小鼠未成熟关节透明软骨细胞的培养与生物学特征研究
血管内皮生长因子和缺氧诱导因子对软骨细胞凋亡的作用
血管内皮生长因子和缺氧诱导因子对软骨细胞凋亡的作用周建林;方洪松;彭昊;邓爽;翁金清;刘丰;陈森;周观金【摘要】BACKGROUND:Osteoarthritis is a joint disease that primarily affects the cartilage. With the changes of the extracelular matrix, chondrocytes appear to have apoptosis. Vascular endothelial growth factor plays an important role in promoting endothelial cel division and proliferation and inducing angiogenesis. Hypoxia-inducible factor is a celular transcription factor and produces different reactions due to the oxygen content. Vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factor are focused on inhibiting chondrocyte apoptosis. OBJECTIVE:To elaborate the effects of vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factors on chondrocyte apoptosis. METHODS: Recent literatures related to chondrocyte apoptosis were summarized and analyzed. During the process of osteoarthritis, changes in vascular endothelial growth factors in chondrocytes and regulatory effects of vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factor on chondrocyte apoptosis were elaborated.%背景：骨关节炎是一种关节疾病，主要影响软骨，随着软骨细胞胞外基质的变化，软骨细胞发生凋亡，血管内皮生长因子在促进血管内皮细胞分裂与增殖、诱导血管生成中起重要作用。
纤维软骨和透明软骨不同染色方法的对比研究
纤维软骨和透明软骨不同染色方法的对比研究黄林剑;邓思敏;陈军;徐昕;严君烈;蔡协艺【摘要】目的研究不同软骨染色方法在髁突软骨、股骨软骨和生长板软骨中的染色差异.方法取健康雌性新西兰大白兔颞下颌关节髁突、膝关节股骨,分别进行苏木精-伊红(HE)染色、甲苯胺蓝染色、阿利新蓝染色、番红O-阿利新蓝染色、番红O 染色、番红O-快绿染色,光学显微镜下观察分析各软骨组织结构.结果 HE染色髁突纤维软骨各层结构清晰,关节软骨基质呈嗜碱性蓝染,骨组织呈嗜酸性红染;甲苯胺蓝染色关节软骨基质呈蓝紫色,骨组织不着色;阿利新蓝染色软骨基质呈淡蓝色,骨组织不着色;番红O-阿利新蓝染色关节软骨呈浅蓝色,骨组织呈淡红色,但是髁突软骨纤维层和增殖层红染;番红O染色中髁突软骨基质呈红色,股骨软骨和生长板软骨呈橘黄色,骨组织呈淡红色;番红O-快绿染色关节软骨基质呈红色,骨组织呈绿色,在髁突纤维软骨中纤维层呈明显绿染.结论不同的染色方法可以特异性展现软骨组织结构.在今后透明软骨和纤维软骨的研究中,因根据研究对象、研究目的等选用适合的染色方法,以期最佳的反映研究部位的形态结构.%Objective To explore the characteristic of different cartilage staining methods for condylar fibrocartilage and femoral hya-line cartilage in rabbit. Methods Temporomandibular joints and knee joints were harvested from healthy female Newzealand White rabbits. HE staining,Toluidine bluestaining,Alcian blue staining,Safranin O-Alcian blue staining,Safranin O staining,Safranin O-Fast green staining were used to observe and analyse the organizational structure of the cartilage under optical microscope.Results Or-ganizational structure of the articular cartilage was clear in HE staining,such as cartilage matrix was dyed blue and bone wasdyed red. Articular cartilage matrix was dyed violet and bone was not stained in Toluidine blue staining. Articular cartilage matrix was dyed light blue and bone was not stained in Alcian blue staining.Articular cartilage matrix was dyed light blue and bone was dyed light red in Saf-ranin O-Alcian blue staining,but the fiber layer and proliferation layer of condylar cartilage were dyed red.In Safranin O staining,bone was dyed lightred,whereas the cartilage matrix of the condyle was dyed red and the cartilage matrix of the femur was dyed orange. Ar-ticular cartilage matrix was dyed red and bone was dyed green in Safranin O-Fast green staining. Meanwhile,the fiber layer of the con-dylar cartilage was dyed green. Conclusions Different cartilage staining methods show structure of cartilage tissue specificity. We rec-ommend that we should choose suitable cartilage staining methods according to our research purpose and specimen in the future study.【期刊名称】《口腔医学》【年(卷),期】2018(038)002【总页数】5页(P104-108)【关键词】关节软骨;髁突;股骨;生长板;软骨染色【作者】黄林剑;邓思敏;陈军;徐昕;严君烈;蔡协艺【作者单位】浙江大学医学院附属第二医院·口腔颌面外科,浙江杭州310009;上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院口腔外科,上海市口腔医学重点实验室,上海200011;浙江大学医学院附属第二医院·口腔颌面外科,浙江杭州310009;浙江大学医学院附属第二医院·口腔颌面外科,浙江杭州310009;浙江大学医学院附属第二医院·口腔颌面外科,浙江杭州310009;浙江大学医学院附属第二医院·口腔颌面外科,浙江杭州310009;上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院口腔外科,上海市口腔医学重点实验室,上海200011【正文语种】中文【中图分类】R780.2关节软骨(articular cartilage, AC)位于活动关节的表面，是一种高度特异的有一定弹性的负重组织[1]。
软组织工程研究：软骨细胞的培养
型和 Ⅲ 合成基质 ，最终难于形成软骨组 织。而生物相 容性 良好 养过程 中向成纤维细胞样转化 ，细胞 开始表达 Ｉ 和生物可降解性 细胞载体 的应 用 ，能为软骨 细胞提供 理 型胶原 ，并逐渐丧 失分泌软 骨基质 能力。体外培养的软 想的表 面 支持 和稳 定的三 维空间支架结构 ，以及 足够的 骨细胞是研 究软 骨分化以及 细胞 因子、生长 因子对软骨 孔 隙率 ，供 细胞在其 中进行物质 交换 、生 长代谢 和分泌 细胞表型促进 或抑 制作用 的一种 必要 的实验模 型。对 于 软骨基质 。以三 维立体培 养为基础 的组织 工程技 术在软 用组织 工程技 术构建软骨的软骨 细胞 来说 ，研究其体外 骨细胞培养方 面 已取得 突破 性进展 。用软组 织工程技 术 培养 时细胞 外基质 的分泌情 况，一方面可以 了解软骨 细 构建 软骨 的重要 条 件之 一就是 获得 一 定数 量 的软骨 细 胞的功 能状 态；另一 方面，任何体 细胞 在体外培养过程 中都有 一定生存期 ，不可能无限制地生长 ，对软骨 细胞 胞 ，体外培养 、扩增 并保持 一定的功 能活性 。
｜ ＳＳＮ １ ７ ． ２ ５ ＣＮ １ １ ３９ Ｒ ６ ３８ ２ ２ ．５ ， ｃｏＤＥＮ： ＫＨＡＨ ＺＬ
节盘及耻 骨联 合等处；弹性软骨分布 于耳廓 等处。软骨
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７ ｗ ｃ 尺 瑚伽
学部 软 织程 究软 细 的养 术 ＿ ： 组 Ｉ 研 ： 骨 瞻 培
中 国组 织 工 程 研 究 与 临 床康 复
劳 ７ ４誊 笫 ４ ７
２１ ０ ０—１ ０—０ ８出 版
Ｊ ｕｒａ ｉｉａｌＲｅ ｂｌａｉｅ ｉｓ ｅ ｎ ｏ ｎ ｌｏｆＣｌ ｃ ｈａ ｉｔｔ Ｔｓ ｕ Ｅ ｇｍｅｅ ｎ ｓ ａ ｃ Ｏｃｏ ｅ ．２ ０ Ｖ Ｌ１ ，Ｎｏ４１ ｎ ｉ ｖ ｎ ｇ Ｒｅ ｅ ｒ ｈ ｔｂ ｒ ８ ０１ ｏ ４ ．
关节内注射药物建立骨性关节炎动物模型研究进展
关节内注射药物建立骨性关节炎动物模型研究进展发表者：马玉峰527人已访问骨性关节炎（Osteoarthritis，OA）是临床常见病，病程呈迁延性、反复性，其治疗上目前尚缺乏特异性措施。
探索骨性关节炎的动物模型的建立方法，是研究其病理机制及防治方法的重要课题之一，亦是现代骨科学领域研究的热点问题之一。
目前人们已从组织形态学、病理学、分子生物学及生物力学等方面进行不同角度、不同靶点对其研究，为此建立了不同种类的骨性关节炎的动物模型，包括机械制动、手术诱发（半月板切除、交叉韧带切断、关节划痕、切断部分臀大肌等）、自发性模型（豚鼠、C57黑鼠）、转基因动物模型以及关节内药物注射等病理模型。
其中，关节内注射药物建立骨性关节炎模型因其造模时间段、造模比较稳定、受其它因素干预少等优点，一直作为建立膝OA的经典方法，近年来许多学者对其开展了大量研究，取得了引人瞩目的成就，现将对其研究情况综述如下。
1.实验动物的选择选择相关动物作为模型研究，应遵循Kenneth P H Pritzker[1]提出的三原则：相关性、适当性、实用性。
相关性是指所选动物能够模拟人类发病过程中的病理现象，在这些模型中，动物的特点以及类似人类疾病的特征可以较好地提供模型。
适当性首先是应用动物而非简单地在寻找问题过程中调查研究；其次是根据实验目的和要求选择更适合的动物品种。
实用性是指根据动物来源是否充分、动物是否易于控制、维护条件以及费用等选择动物品种。
理论上讲，哺乳动物与人类的关节解剖结构、生物力学相似，而且下肢负重载荷较多，不论是自然环境还是人工环境，所有的哺乳动物都有可能患上退行性骨关节病[2]。
所以目前科研工作者主要是以哺乳动物制备动物模型开展研究工作。
特别是啮齿目动物，如小鼠、大鼠、豚鼠等。
还有家畜类：羊、狗等；灵长类：恒河猴等。
1.1小鼠：由于体积小，操作方便，饲养管理方便，生产繁殖快，研究较深入，国内外已有严格的质量控制标准，已拥有大量的近交系、突变系和封闭群，近几十年来一直作为生物医学动物模型的主要动物品种。
公示内容应包括如下方面
公示内容（应包括如下方面）一、中华医学科技奖医学科学技术奖推荐项目：1.推荐奖种：中华医学科技奖医学科学技术奖一等奖2.项目名称：新分子锌指蛋白ZBTB20的生理功能及其致病机制3.推荐单位或推荐科学家：中国人民解放军第二军医大学4.推荐意见：该项目组围绕自主发现的新型转录因子ZBTB20，利用国际上首创的ZBTB20全身性和组织特异性敲除小鼠模型，开展了该转录因子在个体发育、学习记忆、痛觉感受、糖脂代谢、垂体发育和免疫应答等过程中的重要生理和病理作用的前瞻性研究，取得了系列独创性研究成果。
在国际核心刊物PNAS、Gastroenterology、Nature Communications等发表的13篇代表性论文，多次被包括Science、Cell、Nature Genetics等国际权威学术刊物引用。
这些成果对于认识Primrose综合征、认知障碍和糖尿病等重大疾病的分子机制具有重要理论创新意义，并为相关疾病的诊治提供了新的理论基础。
此外，该项目培养了一批优秀的硕博士研究生，搭建了与国内外多家知名实验室间深层次合作研究的平台，也使该实验室的承载学科---病理生理学获得了长足的发展。
该项目提供的材料真实可信，特此推荐申报2018年中华医学科技奖医学科学技术奖一等奖5.项目简介：锌指蛋白是一类含有锌指结构域的功能蛋白，在细胞增殖、分化、凋亡和功能等细胞生物学过程中发挥重要的调节作用。
不同种类和成员众多的锌指蛋白构成了庞大的锌指蛋白超家族，约占人类基因的3%。
迄今为止，该超家族的大多数成员的生物学功能尚不清楚。
因此，锌指蛋白被认为是解析生命活动规律的金钥匙。
近十年来，本研究团队围绕自主发现、并在国际上率先报道的新基因锌指蛋白ZBTB20，利用在国际上首次建立的全身性和组织特异性基因敲除小鼠模型，首次系统揭示了该分子在多种组织细胞中的生理功能及其作用机制，取得了如下系列创新性成果，产生了重要国际影响：（1）在代谢方面，ZBTB20是维持机体血糖稳态的关键分子。
软骨细胞的生物学特性及其在组织修复中的应用
软骨细胞的生物学特性及其在组织修复中的应用软骨细胞是一类特殊的细胞，它们的主要生物学特性是产生和维持软骨组织。
软骨组织是一种纤维性结缔组织，由软骨细胞和基质（主要由胶原蛋白和多糖组成）构成。
软骨组织在人体中广泛存在，包括骨骼、鼻子、气管、软骨垫、耳朵等位置。
软骨具有较强的韧性和弹性，可以缓冲身体部位和保护脆弱的器官。
但是，软骨不具备血管和神经，且软骨细胞分裂和再生能力较差，一旦受损，修复难度较大。
近年来，由于各种因素，如年龄、疾病和外伤等，软骨损伤和退化的情况越来越普遍。
如何有效地修复受损的软骨组织成为了重要的研究方向。
目前，常见的软骨组织修复方法包括手术、药物和细胞治疗等。
细胞治疗主要是利用软骨细胞和干细胞等细胞种类修复受损的软骨组织。
软骨细胞主要是产生和维持软骨组织的细胞，它的功能主要是合成和分泌胶原蛋白和多糖等成分构成软骨基质，同时可以参与一些骨代谢的调节等功能。
软骨细胞具有一定的生物学特性，如细胞形态较小和圆形，细胞活动较慢，几乎不会分裂等。
因此，软骨细胞本身作为修复细胞并不是很实用。
不过，在研究中发现，软骨细胞不同于其他细胞，它具有比较稳定的表型和较多的生物学功能，且可以通过体外培养等方式进行扩增和表型增强。
因此，软骨细胞被广泛应用在软骨组织工程、软骨缺损修复等领域。
软骨细胞在组织修复中的应用有很多，其中最重要的是软骨组织工程。
软骨组织工程主要是使用软骨细胞和其他组织工程材料制作人工软骨，并进行体外或体内培养，最终将人工软骨移植到受损部位。
软骨组织工程可以使大面积软骨损伤或患有疾病的患者得到有效的治疗。
在软骨组织工程中，软骨细胞的扩增和表型增强是非常关键的。
通过选择合适的培养基和生长因子等条件，可以促进软骨细胞的分化和成熟，提高细胞的生物学功能。
另外，生物材料的选择和优化也可以增强软骨细胞的成活和功能，从而提高人工软骨的质量和长期效果。
除了软骨组织工程外，软骨细胞还可以应用于软骨缺损修复和软骨疾病治疗等领域。
发育生物学题库及答案最新整理
发育生物学题库及答案最新整理1、发育与发育生物学概念答：发育——指一个有机体从其生命开始到成熟的变化过程，是生物有机体的自我构建和自我组织的过程。
发育生物学——是以传统的胚胎学为基础，渗透了分子生物学、遗传学和细胞生物学等学科的原理和方法，研究生物个体发育过程及其调节机制，即研究生物体从精子和卵子的发生、受精、胚胎发育、生长到衰老、死亡的规律的科学。
2、什么是原肠胚答：胚胎由囊胚继续发育，由原始的单胚层细胞发展成具有双层或三层胚层结构的胚胎，称为原肠胚。
3、神经板概念、形成过程及作用（P77）答：神经板概念——早期胚胎背侧表面的一条增厚的纵行外胚层条带。
可发育成神经系统。
形成过程——主要是脊索动物发生初期原肠形成终了后于外胚层背侧正中产生的，呈球拍形，后部狭窄肥厚，以后其主要部分形成中枢神经系统和眼原基。
神经外胚层细胞分布于神经板两侧，位于脊索的背方，该区域较平坦，呈平板状，它将发育成神经管。
作用——随着发生的进展，神经板周围的外胚层隆起变为神经褶，不久因两侧的神经褶在背侧正中闭合而变成神经管。
4、初级性别决定的概念（P132）答：指生殖腺发育为睾丸或卵巢的选择。
胚胎生殖腺的发育命运决定于其染色体组成，Y染色体的存在使生殖腺的体细胞发育为testis而非ovary。
5、什么是胚孔什么是原条在胚胎发育中作用(P64、68)答：胚孔——两栖类和海胆囊胚表面产生的圆形内陷小口。
在原肠期内胚层和中胚层细胞经此口内卷进入胚胎内部。
（是动物早期胚胎原肠的开口。
原肠形成时，内胚层细胞迁移到胚体内部形成原肠腔，留有与外界相通的孔。
）作用：通过胚孔背唇进入胚内的细胞将形成脊索及头部中胚层，其余大部分中胚层细胞经胚孔侧唇进入胚内。
原口动物的口起源于胚孔，如大多数无脊椎动物；而后口动物的胚孔则发育为成体的肛门，与胚孔相对的一端另行开口，发育为成体的口。
如脊椎动物及棘皮动物等。
原条——在鸟类、爬行类和哺乳类胚胎原肠作用时，胚胎后区加厚，并向头区延伸所形成的细胞条。
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
看来做小鼠MSC的战友越来越多。
一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
小鼠关节软骨表层细胞分离培养及鉴定
国际骨科学杂志㊀２０１８年９月㊀第３９卷㊀第５期㊀I n t JO r t h o p ,S e p．２５,２０１８,V o l ．３９,N o ．５ 实验研究基金项目:国家重点基础研究发展计划(２０１４C B ９４２９０４)㊁国家自然科学基金(８１５３００７１)㊁国家自然科学基金(８１４７２０７４)作者单位:４０００４２㊀重庆,㊀㊀陆军军医大学大坪医院全军战创伤中心创伤实验室(谭乔燕㊁王权㊁旷梁㊁谢杨丽㊁李灿㊁罗凤涛㊁杜晓兰㊁陈林)㊁骨代谢与修复中心(陈林)㊁创伤㊁烧伤㊁复合伤国家重点实验室(谢杨丽㊁杜晓兰㊁陈林)通信作者:陈林㊀E Ｇm a i l :l i n c h e n ７０＠１６３．c o m小鼠关节软骨表层细胞分离培养及鉴定谭乔燕㊀王权㊀旷梁㊀谢杨丽㊀李灿㊀罗凤涛㊀杜晓兰㊀陈林ʌ摘要ɔ㊀目的㊀分离培养小鼠关节软骨表层细胞(A C S C )并鉴定其干细胞特性.方法㊀运用纤连蛋白黏附法从３~５d新生小鼠膝关节软骨表层分离细胞及培养,对分离细胞以流式细胞仪检测干细胞表面阳性标志物(C D ４４与C D ９０)和阴性标志物(C D ４５㊁C D ３１与C D ３４)的表达;实时荧光定量逆转录Ｇ聚合酶链反应(q R T ＧP C R )检测相关基因表达;单克隆形成实验检测克隆形成能力.三系诱导分化(成软骨㊁成骨与成脂分化)检测分离培养细胞的多向分化潜能.取第６代分离培养细胞做裸鼠皮下移植实验,检测其体内成软骨能力.结果㊀纤连蛋白可以特异性地黏附A C S C ,A C S C 形态偏长,类似成纤维细胞.A C S C 高表达C D ４４和C D ９０,但几乎不表达C D ３１㊁C D ３４和C D ４５.q R T ＧP C R 检测结果显示,以A C S C 表达的m R N A 水平为１,则软骨细胞显著性低水平表达间充质干细胞标志物C D ７３(０．０８ʃ０．０７,P ＜０．００１)㊁C D ９０(０．０７ʃ０．０１,P ＜０．００１)㊁C D １０５(０．３７ʃ０．０２,P ＜０．００１)和软骨表层细胞标志物P r g ４(０．４２ʃ０．０１,P ＜０．００１)㊁E r g (０．６１ʃ０．０２,P ＜０．００１)㊁T e n C (０．６４ʃ０．０７,P ＜０．００１),但显著性高水平表达软骨细胞标志物C o l ２(６．８９ʃ０．０６,P ＜０．００１)㊁A c a n (６．５１ʃ０．０４,P ＜０．００１)㊁M A T N １(１４．５７ʃ４．２１,P ＜０．０１).经过１４d 培养,单个A C S C 可以形成大于５０个细胞的单克隆细胞团.体外诱导A C S C 具备很强的成软骨㊁成骨与成脂分化能力,裸鼠体内A C S C 具有成软骨能力.结论㊀小鼠A C S C 具有典型的干细胞特征.ʌ关键词ɔ㊀纤连蛋白类;关节软骨;干细胞;细胞分化;再生D O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１６７３Ｇ７０８３．２０１８．０５．０１４I s o l a t i o n ,c u l t u r e a n d i d e n t i f i c a t i o n o f c e l l s i n t h e s u p e r f i c i a l z o n e o fm o u s e a r t i c u l a r c a r t i l a ge ㊀T A NQ i a o y a n １,WA N GQ u a n １,K U A N G L i a n g １,X I E Y a n g l i １,３,L IC a n １,L U O F e n gt a o １,D U X i a o l a n １,３,C H E N L i n １,２,３．㊀T r a u m a C e n t e r ,R e s e a r c h I n s t i t u t e o f S u r g e r y ,D a p i n g H o s p i t a l ,A r m y M e d i c a lU n i v e r s i t y １,C h o n g q i n g ４０００４２,C h i n a ;C e n t e r o f B o n eM e t a b o l i s ma n dR e p a i r ２,C h o n g q i n g ４０００４２,C h i n a ;S t a t eK e y L a b o r a t o r y o f T r a u m a ,B u r n s a n dC o m b i n e dI n j u r y ３,C h o n g q i n g ４０００４２,C h i n a C o r r e s p o n d i n g au t h o r :C H E NL i n ㊀E Ｇm a i l :l i n c h e n ７０＠１６３．c o m ʌA b s t r a c t ɔ㊀O b je c t i v e ㊀T o i s o l a t ea n dc u l t u r em o u s ea r t i c u l a r c a r t i l a g es u p e rf i c i a l z o n ec e l l (A C S C ),a n d i d e n t i f y t h e i r c h a r a c t e r i s t i c s ．M e t h o d s C e l l sw e r e i s o l a t e df r o m m o u s ea r t i c u l a rc a r t i l ag es u p e r f i c i a l z o n eb y f i b r o n e c t i n Ｇc o n g l u t i n a t i o na s s a y ．Th ee x p r e s si o no f p o s i t i v e m a r k e r s (C D ４４a n dC D ９０)a n dn e g a t i v em a r k e r s (C D ３１,C D ３４a n dC D ４５)a t t h e s u r f a c e o fA C S Cw e r e d e t e c t e db y f l o wc y t o m e t r y．R e a l Ｇt i m e f l u o r e s c e n t q u a n t i t a t i v er e v e r s et r a n s c r i p t a s e Ｇp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n (q R T ＧP C R )w a su s e dt od e t e c tr e l a t e d g e n ee x p r e s s i o n ．T h ec o l o n y f o r m i n g a b i l i t y o f A C S C w a sd e t e r m i n e db y s i n g l e Ｇc e l lc o l o n y f o r m i n g u n i ta s s a y ．T h e m u l t i l i n e a g ed i f f e r e n t i a t i o n p o t e n t i a lo f A C S C w a s i d e n t i f i e d t h r o u g h c h o n d r o g e n e s i s ,o s t e o g e n e s i s a n d a d i p o g e n e s i s i n d u c t i o ne x p e r i m e n t ．T h e c h o n d r o g e n e s i s p o t e n t i a l o fA C S C w e r e i d e n t i f i e d b y s u b c u t a n e o u s l y t r a n s p l a n t a t i o n i n t o a t h y m i cm i c e ．R e s u l t s F i b r o n e c t i nc o u l ds p e c i f i c a l l y a d h e r e t oA C S C ,w h i c hd i s p l a y e da ne l o n ga t e d ,f ib r o b l a s t ic c y t o a r c h i t e c t u r e ．A C S Cs h o w e dh i g he x p r e s s i o no fC D ４４a n dC D ９０,w h i l eh a rd l ye x p r e s sC D ３１,C D ３４a n dC D ４５．D ef i n i ng th e a m o u n t o fm R N Ae x p r e s s e db y A C S Ca s １,w ed e t e c t e dt h e l o we x p r e s si o no f s t e mc e l lm a r k e r [C D ７３(０．０８ʃ０．０７,P ＜０．００１),C D ９０(０．０７ʃ０．０１,P ＜０．００１),C D １０５(０．３７ʃ０．０２,P ＜０．００１)]a n dc a r t i l a g es u p e r f i c i a l z o n em a r k e r [P r g ４(０．４２ʃ０．０１,P ＜０．００１),E r g(０．６１ʃ０．０２,P ＜０．００１),T e nC (０．６４ʃ０．０７,P ＜０．００１)],b u th i g he x pr e s s i o no f C o l ２(６．８９ʃ０．０６,P ＜０．００１),A c a n (６．５１ʃ０．０４,P ＜０．００１)a n d MA T N １(１４．５７ʃ４．２１,P ＜０．０１)．A f t e r c u l t u r i n g f o r １４d a y s ,s i n g l eA C S Cf o r m e dc o l o n y c o n t a i n i n g m o r e t h a n ５０c e l l s ．６２３国际骨科学杂志㊀２０１８年９月㊀第３９卷㊀第５期㊀I n t JO r t h o p,S e p．２５,２０１８,V o l．３９,N o．５A C S Cw e r e c a p a b l e o f c h o n d r o g e n e s i s,o s t e o g e n e s i s a n d a d i p o g e n e s i s d i f f e r e n t i a t i o n i nv i t r o,a n dh a v eh i g h c h o n d r o g e n e s i s p o t e n t i a l i nv i v o．C o n c l u s i o n F i b r o n e c t i nＧc o n g l u t i n a t i o na s s a y m a y b e a p p l i e d t oo b t a i nA C S Cw i t h c h a r a c t e r i s t i c s o f s t e mc e l l s．ʌK e y w o r d sɔ㊀F i b r o n e c t i n s;C a r t i l a g e,a r t i c u l a r;S t e mc e l l s;C e l l d i f f e r e n t i a t i o n;R e g e n e r a t i o n㊀㊀软骨细胞是关节软骨的主要细胞类型之一,主要通过细胞外基质分泌及蛋白酶类促进软骨基质降解,参与关节软骨稳态的维持.关节软骨组织内无神经㊁血管,因此软骨细胞的增殖能力有限,其损伤后自我修复能力极差.早期研究认为,关节软骨干/祖细胞在R a n v i e r 环㊁髌骨下脂肪垫㊁滑膜及软骨膜处以不同的形式存在[１Ｇ６].干细胞是一类具有自我复制和自我更新能力的多潜能细胞,激活内源性关节软骨干/祖细胞可促进缺损部位自我修复或形成干细胞组织工程化软骨,为软骨再生提供可能性.有学者利用溴脱氧尿苷长时程标记方法发现,在小鼠关节软骨表层确实存在一群增殖缓慢的细胞,提示关节软骨表层可能存在关节软骨干/祖细胞[７].一般认为,关节软骨损伤首先发生在关节软骨表面,导致关节软骨浅表层细胞外基质丢失和细胞死亡.因此,关节软骨极差的自我修复能力可能跟浅表层关节软骨干/祖细胞丢失有关[８Ｇ９].由于干细胞表面高表达纤连蛋白受体Ｇ整联蛋白(α５亚基和β１亚基),纤连蛋白黏附法已广泛应用于羊毛囊干细胞㊁人表皮干细胞㊁鸡关节软骨干细胞等的分离[１０Ｇ１２].本研究利用干细胞易于结合纤连蛋白的特性,从新生３~５d小鼠的关节软骨表层分离关节软骨表层细胞(A C S C),并鉴定其干细胞特征,探索为软骨损伤修复提供新种子细胞的方法.１㊀材料与方法１．１㊀实验动物５周龄裸鼠(雄性,１５~２０g,５只),８周龄C５７小鼠(雌性,２０~２５g,１０只;雄性,２５~３０g,５只)均购自北京华阜康生物技术有限公司,并饲养在第三军医大学第三附属医院S P F级动物中心,经第三军医大学实验动物管理委员会许可进行相关实验.１．２㊀主要试剂及仪器纤连蛋白㊁Ⅰ型胶原酶㊁Ⅱ型胶原酶均购自美国G i b c o公司;０．２５％胰蛋白酶㊁双抗㊁磷酸缓冲盐溶液(P B S)㊁胎牛血清(F B S)㊁D M E M高糖培养基㊁D M E M低糖培养基㊁D M E MＧF１２培养基㊁αＧM E M 培养基均购自美国H y c l o n e公司;T r i z o l试剂购自美国I n v i t r o g e n公司;C D３１单克隆抗体㊁C D３４单克隆抗体㊁C D４４单克隆抗体㊁C D４５单克隆抗体㊁C D９０单克隆抗体㊁基质胶均购自美国B D公司;牛血清白蛋白(B S A)㊁胰岛素Ｇ转铁蛋白(I T S)㊁碱性磷酸酶(A L P)染色试剂盒均购自美国S i g m a公司;成脂诱导检测试剂盒购自美国C h e m i c o n公司;实时荧光定量逆转录Ｇ聚合酶链反应(q R TＧP C R)试剂盒㊁P C R反转录试剂盒均购自日本T a k a r a B i o t e c h n o l o g y公司.A c c u r i C６F l o wC y t o m e t e r流式细胞仪购自美国B D公司㊁M X３０００P定量PC R仪购自美国S t r a t a g e n e公司.１．３㊀软骨细胞的分离培养取新生３~５d小鼠,７５％酒精浸泡消毒,灭菌器械剪开小鼠皮肤,暴露并打开髋关节,游离股骨头,用平头镊小心将股骨头末端的软骨帽(股骨头软骨)取下.软骨帽进一步剪碎至１m m３大小,加入０．１％Ⅱ型胶原酶消化过夜;次日,观察软骨组织消化情况,用D M E MＧF１２培养基(含１０％F B S)终止消化,重悬细胞计数后接种于１２孔板用于后续实验.１．４㊀A C S C的分离培养及其表面抗原鉴定A C S C的分离培养:取新生３~５d小鼠,７５％酒精浸泡消毒,剪取膝关节,体式显微镜下分离肌腱和韧带.０．２５％胰蛋白酶消化１h,再用１７３U/m L 的Ⅰ型胶原酶消化１．５h,收集细胞离心并计数,按５ˑ１０５个细胞接种到预先包被的１０c m培养皿中(０．１％纤维蛋白包被２h,３％B S A封闭３０m i n),２０m i n后D M E M高糖培养基洗去未黏附的细胞,洗２次,黏附的细胞用D M E M高糖培养基培养,待细胞融合后按体积１ʒ１０传到未包被的培养皿. AC S C表面抗原的流式细胞术鉴定:生长至融合的细胞经０．２５％胰蛋白酶消化,１０００r/m i n离心１０m i n,P B S洗涤２次,重悬至单个细胞,分装至１．５m LE P管.２０００r/m i n离心５m i n,再次重悬至单个细胞,１ʒ１０００稀释加入干细胞表面标志物抗体(C D３１㊁C D３４㊁C D４４㊁C D４５与C D９０).４ħ避光孵育３０m i n,P B S洗涤２次,１５００r/m i n离心５m i n,除去未结合的抗体,流式细胞仪检测干细胞表面标志物在A C S C中的表达.７２３国际骨科学杂志㊀２０１８年９月㊀第３９卷㊀第５期㊀I n t JO r t h o p,S e p．２５,２０１８,V o l．３９,N o．５１．５㊀q R TＧP C R方法检测A C S C和软骨细胞的相关基因表达按照说明书采用T r i z o l法提取A C S C和软骨细胞的R N A,用q R TＧP C R试剂盒检测间充质干细胞(M S C)标志分子(C D７３㊁C D９０㊁C D１０５)㊁软骨表层特异标志基因(P r g４㊁E r g㊁T e nC)和软骨细胞相关基因(C o l２㊁A c a n㊁MA T N１)的表达,定量引物序列见表１.表１㊀定量引物序列基因㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀引物序列(５ ＧＧ３ )C D７３正向:C C T G C A C A C A A A C G A C G T G反向:C T G G T C T C C G G C A T C C A A A AC D９０正向:G C T C T C A G T C T T G C A G G T G T反向:C A G G C G A A G G T T T T G G T T C AC D１０５正向:C C C T C T G C C C A T T A C C C T G反向:G T A A A C G T C A C C T C A C C C C T TP r g４正向:G A A A A T A C T T C C C G T C T G C T T G T反向:A C T C C A T G T A G T G C T G A C A G T T A E r g正向:A G C G T C C T C A G T T A G A T C C T T A C反向:T C A T G T T G G G C T T G C T C T T C CT e nC正向:T T T G C C C T C A C T C C C G A A G反向:A G G G T C A T G T T T A G C C C A C T CC o l２正向:C T G G T G G A G C A G C A A G A G C A A反向:C A G T G G A C A G T A G A C G G A G G A A A G A c a n正向:C C T G C T A C T T C A T C G A C C C C反向:A G A T G C T G T T G A C T C G A A C C T MA T N１正向:C A G G T C C C T G A T A G C C T C A G T反向:C C A C G G G T C T C A C A C T T C GC y c l o p h i l i nA正向:C G A G C T C T G A G C A C T G G A G A反向:T G G C G T G T A A A G T C A C C A C C１．６㊀A C S C单克隆形成能力检测A C S C以５０个/c m２接种于６孔板;用D M E M 高糖培养基培养,每３~４d换液１次;根据细胞生长状况,在培养７~１４d时对克隆进行拍照;以５０个细胞以上的群体为１个克隆(单细胞进行有丝分裂５次).１．７㊀A C S C的诱导分化及检测１．７．１㊀成软骨诱导分化及染色A C S C以每孔１ˑ１０５个细胞种于１２孔板,用D M E MＧF１２培养基培养细胞.待细胞９０％融合,将其分为空白组和诱导组,空白组用普通培养基(含１０％FB S＋双抗的D M E MＧF１２培养基)进行培养,诱导组换软骨诱导培养液(含１０％F B S＋双抗＋I T S的D M E MＧF１２培养基)进行软骨诱导,每２d 换液１次.诱导开始记为０d,诱导至７d.弃去培养基,P B S洗涤２次,加入１m L无水甲醇室温固定３０m i n,再予P B S洗涤２次,加入１m L １％阿尔新蓝染液置于４ħ冰箱过夜;第２天弃去染液,以含０．１m o l/L的盐酸洗涤２次,充分清洗去除非特异染色.１．７．２㊀成骨诱导分化及染色A C S C以每孔１ˑ１０５个细胞种于１２孔板,用D M E M高糖培养基培养细胞.待细胞生长达到８０％融合,将其分为空白组和诱导组,空白组用普通培养基(含１０％FB S＋双抗的αＧM E M培养基)进行培养,诱导组换用成骨诱导培养液(含１０％F B S＋双抗＋０．０１m o l/LβＧ磷酸甘油钠＋５０μg/m L抗坏血酸＋０．０１μm o l/L地塞米松的αＧM E M培养基)进行成骨诱导,每３d换液１次.诱导培养１４d后对１２孔板培养的细胞进行A L P染色和茜素红染色,观察其成骨及矿化情况.弃去培养基,P B S洗涤２次,４％多聚甲醛４ħ固定１５m i n,再以P B S洗涤２次,加入A L P染色液(根据说明书现配现用),３７ħ孵育３０m i n,P B S洗涤２次.弃去培养基,P B S洗涤２次,加入４％多聚甲醛,４ħ固定１h;弃去固定液,P B S洗涤２次,每孔加入５００μL含１％茜素红和２％乙醇的混合染色工作液,于室温染色１５m i n;吸弃染色液,在摇床上用去离子水洗涤染过的细胞５次,每次３m i n;３７ħ保温箱中过夜.１．７．３㊀成脂诱导分化及染色A C S C以每孔１ˑ１０５个细胞种于１２孔板,生长至１００％融合,将其分为空白组和诱导组.空白组用普通培养基(含１０％FB S＋双抗的D M E M低糖培养基)进行培养.诱导组换用诱导培养液(含１０％F B S＋双抗＋１μm o l/L地塞米松＋０．５m m o l/L 磷酸二脂酶抑制剂＋１００μm o l/L吲哚美辛＋１０μg/m L 胰岛素的D M E M低糖培养基)进行成脂诱导,诱导３d,换维持培养液(含１０％F B S＋双抗＋１０μg/m L 胰岛素的D M E M低糖培养基)培养３d,如此循环至成脂诱导２１d,用４％多聚甲醛固定,油红O染８２３国际骨科学杂志㊀２０１８年９月㊀第３９卷㊀第５期㊀I n t JO r t h o p,S e p．２５,２０１８,V o l．３９,N o．５色,观察脂肪积聚.弃去培养基,P B S洗涤２次;４％多聚甲醛室温固定２０m i n;P B S洗涤２次,空气中干燥;加入０．５％的油红O液室温孵育１h;P B S洗涤２次.１．８㊀A C S C裸鼠移植成软骨实验取未经诱导的第６代A C S C,经胰酶消化后以细胞数６ˑ１０６~８ˑ１０６个/m L与基质胶按体积１ʒ１混匀,每只裸鼠以２５０μL混合液皮下注射于背腹部.１０d后裸鼠予吸入C O２处死,取下背腹部组织块,予４％多聚甲醛固定㊁梯度脱水㊁石蜡包埋㊁连续切片,苏木素Ｇ伊红(H E)和阿尔新蓝染色.１．９㊀统计学分析采用S P S S１０．０软件进行统计学分析,计量资料以均数ʃ标准差表示,t检验,P＜０．０５为差异有统计学意义.２㊀结果２．１㊀A C S C与软骨细胞的形态学及基因表达比较相比软骨细胞在低密度培养时呈规则的多边形及融合时呈铺路石样的形态特性,经纤连蛋白黏附法分选出的A C S C形态偏长,类似成纤维细胞,见图１.图１㊀A C S C与软骨细胞在光学显微镜下形态比较(ˑ１００)㊀㊀基因检测分析发现:以A C S C表达的M S C㊁软骨表层细胞及软骨细胞标志物的m R N A水平为１,则软骨细胞显著性低水平表达M S C标志物C D７３(０．０８ʃ０．０７,P＜０．００１)㊁C D９０(０．０７ʃ０．０１,P＜０．００１)㊁C D１０５(０．３７ʃ０．０２,P＜０．００１)和软骨表层细胞标志物P r g４(０．４２ʃ０．０１,P＜０．００１)㊁E r g (０．６１ʃ０．０２,P＜０．００１)㊁T e nC(０．６４ʃ０．０７, P＜０．００１),但显著性高水平表达软骨细胞标志物C o l２(６．８９ʃ０．０６,P＜０．００１)㊁A c a n(６．５１ʃ０．０４,P＜０．００１)㊁MA T N１(１４．５７ʃ４．２１,P＜０．０１).见图２.图２㊀A C S C与软骨细胞相关基因表达比较㊀∗∗P＜０．０１,∗∗∗P＜０．００１,对A S C S的m R N A水平２．２㊀A C S C表面干细胞抗原的表达流式细胞仪检测结果显示:A C S C高表达干细胞表面阳性标志物C D４４和C D９０,分别为９６．６％和６８．３％;但几乎不表达干细胞表面阴性标志物C D３１㊁C D３４和C D４５,分别为０．０７２％㊁０．１４４％和０．０７６％(下页图３).２．３㊀A C S C单克隆形成能力单克隆形成实验显示:经１４d培养,单个A C S C可以形成大于５０个细胞的单克隆细胞群,见下页图４.９２３国际骨科学杂志㊀２０１８年９月㊀第３９卷㊀第５期㊀I n t JO r t h o p,S e p．２５,２０１８,V o l．３９,N o．５图３㊀A C S C 表面干细胞抗原的表达图４㊀光学显微镜下A C S C单克隆形成情况(ˑ４０)２．４㊀A C S C多系诱导分化情况经过７d连续成软骨诱导,A C S C阿尔新蓝染色可见明显着色,即分泌较多软骨细胞的细胞外基质和蛋白多糖(图５a);经过１４d连续成骨诱导, A C S C的A L P表达量显著高于空白组(图５b),茜素红染色明显比空白组着色深,形成的矿化结节数量也明显多于空白组(图５c);经过２１d连续成脂诱导,A C S C油红O染色呈显著的阳性,大量脂肪滴着红色(图５d).２．５㊀A C S C裸鼠移植成软骨能力检测裸鼠皮下移植A C S C后１０d取材,经石蜡包埋切片及H E和阿尔新蓝染色显示:细胞呈软骨细胞样,并大量分泌软骨细胞的细胞外基质和蛋白多糖,阿尔新蓝染色可见明显着色(图６).３㊀讨论组织特异性干细胞的募集㊁增殖和分化是组织损伤后最高效的修复途径.随着研究手段的更新,近年来大量研究显示,在关节软骨表层存在一群具有干细胞特性的细胞.本研究利用纤连蛋白黏附法从新生３~５d小鼠的关节软骨表层成功分离出A C S C.此类细胞高表达软骨表层细胞特异标志基因(P r g４㊁E r g㊁T e n C)和低表达软骨细胞相关基因(C o l２㊁A c a n㊁MA T N１),与文献[１３Ｇ１６]报道一致.此外,A C S C与关节的软骨细胞在形态学上也存在显著差异.A C S C类似成纤维细胞,无原代关节软骨细胞在低密度培养时呈规则的多边形及融合时呈铺路石样的形态特性.干细胞表面标志物的表达水平在判断细胞特性中起决定作用,但目前没有公认的单一性标志物,主要采用几种标志物的组合.本研究通过流式细胞仪分别检测２种干细胞阳性标志物(C D４４㊁C D９０)和３种阴性标志物(C D３１㊁C D３４㊁C D４５),结果表明,通过纤连蛋白黏附法分离的A C S C具有明显的干细胞特性.自我更新和多系诱导分化能力是干细胞的基本特征.克隆形成实验发现,单个A C S C可以形成大于５０个细胞的单克隆细胞群(发生大于５次０３３国际骨科学杂志㊀２０１８年９月㊀第３９卷㊀第５期㊀I n t JO r t h o p,S e p．２５,２０１８,V o l．３９,N o．５的有丝分裂);诱导培养条件下,A C S C分泌大量软骨细胞的细胞外基质和A L P,并生成矿化结节及发生脂肪积聚,表现出很强的单克隆形成能力和三系诱导分化能力(成软骨㊁成骨和成脂分化),说明A C S C具有明显的干细胞特性;未经诱导的第６代A C S C的裸鼠移植实验发现,细胞呈软骨细胞样并大量分泌细胞外基质和蛋白多糖,进一步说明A C S C具备体内自行向软骨细胞分化的能力.图５㊀A C S C 多系诱导分化能力检测图６㊀A C S C裸鼠移植成软骨能力检测光学显微镜下所见(红色箭头所示为软骨细胞样细胞)㊀㊀目前,软骨损伤修复主要采用其他组织来源的M S C(主要为骨髓M S C)体外大量扩增,或自体软骨细胞移植.M S C扩增培养过程中,由于自身有限的增殖能力和容易去分化的特性,扩增后的软骨细胞丢失软骨表型,导致移植区新形成的软骨最终变为纤维软骨,无法达到透明软骨所具有的耐磨损和耐压力的生物特性,严重影响后期临床效果.此外,自体软骨细胞移植需要２次手术,带来的风险和痛苦不为大多数患者所接受[１７Ｇ１９].理想的关节软骨修复要求新生软骨具有与原关节软骨相同的分层结构㊁１３３国际骨科学杂志㊀２０１８年９月㊀第３９卷㊀第５期㊀I n t JO r t h o p,S e p．２５,２０１８,V o l．３９,N o．５生物学特性及基质组分,并实现功能学恢复,而非仅仅是填充缺损部位.J i a n g等[２０]和S e o l等[２１]发现,关节软骨表层来源的关节软骨干/祖细胞能够分化为软骨细胞,并且可以迁移至软骨损伤部位进行软骨修复,但具体机制不清.激活内源性的关节软骨干/祖细胞促进缺损部位自我修复为软骨再生提供了可能性.因此,随着对A C S C研究的深入,有望实现依靠软骨损伤部位自有的表层干细胞形成种子细胞,达到促进软骨损伤修复的目的.分离培养A C S C是了解该细胞特性的第一步,本研究提供了一种经济㊁有效的实验方法,可望促进生理和病理情况下A C S C生物学行为的研究.参考文献[１]㊀K a r l s s o n C,T h o r n e m o M,H e n r i k s s o n H B,e t a l．I d e n t i f i c a t i o n o f a s t e mc e l l n i c h e i n t h e z o n e o f R a n v i e rw i t h i nt h ek n e e j o i n t[J]．JA n a t,２００９,２１５(３):３５５Ｇ３６３．[２]㊀X u eK,Z h a n g X,Q iL,e t a l．I s o l a t i o n,i d e n t i f i c a t i o n,a n dc o m p a r i s o no fc a r t i l a g es t e m p r o g e n i t o r/c e l l s f r o m a u r i c u l a rc a r t i l a g e a nd pe r i c h o n d r i u m[J]．A mJT r a n s lR e s,２０１６,８(２):７３２Ｇ７４１．[３]㊀D e r k s M,S t u r m T,H a v e r i c h A,e t a l．I s o l a t i o n a n dc h o nd r o ge n i c d if f e r e n t i a t i o n o f p o r c i n e p e r i c h o n d r i a lp r o g e n i t o r c e l l s f o r t h e p u r p o s e o f c a r t i l a g e t i s s u e e n g i n e e r i n g[J]．C e l l sT i s s u e sO r g a n s,２０１３,１９８(３):１７９Ｇ１８９．[４]㊀K o b a y a s h i S,T a k e b e T,I n u i M,e ta l．R e c o n s t r u c t i o no fh u m a ne l a s t i c c a r t i l a g eb y aC D４４＋C D９０＋s t e mc e l l i n t h ee a r p e r i c h o n d r i u m[J]．P r o cN a t lA c a dS c iUSA,２０１１,１０８(３５):１４４７９Ｇ１４４８４．[５]㊀K o b a y a s h iS,T a k e b e T,Z h e n g YW,e ta l．P r e s e n c e o fc a r t i l a g e s t e m/p r o g e n i t o r c e l l s i n ad u l t m i ce a u r i c u l a rp e r i c h o n d r i u m[J]．P L o SO n e,２０１１,６(１０):e２６３９３．[６]㊀F e l l o w s C R,M a t t a C,Z a k a n y R,e ta l．A d i p o s e,b o n e m a r r o wa n d s y n o v i a l j o i n tＧd e r i v e dm e s e n c h y m a l s t e mc e l l s f o rc a r t i l a g e r e p a i r[J]．F r o n tG e n e t,２０１６,７:２１３．[７]㊀C a nde l a M E,Y a s u h a r a R,I w a m o t o M,e ta l．R e s i d e n t m e s e n c h y m a l p r o g e n i t o r so fa r t i c u l a rc a r t i l a g e[J]．M a t r i xB i o l,２０１４,３９:４４Ｇ４９．[８]㊀L o t zM,L o e s e rR F．E f f e c t so fa g i n g o na r t i c u l a rc a r t i l a g eh o m e o s t a s i s[J]．B o n e,２０１２,５１(２):２４１Ｇ２４８．[９]㊀C a r a mésB,T a n i g u c h iN,S e i n oD,e t a l．M e c h a n i c a l i n j u r y s u p p r e s s e s a u t o p h a g y r e g u l a t o r s a n d p h a r m a c o l o g i c a c t i v a t i o no fa u t o p h a g y r e s u l t si n c h o n d r o p r o t e c t i o n[J]．A r t h r i t i sR h e u m,２０１２,６４(４):１１８２Ｇ１１９２．[１０]㊀J o n e sP H,W a t tF M．S e p a r a t i o no fh u m a ne p i d e r m a ls t e mc e l l s f r o mt r a n s i t a m p l i f y i n g c e l l s o n t h e b a s i s o fd i f fe r e n c e s i ni n t e g r i n f u n c t i o n a n d e x p r e s s i o n[J]．C e l l,１９９３,７３(４):７１３Ｇ７２４．[１１]㊀H eN,D o n g Z,T a oL,e t a l．I s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o n o f h a i rf o l l i c l es t e m c e l l sf r o m A r b a s C a s h m e r e g o a t[J]．C y t o t e c h n o l o g y,２０１６,６８(６):２５７９Ｇ２５８８．[１２]㊀L i L,M a Y,L i X,e t a l．I s o l a t i o n,c u l t u r e,a n dc h a r a c t e r i z a t i o n o f c h i c k e n c a r t i l a g e s t e m/p r o g e n i t o r c e l l s[J]．B i o m e dR e s I n t,２０１５,２０１５:５８６２９０．[１３]㊀Y a s u h a r aR,O h t aY,Y u a s aT,e t a l．R o l e so f b e t aＧc a t e n i n s i g n a l i n g i n p h e n o t y p i c e x p r e s s i o n a n d p r o l i f e r a t i o n o fa r t i c u l a r c a r t i l a g e s u p e r f i c i a l z o n e c e l l s[J]．L ab I n v e s t,２０１１,９１(１２):１７３９Ｇ１７５２．[１４]㊀K o y a m aE,S h i b u k a w a Y,N a g a y a m a M,e ta l．A d i s t i n c tc o h o r to f p r o g e n i t o rc e l l s p a r t i c i p a t e si ns y n o v i a l j o i n ta n da r t i c u l a r c a r t i l a g e f o r m a t i o n d u r i n g m o u s e l i mb s k e l e t o g e n e s i s[J]．D e vB i o l,２００８,３１６(１):６２Ｇ７３．[１５]㊀D o w t h w a i t eG P,B i s h o p J C,R e d m a nS N,e t a l．T h e s u r f a c e o f a r t i c u l a r c a r t i l a g e c o n t a i n s a p r o g e n i t o r c e l l p o p u l a t i o n[J]．JC e l l S c i,２００４,１１７(P t６):８８９Ｇ８９７．[１６]㊀I w a m o t oM,T a m a m u r aY,K o y a m aE,e t a l．T r a n s c r i p t i o nf a c t o rE R Ga n d j o i n t a n da r t i c u l a r c a r t i l ag e f o r m a t i o nd u r i n gm o u s e l i m b a n d s p i n e s k e l e t o g e n e s i s[J]．D e vB i o l,２００７,３０５(１):４０Ｇ５１．[１７]㊀B u r k e J,H u n t e rM,K o l h eR,e t a l．T h e r a p e u t i c p o t e n t i a l o f m e s e n c h y m a l s t e mc e l lb a s e dt h e r a p y f o ro s t e o a r t h r i t i s[J]．C l i nT r a n s lM e d,２０１６,５(１):２７．[１８]㊀F r e i t a g J,B a t e sD,B o y dR,e ta l．M e s e n c h y m a l s t e m c e l l t h e r a p y i n t h e t r e a t m e n t o f o s t e o a r t h r i t i s:r e p a r a t i v ep a t h w a y s,s a f e t y a n d e f f i c a c y．A r e v i e w[J]．B M CM u s c u l o s k e l e tD i s o r d,２０１６,１７:２３０．[１９]㊀Z h a n g W,O u y a n g H,D a s sC R,e t a l．C u r r e n t r e s e a r c ho n p h a r m a c o l o g i ca n dr e g e n e r a t i v et h e r a p i e sf o ro s t e o a r t h r i t i s[J]．B o n eR e s,２０１６,４:１５０４０．[２０]㊀J i a n g Y,C a iY,Z h a n g W,e ta l．H u m a nc a r t i l a g eＧd e r i v e d p r o g e n i t o rc e l l sf r o m c o m m i t t e d c h o n d r o c y t e sf o re f f i c i e n tc a r t i l a g e r e p a i r a nd re g e n e r a t i o n[J]．S t e mC e l l sT r a n s lM e d,２０１６,５(６):７３３Ｇ７４４．[２１]㊀S e o lD,M c C a b eD J,C h o eH,e t a l．C h o n d r o g e n i c p r o g e n i t o rc e l l s r e s p o nd t o c a r t i l a ge i n j u r y[J]．A r t h r i t i sR h e u m,２０１２,６４(１１):３６２６Ｇ３６３７．(收稿:２０１８Ｇ０２Ｇ０５)(本文编辑:杨晓娟)２３３。
软骨实验报告总结
摘要：本研究旨在通过体外培养软骨细胞，探讨软骨细胞的生长特性、增殖能力及其在生物医学领域的应用潜力。
通过一系列实验，我们对软骨细胞的体外培养条件、增殖状态、细胞形态及功能进行了深入研究。
以下为实验总结。
一、实验目的和要求：1. 建立软骨细胞体外培养体系，优化培养条件。
2. 观察软骨细胞的增殖状态、细胞形态变化及功能表达。
3. 探讨软骨细胞在生物医学领域的应用前景。
二、实验仪器设备：1. 培养箱2. 超净工作台3. 移液器4. 倒置显微镜5. CO2培养箱6. 电热恒温水浴锅7. 流式细胞仪8. 低温离心机9. 低温冰箱三、实验设计及调试：（一）实验内容：1. 软骨细胞分离与培养2. 软骨细胞增殖实验3. 软骨细胞形态观察4. 软骨细胞功能实验（二）实验电路：无（三）实验设计及调试步骤：1. 对实验内容和实验电路进行分析，理出完成实验的设计思路。
2. 列出程序设计所需的特殊标志位、堆栈sp、内部ram、工作寄存器等资源的分配列表，分配列表时注意考虑资源在程序执行过程可能会出现冲突的问题。
3. 画出程序设计流程图，包括主程序和各子程序流程图。
4. 根据上述内容写出实验程序。
5. 调试程序，使用模拟仿真器进行模拟实验，观察结果，修改程序，继续调试，直至实验成功。
（四）实验调试过程中所遇到的问题、解决问题的思路和方法：1. 问题：软骨细胞在培养过程中出现污染。
解决方法：加强无菌操作，提高实验室空气质量，定期更换培养箱内的空气。
2. 问题：软骨细胞增殖缓慢。
解决方法：优化培养条件，调整细胞密度，增加生长因子。
3. 问题：软骨细胞功能表达不足。
解决方法：延长培养时间，提高细胞浓度，优化培养条件。
四、实验结果与分析：1. 软骨细胞在体外培养条件下，成功分离并建立了稳定的细胞系。
2. 软骨细胞增殖实验结果显示，细胞在体外培养条件下具有较好的增殖能力。
3. 软骨细胞形态观察表明，细胞呈典型的软骨细胞形态，细胞质丰富，细胞核清晰。
关节软骨合成代谢基因
关节软骨合成代谢基因1.引言1.1 概述关节软骨合成代谢基因是指参与关节软骨细胞合成代谢过程的基因。
关节软骨是人体关节内的重要组织之一，具有缓冲、保护关节及减轻关节运动时的冲击功能。
关节软骨的合成代谢过程包括合成和分解两个方面，合成代谢决定了关节软骨的生长和修复能力，而分解代谢则维持了关节软骨组织的稳态。
因此，关节软骨合成代谢基因的研究对于理解关节软骨的生物学过程以及关节疾病的发生和治疗具有重要意义。
在过去的几十年中，随着生物技术和基因组学的快速发展，研究者们发现了一系列参与关节软骨合成代谢的基因。
这些基因包括编码关节软骨细胞合成关键蛋白的基因、调控关节软骨细胞代谢过程的转录因子基因，以及调节关节软骨细胞信号通路的基因等。
这些基因在维持关节软骨细胞的正常功能和促进关节软骨组织的伤口修复中发挥着重要的作用。
当前，关节疾病如骨关节炎等给人们的生活和健康带来了巨大负担。
因此，研究关节软骨合成代谢基因对于深入理解关节疾病的发生机制、寻找新的治疗策略具有重要价值。
未来的研究方向可以包括对关节软骨合成代谢基因的功能与调控机制的进一步研究，以及开发相关的治疗药物和干预手段，从而为预防和治疗关节疾病提供新的思路和方法。
文章结构部分的内容可以描述本文的整体结构安排和文章各个部分的内容概述。
可以按照以下方式编写：1.2 文章结构本文主要包括以下几个部分：引言部分：在引言部分，我们将概述关节软骨合成代谢基因的研究背景和意义，并提出本文的目的。
正文部分：正文部分将分为两个小节，分别介绍了关节软骨合成代谢基因的概念以及其在维持关节健康和功能中的作用。
结论部分：结论部分将对关节软骨合成代谢基因的重要性进行总结，并展望未来的研究方向。
通过以上文章结构，我们希望能够全面深入地介绍关节软骨合成代谢基因的相关知识，帮助读者更好地了解其在维持关节功能中的重要性，并为未来的研究提供一定的参考。
文章1.3 目的部分的内容可以是：本文的目的旨在深入探讨关节软骨合成代谢基因的作用和重要性。
软骨细胞特殊染色技术的比较与应用
软骨细胞特殊染色技术的比较与应用于斐;曾晖;于红燕;雷鸣;袁昊;肖德明【摘要】Objective To compare the advantages and values of several special staining methods of chondrocytes . Methods Twelve 7-day old healthy C57BL/6J mice were killed to obtain the cartilage tissue of the knee joint in order to isolate the chondrycytes .Type II collagen was used to assess the chondrocytes .Then the chondrocyte climbing slices were prepared.The materials were fixed, and HE staining, Safranin O-fast green staining, SA-β-gal staining and immunohistochemical staining of Type II collagen were performed and compared .Results HE staining showed clear morphology of the chondrocytes .The cell nuclei were stained blue and the cytoplasm was pink .Safranin O-fast green staining showed that the nuclei were pink and the cytoplasm green .SA-β-gal staining showed that the aging cells were green while the young cells werecolorless .Immunohistochemical staining of type II collagen showed the distribution of type II collagen and they were stained brown while the cell nuclei were blue .Conclusions HE staining and safranin O-fast green staining can provide more information than the other staining techniques .SA-β-gal staining is useful in the analysis of aging chondrocytes .Immunohistochemical of type II collagen can be used to study type II collagen .%目的：探讨多种特殊染色技术在软骨细胞中的染色规律及其应用价值。
骨关节炎小鼠模型特点
骨关节炎小鼠模型特点骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨退变为特征的慢性关节疾病，主要表现为关节疼痛、僵硬和功能障碍。
为了研究骨关节炎的发病机制以及寻找治疗方法，科学家们常常使用动物模型来模拟人类骨关节炎的病理过程和临床表现。
其中，骨关节炎小鼠模型是研究最为广泛的模型之一。
骨关节炎小鼠模型的特点主要体现在以下几个方面：1. 遗传模型：骨关节炎小鼠模型可以通过遗传方法获得。
科学家们通过基因突变或者基因敲除技术，使小鼠在特定基因上发生突变，从而模拟人类骨关节炎的遗传基础。
这种模型能够帮助科学家们研究骨关节炎的发病机制以及寻找新的治疗靶点。
2. 创伤模型：骨关节炎小鼠模型可以通过创伤方法获得。
科学家们可以通过机械刺激、手术或者化学物质的注射来引发小鼠的关节损伤，从而模拟人类骨关节炎的创伤性损伤。
这种模型能够帮助科学家们研究骨关节炎的病理生理过程以及寻找创伤性骨关节炎的治疗方法。
3. 药物诱导模型：骨关节炎小鼠模型可以通过给小鼠注射特定的药物来诱发关节炎。
常用的药物包括葡萄糖胺、角蛋白酶、股骨头坏死诱导剂等。
这种模型能够帮助科学家们研究骨关节炎的发病机制以及寻找治疗骨关节炎的药物。
4. 评价指标：骨关节炎小鼠模型的评价指标主要包括关节疼痛、关节炎指数、关节软骨退变程度等。
关节疼痛可以通过小鼠的行为观察和行为学测试来评估。
关节炎指数可以通过关节组织的病理学检查来评估。
关节软骨退变程度可以通过X线检查、组织学检查和免疫组化检查等方法来评估。
骨关节炎小鼠模型的特点使其成为研究骨关节炎的理想工具。
通过这种模型，科学家们可以模拟人类骨关节炎的病理过程和临床表现，深入研究骨关节炎的发病机制以及寻找新的治疗方法。
此外，骨关节炎小鼠模型还可以为药物研发提供有效的评价方法，加速新药的研究和开发。
骨关节炎小鼠模型具有遗传模型、创伤模型、药物诱导模型等特点，通过评价关节疼痛、关节炎指数和关节软骨退变程度等指标，可以模拟人类骨关节炎的病理过程和临床表现。
软骨细胞培养及其调控
关键词：软秤细胞自从1965年chestman和Smith首先开始软件细胞体外培养用于软丹缺损修复的研究以来［1］,人们开始对关节软计损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。
实验证明不仅年幼且年老的关肖软丹标本仍可在体外培养岀新生透明软计［2］。
虽然软秤细胞增殖能力有限，英质与量直接影响体外培养扩增效果，软竹细胞生长环境不同所表现出的生物学特性也有差别。
软卄细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持表型稳泄，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软计细胞可形成结节结构其细胞形态胞外基质分泌和软计特异性基因表达皆与关节软竹相似。
软竹细胞的生长密度对其生长也至关重要。
在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软秤细胞的生长分裂经过和形态功能完全不同。
组织学检査表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软件细胞靠自分泌或旁分泌信号的方式而存活。
1细胞因子对体外培养软件细胞的影响软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软柠细胞单层培养修复关右软计缺损及体外大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益深入，细胞因子参与调节软竹细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培养研究又提出了一个新方向。
近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软计细胞体外增殖分化等的影响研究也较多。
也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软秤细胞。
目前认为促进软竹细胞增殖和基质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-Bs.PDGF,FGF.EGF,对软骨细胞有抑制作用的有IL- 1、IL-2、IL-7、TNF-« . IFN-丫等，现就对软竹细胞有显著调节的细胞因子分述如下：1. 1转化生长因子beta （TGF-p）TGF-B最初是由Robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。
海南大学生物工程学院2021年《细胞生物学》考试试卷(482)
海南大学生物工程学院2021年《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（40分，每题5分）1. 高尔基网膜的形成面与成熟面的形态结构不一样，形成面较厚，而成熟面较薄。
（）答案：错误解析：高尔基体的形成面较薄，成熟面较厚。
2. 单个核糖体的大小亚基总是结合在一起，核糖体之间从不交换亚基。
（）答案：错误解析：在每一轮翻译后，核糖体的核糖体之间会进行互换。
当核糖体从一条mRNA链上释放下来后，它的两个轻链解体，进入一个含游离大亚基较小和小亚基的库，并从那里形成翻译一条新mRNA时所需的核糖体。
3. 溶酶体中成熟的水解酶分子带有独特的标记——甘露糖6磷酸（M6P），它是溶酶体水解酶分选的重要识别信号。
（）答案：错误解析：前半句错误，溶酶体中成熟的溶酶体被去磷酸化，不具有M6P 标志。
在高尔基体M6P是溶酶体水解酶分选的重要识别信号。
4. 常染色体的所有基因都具有转录活性。
（）答案：错误解析：5. 单个基因的突变能够引起转决定。
（）答案：错误解析：转决定是一群细胞突变的结果。
6. 核孔复合体中央有一通道，其大小不能调节，但蛋白质自细胞质输入核内以及RNA自核内输出到胞质，都是高度有选择性的。
（）答案：错误解析：核孔复合体的有效通道的大小是可以调节的。
7. 相对其他组织器官，肝脏具有较强的再生能力，其再生过程也包括去分化和再分化两阶段。
（）答案：错误解析：肝脏再生不涉及转分化，干细胞只是从G0期进入细胞周期。
8. 细胞壁可以看作是高等植物细胞的胞外基质，但它仅仅起支持与保护作用。
（）答案：错误解析：细胞壁保护环境不仅起支持与保护作用，而且其中的水分子某些寡糖具有信号分子的作用。
2、名词解释（40分，每题5分）1. SNAREs（soluble NSF attachment protein recepter）答案：SNAREs（soluble NSF attachment protein recepter）是胶体所称真核细胞生物膜上的跨膜蛋白大家族，负责介导真核细胞内的碳纳米管膜泡运输。
不同相对分子量透明质酸功能及应用的研究
不同相对分子量透明质酸功能及应用的研究黄岳山，潘艺茗，薛静【摘要】透明质酸是一种大分子粘多糖，其牛物活性和使用效果具有Ｍｒ相关性，应根据使用目的的不同，选择合适的分子量。
本文主要综述了，近年来不『川相对分子量透明质酸功能及应用的研究进展。
其中详细介绍ｒ高分子量的ＨＡ具有较好的粘弹性、保湿性、抑制炎性反应、润滑、药物缓释等功能，及在骨关节炎的治疗、术后防粘连、眼科手术黏弹剂和滴眼液等领域的广泛应用。
低分子量ＨＡ（ＬＭＷＨＡ）和ＨＡ寡聚糖（ｏ－ＨＡ）有抗肿瘤、促进伤口愈合、促进ｆＩｌＬ管生成、免疫调节等作用，且通过对ＨＡ的降解町获得ＩＭＷＨＡ和。
一ＨＡ。
【关键词】透明质酸；分子量；功能；应用中图分类号：Ｒ３１８．０８文献标志码：Ａ文章编号：１００５—０８０９（２０１０）０４－００２２—０４ＲｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅＦｕｎｃｔｉｏｎａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＨｙａｌｕｒｏｎｉｃＡｃｉｄｗｉｔｈＤｉｆｆｅｒｅｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｇｈｔｓＨＵＡＮＧＹｕｅ－ｓｈａｎ，ＰＡＮＹｉ－ｍｉｎｇ，ＸＵＥＪｉｎｇ（Ｂ／ｏｌｏＣｃ口ｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏｌｌｅｇｅ，ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０００６，吼ｉ，叫【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｉｓａｋｉｎｄｏｆｍａｃｘｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｕｅｏｐｏｌｙｓａｅｃｈａｒｉｄｅ。
ｗｈｏｓｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｕｓｅｅｆｆｅｃｔａｓｓ∞ｉａｔｅｗｉｔｈｉｔｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ，ＳＯｗｅｓｈｏｕｌｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｕｒｐｏｓｅｓ，ｓｅｌｅｃｔｔｈｅａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｒｅｖｉｅｗｓｔｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｙａｌｕｒｏｎｉｅａｃｉｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｓｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ，ｔｈｅＨＡｗｉｔｈｈｉｉｇｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ（ＨＭＷＨＡ）ｈａｓｂｅｅｎｗｉｄｅｌｙａｐｐｌｉｅｄｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄｓｏｆｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ。
小鼠骨关节炎造模
小鼠骨关节炎造模骨关节炎(osteoarthritis，OA)是以关节软骨下骨硬化或囊性变，关节边缘骨质增生，滑膜增生，关节间隙变窄为主要特征。
其与遗传，肥胖，代谢障碍，外伤等多种因素有关，是导致中老年人活动功能障碍的主要疾病之一。
建立OA动物模型是寻找有效治疗措施的重要途径。
自发性OA动物模型1941年Ruth Silberberg研究发现，C57BL小鼠喂以含高脂肪的饲料，可加速其关节的退变。
内田亩等以此研究STR/ort小鼠血脂异常与骨关节炎的关系。
Yamamoto K对C57黑鼠关节软骨组织学评估表明，其发病率和骨关节炎严重程度随年龄逐渐增加。
不可逆转的变化出现在最后阶段，而退化过程十分类似人类骨关节炎。
但其模型与人类OA存在一定的差别，主要表现为几乎无关节软骨的微纤维化，关节软骨剥离脱落呈腐蚀状，软骨细胞几无集簇形成，无骨棘形成，滑膜炎症不明显，OA进展过程中不伴有GAG、DNA合成增加。
试验常选用与人类病理改变相似，易于饲养，观察且费用较低的Hartly豚鼠。
Hartly豚鼠软骨的降解与人类OA发展相似。
雄性Hartly豚鼠膝关节组织学形态变化以负重部位为主，表现为软骨表层不平整，表层软骨细胞丢失，胶原不同程度的溶解，断裂和排列紊乱，软骨细胞集簇，潮线异常，糖胺聚糖分布异常，与人类OA具有类似的病理改变。
de Bri等报道了不同年龄的雄性Hartly豚鼠原发性OA 模型的结果，其关节软骨重度降解是在12及18个月年龄组。
Ross 等取正常狗胫骨平台软骨进行体外培养4周，研究结果提示培养过程中软骨改变与骨关节炎病程相似，因此可作为研究骨关节炎起病及进展的体外模型。
诱发性OA动物模型2.1 药物注入关节腔2.1.1 尿激酶型纤溶酶原激活物( uPA)石辉等利用关节腔注射尿激酶的方法制作兔骨关节炎模型，实验12周即可完成，其方法为: 实验组在右膝关节内注射uPA，对照组注射等容量的生理盐水，注射完成后在4、8、12周分批取兔滑膜进行软骨组织学观察，及电镜检查。
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于 低 氧 （ ： 积 百分 比为 ２ ） 常氧 （： 积 百分 比 ２ ％ ） 件 下 培养 ， 用 四 甲基 偶氮 唑 盐 （ Ｔ ） Ｏ体 ％ 和 Ｏ体 １ 条 应 Ｍ Ｔ 法 检 测细 胞 活性 ； ＴＰ Ｒ检测 细胞 葡 萄 糖转 运 体 一， Ｒ —Ｃ １ ３及磷 酸 果糖 激 酶 ｍ Ｎ Ｒ Ａ的表 达 ； 萄糖 氧 化 酶方 法 葡 测 定 细胞 对 葡 萄糖 的摄 取量 。 结 果 Ⅱ 胶 原 免疫 组 化 和 阿 利 辛蓝 染 色 证 实 获得 细 胞 为 透 明软 骨 细 型 胞 。低氧 培养 环 境可 提 升 细胞 的增 殖 能 力 ， 细 胞 表 达低 氧诱 导 因 子 ； 随低 氧 诱 导 因子 一 的表 诱导 １ 伴 １ 达 及 其 表 达量 的提 高 ， 萄 糖 转 运 体 一， 葡 １ ３和磷 酸 果 糖 激 酶 的表 达水 平 升 高 ， 胞 对 葡 萄 糖 的摄 取 量 细 增 加 。 结论 所 建 立 的分 离 、 养 方 法 可 以获 得 高 纯 度 的透 明软 骨 细 胞 ； 骨 细 胞 可 通 过 氧 感 应 机 培 软 制 以 适 应 低 氧环 境 而调 整 其 代 谢 和 生 存 状 态 。 【 键 词 】 软 骨细 胞 ； 细 胞 低 氧 ； 鼠 关
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中华 关 节 外 科 杂 志 （ 子 版 ）２ ０ 电 ０ ７年 ４月 第 １ 第 １ 卷 期 Ｃ ｉ ｏｎ Ｓｒ（ ｌｃ ｏｉ Ｖ ｒｉｎ ， ｒ ０ ７ ｏ．１ ｏ １ ｈｎＪＪｉｔ ｕｇＥｅｔ ｎｃ ｅｓ ）Ａｐｉ２ ０ ，Ｖ １ ，Ｎ ． ｒ ｏ ｌ
ｃ ｌｕ ｅ ｎｄ ｉ ｅ ｔｇ ｔ ｈ ｆｅ ｔ ｆｈｙ ｏ ｉ ｎ ｃ ｌ ｖａ ｉｉｙ ａ ｄ ｍ ｅａ ｏｉｍ ｕ ｔｒ ｄ ａ ｎｖ ｓｉａ ｅｔ ｅ ｅｆ ｃｓｏ ｐ ｘａ ｏ ｅｌ ｉｂ ｌ ｎ ｔ ｂ ｌｓ ｔ Ｍ ｅ ｈｏ ｔ ｄｓ ｉ ＡＣｓ ｗｅ ｅ Ｍ ｒ ｉｏａ ｅ ｙ ｃ ｍ ｂｎｅ ｃ ａ ｉａｌａ ｄ ｅ ｙ ｔｃ ｔｅ ｔ ｎｔ ｎｄ ｃ ｈｕ ｅ ｎ ｒ ｈ ｏ ｉ ｒｎ ｒ ｘａ Ｔ ｅｌ ｓ ｌｔｄ ｂ ｏ ｉ ｄ ｍｅ ｈ ｎ ｃ ｎ ｎｚ ｍａｉ ｒ ａｍｅ ｓ ａ ｕ ｒ ｄ ｕ ｄｅ ｙｐ ｘａ ｏ ｏ ｍｏ ｉ． ｈｅ ｃ ｌ
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・
‘ ７’ ３
基 础 论 著 ・
小 鼠未成熟关节 透 明软骨细胞 的培养 与生 物 学 特 征 研 究
任 步方 邓廉 夫 王君 朱雅 萍 魏立 周琦
【 摘要】 目的 建立小 鼠未成熟关节透明软骨细胞分离 、 培养 的方法 ， 探讨低氧环境对软骨细胞 活 性 及 糖 代谢 的影 响 。 方 法 机 械 分 离 与 酶 消 化相 结 合 ， 离 、 化小 鼠未 成 熟 关 节 软 骨 细 胞 。 别 分 纯 分
【 ｂｔ ｃ】 ｏｂｅｔ ｅ Ｔ ｓ ｂｉ ｅ ｔ ｄ ｒｍ ａ ｒ ｍ ｒ ｅ ｒｃｌｒ ｈｎｒｃｔ ｉ Ｃ ） Ａ ｓｒ ｔ ａ ｊｃｉ ｏｅｔ ｌ ｈ ｈ ｈ ｓ ｍ ｔ ｅ ｕｉ ｔ ｕａ ｃｏｄｏｙ ｓ（ ｖ ａ ｓ ｔ ｍｅ ｏ ｆ ｉ ｏ ｕ ｎａｉ ｅ ＭＡ ｓ