脱氧胞苷处理人二倍体成纤维细胞或某些肿瘤细胞,可使其增殖能力下降,体外培养寿限缩短。

因此,DNA甲基化水平也可以作为细胞分裂的”计时器”。

体内实验同样发现基因组整体甲基化水平有随龄降低的趋势[2]。

在基因组整体甲基化水平降低的同时,衰老过程中也伴有个别基因甲基化水平增高的现象。

最早证明与年龄相关启动子Cp G岛的甲基化是人结肠组织雌激素受体(estrogen receptor,ER)基因,年轻个体中,几乎检测不到ER基因的甲基化,以后,随龄逐渐升高。

另外,胰岛素样生长因子2(insulin2 like growth factor,IGF2)、肌原调节蛋白M YOD1、体觉诱发电位组份N33基因启动子Cp G岛的甲基化水平在正常的结肠组织中同样随龄升高[3]。

也许,这些特定基因的甲基化是更好的衰老生物学标志。

检测基因组甲基化水平主要采用薄层层析或高效液相色谱层析(HPLC)测定52甲基胞嘧啶的含量。

特定基因甲基化程度的检测主要是利用亚硫酸钠将单链DNA中胞嘧啶转化为尿嘧啶,以单链特异的引物进行PCR扩增,然后依靠限制酶切图谱、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸、测序等手段鉴定PCR产物,从而确定甲基化的位置和数量。

该方法所需样品量少,灵敏度高,以测序方法鉴定PCR产物,结果更可靠。

五、端粒的长度人类染色体端粒由进化上高度保守的重复序列TTA GGG组成,由端粒酶合成,是维持染色体稳定的重要因素。

在端粒酶处于抑制状态的细胞分裂时,DNA不完全复制会引起端粒DNA的少量丢失,随着细胞分裂次数的增加,端粒不断缩短。

当端粒缩短到一定程度(临界长度)时引发Hayflick极限,细胞不再分裂。

这就是细胞衰老的端粒假说。

1991年,Harley等发现人体内成纤维细胞端粒每年缩短14～18bp(碱基对),而外周血淋巴细胞则每年缩短33bp,我国测得值与此相近,为每年缩短35bp[4]。

体外培养二倍体成纤维细胞,每增加一代龄,端粒长度减少约50bp。

对人体不同的组织进行端粒长度检测,发现端粒长度与细胞的寿限相关,精子、胚胎的端粒最长,而小肠粘膜细胞的端粒最短。

Zglinicki等最近报道:氧化压力造成的单链断裂是端粒缩短的主要原因,过氧化氢诱导细胞出现衰老表型的同时,也加快端粒的缩短[5]。

因此,端粒长度不单是细胞分裂次数的“计数器”,而是一项细胞衰老的标志。

经典的端粒长度检测方法是以Southern方法测限制性内切酶酶切产生末端片段(Terminal re2 striction fragment,TRF),虽定量结果较为准确可靠,但操作复杂,所需样品量大。

定量荧光原位杂交(Q FISH)技术用样量小,可以检测染色体间端粒长度的变化。

但衰老细胞处于分裂相细胞少,易造成检测结果的偏差。

在此基础上发展起来的流式仪荧光原位杂交,操作快速简单,所需样品量少,在检测细胞端粒长度的同时还可以检测细胞表型,甚至细胞内其它因子[6]。

流式仪荧光原位杂交适用于衰老生物学标志的检测,但其所用肽核酸(peptide nu2 cleic acid,PNA)探针尚不普及。

六、衰老相关β2半乳糖苷酶活性1995年,Dimiri等发现体外培养人二倍体成纤维细胞在p H为6时,其β2半乳糖苷酶染色的阳性率随代龄增加而增加,他们把这种中性β2半乳糖苷酶定义为衰老相关的β2半乳糖苷酶(SA2β2gal)。

血清饥饿引发的生长抑制并不能提高SA2β2gal的活性,Werner综合症患者皮肤成纤维细胞体外培养时增殖能力的丧失快于正常人,同时,SA2β2gal阳性细胞的积累速度也加快。

永生化细胞检测不到SA2β2 gal的活性,转基因技术诱导永生化细胞衰老的同时,也诱导衰老相关β2半乳糖苷酶的活性。

而且,老年个体皮肤组织切片衰老相关β2半乳糖苷酶染色的阳性率高于年轻个体。

基于以上观察,Dimiri提出这种中性β2半乳糖苷酶是一种很好的可用于体内外衰老研究的生物学标志。

1999年,Pendergrass对不同年龄恒河猴的皮肤组织切片进行衰老相关β2半乳糖苷酶染色检测,发现衰老相关β2半乳糖苷酶染色的阳性率有随龄增加的趋势,限食可以延缓这一趋势[7],此研究提示:SA2β2gal活性反映的是个体的生物学年龄,而非通常意义的年龄。

SA2β2gal的检测大多采用组化染色方法,简单易行,是目前应用较为广泛的衰老生物学标志。

七、晚期糖基化终产物(advanced glycosylation end product,AGE)水平生物体内的非酶促糖基化反应(nonenzymatic glacation,N EG),又称Maillard反应,是葡萄糖等还原糖与蛋白质、脂类、核酸大分子中的游离氨基发生的加成反应,加成反应的早期产物是不稳定的氨基酮糖类(Schiff碱),经重排后形成果糖胺类糖基化蛋白质(Amadori产物);其中的糖类部分经氧化裂解形成带荧光的棕色化合物,即A GE。