食品中肉毒梭菌的PCR检测方法
食品肉毒杆菌检测
食品中肉毒杆菌检测--科标检测肉毒杆菌是一种生长在缺氧环境下的致病菌，全称肉毒梭状杆菌，在罐头食品及密封腌渍食物中具有极强的生存能力，它在繁殖过程中所分泌的肉毒毒素具有极强的毒性，是KCN 毒性的一万倍。
纯化结晶的肉毒毒素1mg 能杀死2亿只小鼠，对人的致死剂量约0.1μg 。
它通过阻断人体神经接头，导致全身麻痹、瘫痪，严重时能引起人呼吸肌麻痹，导致无法呼吸，最终死亡。
目前报道新西兰恒天然浓缩乳清蛋白粉大批量被肉毒杆菌污染，目前报道新西兰恒天然浓缩乳清蛋白粉大批量被肉毒杆菌污染，多家产品被多家产品被卷入其中，科标化工分析检测中心为了我国奶粉质量安全，现开展食品中肉毒杆菌检测。
科标化工分析检测中心可依照ISO 、ASTM 、DIN 、GB 、SN 等标准完成食品、微生物、饲料、药品、纺织品、农业、高分子材料、生物产品、建筑材料以及微生物产品理化性能、力学性能、电气性能等测试。
电气性能等测试。
中心通过了中国国家认证认可监督管理委员会和中国合格中心通过了中国国家认证认可监督管理委员会和中国合格评定国家认可委员会的二合一（CMA 、CNAS ）实验室认证认可，能出具权威的第三方检测报告。
食品中肉毒杆菌检测(PCR 检测方法)一、实验原理科标化工分析检测中心结合国标GB/T4789.12-2003食品中卫生微生物学检验肉毒杆菌及内毒素检验和SN/T 2525-2010食品中肉毒杆菌的PCR 检测方法对食品中肉毒杆菌进行检验。
将样品经增菌后划平板分离单菌落，挑取可疑菌落到胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤(TPGY)培养基培养，培养基培养，对培养物用对培养物用DNA 提取试剂盒抽提DNA ，进行PCR 扩增，用琼脂糖凝胶电泳检验PCR 产物中是否含有肉毒杆菌的的特征条带，从而对食品中是否污染肉毒杆菌进行快速检测。
二、仪器和试剂Heraeus Multifuge X1R Bio-RAD 高速台式冷冻离心机，Bio-RADALS1296ALS1296ALS1296PCR PCR 仪器，Tanon-3500凝胶成像分析系统，YQX-Ⅱ厌氧培养箱，恒温水浴锅。
食品中致病菌的多重快速检测技术
食品中致病菌的多重快速检测技术食品安全一直是人们关注的重要问题，由于食品中常常存在着致病菌，给人们的健康带来了潜在的威胁。
因此，快速检测食品中的致病菌成为食品安全领域亟待解决的问题之一。
近年来，随着科技的不断进步，食品中致病菌的多重快速检测技术逐渐成为研究热点，并取得了令人瞩目的成果。
一、PCR技术的应用多重快速检测技术中的PCR技术是一种基于分子生物学原理的检测方法。
它是通过放大食品中的致病菌的DNA序列，并通过特定的荧光探针来检测致病菌的存在与否。
这种技术具有高灵敏度、高准确性和高特异性的特点，可以迅速、准确地检测到食品中的致病菌。
在PCR技术中，常用的目标基因有16S rRNA基因、23S rRNA基因等。
通过选择合适的引物和探针，可以选择性地检测目标致病菌。
例如，可以设计特异性引物和探针用于检测大肠杆菌、沙门氏菌等常见的致病菌。
此外，PCR技术还可以实现多种致病菌的同时检测，提高检测效率。
二、免疫技术的应用除了PCR技术，免疫技术也是常用的食品中致病菌快速检测方法之一。
免疫技术是通过检测食品中的致病菌抗原或特定的抗体来判断食品是否受到致病菌的污染。
常见的免疫技术有ELISA、荧光免疫分析等。
免疫技术具有灵敏度高、操作简便等优点，适用于大规模的食品快速检测。
例如，可以通过ELISA方法检测食品中的沙门氏菌，快速准确地判断食品是否受到沙门氏菌的污染。
三、基于质谱的快速检测技术基于质谱的快速检测技术是近年来迅速发展的一种食品中致病菌检测方法。
这种技术利用食品中致病菌的代谢产物或特定标记物质的质谱特征来进行快速检测。
例如，基于质谱的快速检测技术可以通过检测食品中的挥发性有机化合物来鉴定食品中的细菌。
通过对质谱数据的分析，可以快速准确地确定食品中是否存在致病菌。
此外，还有基于纳米材料技术的快速检测方法，利用纳米材料的特殊性质，通过检测特定的物质变化来判断食品中是否存在致病菌。
这种技术具有高灵敏度、快速性和简便性的特点，对提高食品安全具有重要意义。
食品安全监管的快速检测方法与技术
食品安全监管的快速检测方法与技术食品安全一直是社会关注的重要问题，保障民众的饮食安全是国家的首要任务之一。
随着科技的进步和技术手段的不断提升，食品安全监管部门采用了越来越多的快速检测方法与技术，以便更加及时、准确地发现和解决食品安全问题。
本文将探讨一些与食品安全监管相关的快速检测方法与技术。
第一部分：PCR技术在食品安全监管中的应用PCR(聚合酶链式反应)是一种常用的快速检测方法，它能够在短时间内扩增食品样本中微生物的DNA片段，从而实现对食品是否受到致病菌污染的快速检测。
例如，在肉类产品中，可能存在沙门氏菌、大肠杆菌等致病菌，利用PCR技术可以快速检测出是否存在这些菌种，从而确保肉类产品的安全性。
第二部分：光谱技术在食品安全监管中的应用光谱技术是一种常用的非侵入性检测方法，通过检测食品样品中的反射、透射或散射光谱，可以获取食品中的化学成分和品质信息。
例如，近红外光谱技术可以快速检测食品中的水分、蛋白质、脂肪等成分含量，红外光谱技术可以检测食品中的添加剂、污染物等。
这些光谱技术具有无损、快速、准确的特点，对于食品安全监管非常有帮助。
第三部分：快速检测仪器在食品安全监管中的应用随着仪器技术的不断发展，快速检测仪器在食品安全监管中得到了广泛应用。
例如，质谱仪是一种快速准确的检测仪器，可以检测食品中微量残留的农药、兽药等有害物质；电化学传感器可以检测食品中重金属离子的含量；生物传感器可以检测食品中的致病菌等。
这些快速检测仪器大大提高了食品安全监管的效率。
第四部分：基因编辑技术在食品安全监管中的应用基因编辑技术是一种新兴的技术手段，通过修改食品作物的基因组，可以提高其抗病虫害能力、减少化学农药的使用。
例如，利用CRISPR-Cas9技术，可以针对具有致病潜力的细菌或病毒在食品作物中进行基因编辑，从而提高其抗病能力。
这种技术可以在较短时间内实现对食品作物基因的修饰，从而提高食品安全。
结论：通过使用快速检测方法与技术，食品安全监管部门能够更加快速、准确地发现和解决食品安全问题。
生物在食品安全检测中的快速检测技术
生物在食品安全检测中的快速检测技术食品安全一直以来都是人们关注的重要问题。
随着科技的发展，人们对食品安全的要求也越来越高。
在食品安全检测中，生物技术为我们提供了一种快速且准确的检测方法。
本文将介绍几种常见的生物技术在食品安全检测中的应用。
一、PCR技术PCR(聚合酶链式反应)技术是一种常用的分子生物学技术，它可以通过扩增基因组DNA的特定片段，从而快速检测食品中的病原体。
例如，当我们怀疑某批肉类产品中存在沙门氏菌时，可以使用PCR技术对样本进行检测。
这种技术具有高度的敏感性和特异性，能够快速准确地检测出食品中的致病菌，以保障消费者的食品安全。
二、免疫分析技术免疫分析技术是利用抗体与抗原结合的原理进行检测的一种技术。
在食品安全检测中，常用的免疫分析技术有酶联免疫吸附检测法(ELISA)和免疫层析法。
这些技术能够快速、准确地检测食品中的残留农药、兽药、毒素等有害物质。
通过将食品样本与特异性的抗体结合，然后观察结合反应产生的信号变化，可以判断食品是否符合安全标准。
三、质谱技术质谱技术是一种高分辨率的分析技术，可以鉴定和测定分子的结构和组分。
在食品安全检测中，质谱技术可以被用于检测食品中的有毒物质，例如重金属、农药残留等。
通过将食品样品进行质谱分析，可以快速且精确地确定食品样品中是否存在有害物质，以确保食品的安全性。
四、快速检测试纸快速检测试纸是一种便捷的生物技术检测方法。
常见的快速检测试纸包括蛋白质快速检测试纸、细菌快速检测试纸等。
这些试纸具有简单易用、操作便捷等特点，可以用于毒素、细菌、蛋白质等有害物质的快速检测。
通过检测试纸上的颜色变化或显示结果，可以快速确定食品样品是否安全。
总结：生物技术在食品安全检测中发挥了重要的作用。
无论是PCR技术、免疫分析技术、质谱技术还是快速检测试纸，都具有快速、准确，且具有高灵敏度、高特异性等优点，能够有效地保障食品安全。
在未来，生物技术的发展将进一步提升食品安全检测的效能，为人们提供更加放心、安全的食品。
食品中肉毒梭菌的检验
案例：肉毒毒素的毒性极强，是最强的神经麻痹 毒素之一，据称，精致毒素1μg的毒力为200000小白 鼠（20g）致死量，也就是说，1g毒素能杀死400万t 小白鼠，一个人的致死量大概1μg左右。 危害：肉毒中毒是由于误食含有肉毒毒素的食 品而引起的食物中毒。人的肉毒中毒发生并不多，但 是发病急、病程发展快、病死率高。肉毒中毒是毒素 型中毒，潜伏期较短，一般为6~36h，最长60h。主 要症状有：视力减弱、全身无力、神社和张口困难、 抬头费力、瞳孔散大、呼吸麻痹等。重症患者，如果 不及时治疗和抗毒素特异治疗，多在2~4天死亡。 肉毒中毒一年四季均可发生，发病主要与饮食 习惯有着密切关系。
。
1 2
毒素检测：试验方法同肉毒毒素检测。 培养特性检查：接种卵黄琼脂平板，分成 2份， 。 分别在35 C的需氧和厌氧条件下培养48h，观 察生长情况及菌落形态。肉毒梭菌只有在厌氧 条件下才能在卵黄琼脂平板上生长并形成具有 上述特征的菌落，而在需氧条件下则不生长。
3、注意事项
（1）典型的肉毒中毒，小白鼠会在4~6h内死亡，而且 98%~99% 的小白鼠会在12h内死亡，因此，试验前 24h内的观察是非常重要的。 （2）24h后的死亡是可疑的，除非有典型的症状出现。 （3）如果小白鼠注射经1：2或1：5倍数稀释的样品后 死亡，但注射更高稀释度的样品后未死亡，这也 是非常可疑的现象，一般为非常特异性死亡。 （4）小白鼠要用不会抹去的颜料加以标记。
1
制胰酶激活处理液：领取一部分上清液，调pH6.2， 每9份加10%胰酶（活力 1：250）水溶液1份，混匀，经 。 常轻轻搅动，37 C作用60min，进行
2
肉毒毒素检测以小白鼠腹腔注射法为标准方法。
（2）检出实验 取上述离心上清液及其胰酶激活处理液分别注 射小白鼠2只，每只0.5mL，观察4天。注射液中若有 肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24h内发病、 死亡。主要症状为竖毛，四肢瘫软，呼吸困难，呼吸 呈风箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最终死于呼吸麻痹。
食品中致病菌PCR检测方法-O157
ICSSN 备案号：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布前 言SN/T XXXX－XXXX《食品中多种致病菌快速检测－PCR方法》分为十一个部分：─ 第 1 部分：食品中沙门氏菌检测方法；─ 第 2 部分：食品中志贺氏菌检测方法；─ 第 3 部分：食品中金黄色葡萄球菌检测方法；─ 第 4 部分：食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌检测方法；─ 第 5 部分：食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法；─ 第 6 部分：食品中空肠弯曲菌检测方法；─ 第 7 部分：食品中肠出血性大肠埃希氏菌 O157:H7检测方法；─ 第 8 部分：食品中副溶血性弧菌检测方法；─ 第 9 部分：食品中霍乱弧菌检测方法；─ 第 10 部分：食品中创伤弧菌检测方法；─ 第 11 部分：食品中阪崎肠杆菌BAX®全自动PCR检测方法。
本出血性大肠杆菌O157:H7检测方法PCR检测方法分为第一法（普通PCR方法）和第二法BAX®全自动致病菌PCR检测系统1）（简称：BAX® 系统）。
本标准的附录A是资料性附录。
本标准由国家认可监督管理委员会提出并归口。
本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。
本标准起草人：卢行安等。
本标准系首次发布的检验检疫行业标准。
1） 为美国杜邦公司（DuPont Qualicon）的产品。
食品中多种致病菌快速检测－PCR方法第7部分：食品中出血性大肠杆菌O157:H7检测方法1 范围本部分规定了用普通PCR技术快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的方法。
本部分适用于食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的检验。
2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
食品中的致病菌检测技术
食品中的致病菌检测技术食品安全一直是人们关注的焦点，而食品中的致病菌是造成食品安全问题的主要原因之一。
为了保障公众健康，科学家们开发了各种致病菌检测技术，以提高食品质量和安全性。
本文将介绍几种常见的食品中的致病菌检测技术。
一、PCR技术PCR（聚合酶链式反应）技术是一种常用的致病菌检测方法。
该方法可以通过扩增微生物基因组DNA的特定片段来检测和鉴定致病菌。
PCR技术具有高度的灵敏度和特异性，能够迅速准确地检测出食品中微生物的存在。
二、ELISA技术ELISA（酶联免疫吸附法）技术也是一种常见的致病菌检测方法。
该方法通过反应特定抗原和抗体来检测致病菌。
ELISA技术具有快速、高效、灵敏的特点，可以检测食品样品中的微量致病菌。
三、质谱技术质谱技术是一种高分辨率的致病菌检测方法。
该技术通过将样品中的化学物质进行分离、检测和鉴定，可以快速准确地检测出致病菌的存在。
质谱技术具有高精确度、高灵敏度和高通量的特点，可以同时检测多种致病菌。
四、基因测序技术基因测序技术是一种高级的致病菌检测方法。
该技术通过对致病菌基因组DNA进行测序，可以获取致病菌的完整基因信息。
基因测序技术具有高度的准确性和灵敏性，能够帮助科学家更好地了解致病菌的特性，为食品安全提供更全面的保障。
五、快速检测技术除了上述传统的致病菌检测技术外，科学家们还开发了很多快速检测技术。
这些技术利用光学、电子、磁性等物理和化学手段，能够在短时间内快速检测出食品中的致病菌。
快速检测技术具有操作简便、检测速度快的特点，为食品生产企业提供了实时监测的工具。
综上所述，食品中的致病菌检测技术是保障食品安全的重要手段。
通过PCR技术、ELISA技术、质谱技术、基因测序技术以及快速检测技术，我们能够更加准确、全面地检测出食品中的致病菌，从而确保公众的健康。
希望未来能够有更多的科学家致力于食品安全领域的研究，为我们的餐桌提供更加安全可靠的食品。
（1502字）。
化学技术在食品中致病菌检测中的应用方法
化学技术在食品中致病菌检测中的应用方法食品安全一直是人们关注的重点问题之一，食品中的致病菌问题更是直接关系到人们的健康和生命安全。
为了确保食品的安全性，化学技术在致病菌检测中扮演着重要的角色。
本文将介绍一些常用的化学技术在食品中致病菌检测中的应用方法。
第一种方法是聚合酶链式反应(PCR)技术的应用。
PCR技术通过扩增致病菌的DNA片段，从而快速、准确地检测致病菌的存在。
这种方法具有灵敏度高、特异性好和速度快的特点。
利用PCR技术可以迅速鉴定和检测食品中的多种致病菌，如大肠杆菌、沙门氏菌等。
此外，PCR技术还可以进行致病菌的分型和毒力因子的检测，从而更好地了解致病菌的传播途径和危害程度。
第二种方法是质谱技术的应用。
质谱技术通过测量物质的质荷比，可以快速、准确地鉴定和定量食品中的致病菌。
其中，质谱技术中的质谱仪是核心设备，可以对物质进行精确的分析和识别。
利用质谱技术可以检测到微量的致病菌，大幅提高了食品中致病菌的检测灵敏度。
第三种方法是荧光标记技术的应用。
荧光标记技术通过将特定的荧光染料标记在致病菌的表面，利用该荧光信号进行检测。
由于荧光方法具有高灵敏度和高特异性的特点，因此可以用于高效地检测食品中的致病菌。
此外，荧光标记技术还可以与其他检测方法相结合，如PCR技术、质谱技术等，进一步提高检测的准确性和可靠性。
除了上述的方法，化学技术在食品中致病菌检测中还有其他一些应用。
例如，表面增强拉曼光谱(SERS)技术可以通过表面增强效应，实现对致病菌的高灵敏度检测。
此外，纳米颗粒技术可以通过表面修饰的纳米颗粒与致病菌发生特异性相互作用，实现对致病菌的富集和检测。
这些新兴的化学技术在食品中致病菌检测中具有很高的潜力和应用前景。
总之，化学技术在食品中致病菌检测中具有重要的应用价值。
聚合酶链式反应、质谱技术、荧光标记技术等是常用的方法，可以实现对致病菌的高灵敏度、高特异性检测。
此外，新兴的化学技术如表面增强拉曼光谱技术、纳米颗粒技术等也在不断发展和应用中。
熟肉制品中微生物检验方法
熟肉制品中微生物检验方法
现代食品行业对于熟肉制品中微生物的检验方法非常重视。
这些检验方法包括总大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、霉菌以及乳酸菌等的检测。
首先，常用的总大肠菌群检测方法是利用大肠菌在培养基上的表现进行检验。
这种方法以萌发培养法为主，通过将样品在富营养培养基上进行孵育，借助特定条件下的微生物生长来观察和计数。
其次，沙门氏菌的检测方法非常关键，因为沙门氏菌是一类严重危害人体健康的致病菌。
目前常用的检测方法是PCR技术，即聚合酶链反应。
这种方法可以根据沙门氏菌的基因特征，通
过特定的引物和酶来扩增和检测沙门氏菌的DNA片段。
金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病菌，其检测方法主要有胶片酶法和荧光定量PCR法。
胶片酶法利用金黄色葡萄球菌的特性，在特定培养基上生长，并产生一种能在胶片中形成黄色颗粒的酶。
而荧光定量PCR法则可以精确测量金黄色葡萄球菌的数量，并对其进行快速检测。
另外，霉菌在熟肉制品中也是一个常见的污染源。
检测方法一般采用培养基培养法，将样品在特定培养基上进行孵育，通过观察并计数菌落来进行检测。
最后，乳酸菌的检测方法一般采用普通菌落计数法或分子生物学方法。
普通菌落计数法是一种传统的方法，通过将样品在富养分培养基上进行孵育，并通过观察和计数菌落来检测乳酸菌的数量。
而分子生物学方法则是利用PCR技术或核酸杂交等技术检测乳酸菌的种类和数量。
总的来说，熟肉制品中微生物的检验方法涵盖了多个方面，从特定菌群的培养、基因扩增到菌落计数等方法，以保障食品安全和质量。
肉类加工中的致病菌检测与控制
肉类加工中的致病菌检测与控制随着人们对食品安全的关注不断增加，肉类加工中的致病菌检测与控制显得尤为重要。
在肉类加工中，常见的致病菌包括沙门氏菌、大肠杆菌、李斯特菌等。
这些致病菌一旦进入人体，会引发多种食源性疾病，甚至危及生命。
因此，建立科学的检测与控制体系成为了保障食品安全的必要措施。
首先，对肉类加工过程中的致病菌进行检测，是确保食品安全的重要环节。
在生产过程中，通过对原材料、加工环境和成品进行定期检测，可以及早发现潜在的风险。
常见的检测手段包括PCR法、ELISA法和传统的培养法等。
其中，PCR法能够通过检测DNA序列，迅速准确地确定致病菌的存在。
而ELISA法则通过检测特定的蛋白质抗原来确定致病菌的存在。
传统的培养法则需要将样品进行培养，通过观察菌落形态和染色技术来确定致病菌的存在。
不同的检测方法各有优劣，可以根据实际情况选择合适的方法。
其次，加强肉类加工中的致病菌控制，是预防食源性疾病的关键。
首先，加强卫生管理，做好加工环境清洁和设备消毒工作。
保持加工车间的整洁，合理划分卫生区域和非卫生区域，严格控制人员、工具及原材料的进入卫生区域。
其次，加强员工培训，提高操作人员的卫生意识和操作技能。
加工过程中，操作人员要注意洗手、佩戴工作服、戴口罩等，减少交叉污染的风险。
此外，对生产设备和工具进行定期检查和维护，确保其卫生状况良好。
最后，严格控制温度和时间，将其作为控制致病菌的重要手段。
适当的温度和时间可以有效地抑制致病菌的生长和繁殖，保证食品的安全性。
除了加强检测和控制外，肉类加工企业还可以采取其他措施来提高食品安全。
例如，与合格的供应商建立长期稳定的合作关系，确保原材料的质量。
企业可以根据供应商的信誉和生产工艺等因素进行评估，选择合适的供应商。
此外，加强内部质量控制，建立健全的管理体系，对生产过程进行全面监控。
通过加强风险评估和风险管理，发现和解决潜在的问题，提升产品的质量和安全性。
综上所述，肉类加工中的致病菌检测与控制是确保食品安全的关键环节。
食品中肉毒杆菌快速检测方法研究
食品中肉毒杆菌快速检测方法研究肉毒杆菌是一种致命的细菌毒素，它可以导致肉毒中毒，严重的情况下甚至可以致命。
因此，在食品安全方面，对于肉毒杆菌的快速检测方法的研究变得尤为重要。
肉毒杆菌的检测一般需要复杂的过程和长时间的培养，然后用动物进行实验来确认是否存在毒素。
这种方法不仅费时费力，还需要很长时间来获得结果。
近年来，随着生物技术的发展，人们开始研究使用基于分子生物学的方法进行肉毒杆菌的快速检测。
这种方法利用了分子生物学技术中的PCR技术和DNA探针技术，使得检测的过程更加高效快速。
PCR技术是一种能够复制DNA片段的技术，通过放大目标DNA片段的数量，从而使得可以使用其他方法进行检测。
在肉毒杆菌的检测中，可以选择特定的DNA片段进行扩增，然后通过凝胶电泳等方法来进行确认。
这种方法不仅可以缩短检测的时间，还可以提高准确性。
与此同时，DNA探针技术也被广泛应用于肉毒杆菌的快速检测中。
该技术利用了肉毒杆菌特有的DNA序列，通过与目标DNA序列的杂交来进行检测。
这种方法不仅可以提高检测的灵敏度，还可以对不同的亚型进行区分。
除了基于分子生物学的方法，还有其他一些快速检测方法被研究出来，如免疫学方法和质谱法。
免疫学方法利用了抗体与肉毒杆菌毒素之间的特异性结合来进行检测，这种方法可以快速确定肉毒杆菌的存在。
质谱法则是利用了质谱仪对样品中的分子进行检测，可以准确地鉴定肉毒杆菌是否存在。
尽管肉毒杆菌快速检测方法的研究取得了很大的进展，但仍然存在一些挑战。
首先，标准化仍然是一个问题。
不同实验室使用的方法和技术可能会有所不同，导致检测结果的差异。
其次，检测方法的敏感性和特异性需要进一步提高，以确保准确性。
总体来说，肉毒杆菌的快速检测方法的研究对于食品安全至关重要。
基于分子生物学的方法、免疫学方法和质谱法等都为快速准确地检测肉毒杆菌提供了新的途径。
然而，仍然需要进一步的研究来解决标准化和特异性等问题。
随着技术的不断进步，相信在不久的将来，肉毒杆菌的快速检测方法将会有更大的突破，并且为食品安全领域带来更多的保障。
肉制品中致病菌的检测与荧光定量PCR方法
肉制品中致病菌的检测与荧光定量PCR方法作者：来源：《食品安全导刊》2017年第02期检测肉制品中的致病菌是保障肉制品质量安全、防止食源性疾病爆发的有效手段。
PCR技术作为一种同时检测多种病原菌的技术，是检测肉制品中致病菌的重要手段。
此次主题由刘磊老师对肉制品致病菌的各种知识和荧光定量PCR方法进行讲解。
食源性致病菌及其危害食源性疾病是指食品中致病因素进入人体引起的感染性、中毒性等疾病，包括食物中毒。
据不完全统计，约66%的食源性疾病由食源性微生物引起。
据WHO（世界卫生组织）估计，全球每年有数十亿人发生食源性疾病，每年美国大约有7600万人患食源性疾病。
微生物种类主要分为两类，其一为致腐性微生物，如蜡样芽孢杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、微球菌、真菌等，其二是致病性微生物，如李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌、链球菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌小肠结肠炎耶尔森菌在人们的日常生活中，肉制品是人体中微生物的一大重要来源。
肉制品中的微生物的主要有三方面来源——动物本身由于疾病或者创伤感染引入；屠宰、分割过程中引入的（水、肠道、呼吸道、工具、操作人员、空气，鼠类及蝇虫等）；制作过程中由配料带入。
致病菌限量标准及GB检测方法我国关于致病菌的限量标准以国家标准（GB）为主，主要包括GB 4789（检测方法）、GB 29921（致病菌限量标准）、产品标准、卫生规范GB 14811和接触材料标准。
除此之外，还有相关的行业标准（SN）、农业部标准（NY）和地方标准（DB）。
肉制品中的国家标准详见表1，肉制品中致病菌的相应标准如表2所示。
食源性致病菌检测方法及其选择使用图1以沙门氏菌为例，解释了食源性致病菌的大致检测流程。
食源性致病菌的检测方法大致可分为三类，即培养法、免疫法、PCR。
培养法是致病菌检测行业的金标准，但是比较繁琐，并且检测周期长，同时要求新鲜样本；免疫法同样是行业金标准，但是检测结果存在人为差异；使用PCR方法具有非特异性干扰的特点，并且检测灵敏度很高。
出口食品中主要产毒真菌检验方法
出口食品中主要产毒真菌检验方法出口食品中主要产毒真菌检验方法，是对食品中潜在产毒真菌的检测和识别，是合格食品生产过程检测环节的重要内容。
一般可采用培养瓶试验、生物多态参数技术（Biolog）和PCR方法来确定可能产毒或具有毒力作用的真菌。
（一）、培养瓶试验培养瓶试验是常用的检出真菌的方法，其主要流程是离心悬液、萃取、分离、培养、鉴定等步骤。
离心悬液过程中，可通过调节溶剂的酸碱度，和选择不同抗酒精等不同的培养基，来限制已知或不可知会产毒真菌的生长，以提高检测效果。
然后，在培养瓶中培养、分离和鉴定，以确定试样中是否含有可能产毒的真菌，具体步骤如下：1. 获取培养基：从市场或生产厂家购买中毒食物中主要潜在产毒真菌的培养基，例如常用的培养基有肉汁拉希德（L-R），拉希德汤（LR），Czapek-Dox，以及胡罗木斯（Lec）等。
2. 在培养瓶中培养：将培养基灌入培养瓶，将食品样品加入瓶内，加热无菌房中瓶口，并登记培养基情况，使单菌株剥离和萌发，然后在适当温度和湿度下，培养24-48小时，使菌落萌发后活化，反映真菌情况。
3. 分离筛选：将菌落取下，用清洗液（0.1%乳酸钠乳或胡罗木斯，一般为80%酒精）擦拭瓶内，对每组分离的真菌进行挑选，将记录分离的真菌的菌种和数量。
4. 鉴定：使用生物多态参数技术（Biolog）、分子生物学技术（PCR）或其他鉴定技术，对分离的菌进行检测，记录筛选的菌株具有毒力或不具有毒力的污染物。
（二）、生物多态参数技术（Biolog）生物多态参数技术（Biolog）是利用多孔玻璃片进行检测和辨认真菌类属的一种新技术，它能够通过测定真菌菌株对不同抗原的反应，来评价真菌的毒性和强度。
1. 使用多孔玻璃片：取液体样品，将其倒入多孔玻璃片上，使其落在玻璃片上并完整地充满玻璃片上所有多孔者，形成一个真菌抗原库，然后在质谱仪（Mass spectrometer）上测定。
2. 鉴定：将培养基样品和抗原库混合，发现培养基存在可能产毒真菌，然后根据生物多态参数技术（Biolog）系统，结合多孔玻璃片上生长的抗原，记录在玻璃片上的生长特征，以识别可能存在的真菌类属和活性。
食品中致病菌的快速检测方法研究
食品中致病菌的快速检测方法研究随着人们对食品安全的关注不断增加，食品行业的质量控制问题成为社会关注的焦点。
其中，食品中致病菌的检测问题至关重要。
传统的致病菌检测方法通常耗时长、操作繁琐，这使得快速、准确地检测致病菌成为食品安全领域研究的重点。
近年来，随着生物技术和分子生物学的迅猛发展，一些新的快速检测方法应运而生。
其中，PCR（聚合酶链式反应）技术被广泛应用于食品中致病菌的研究和检测。
PCR技术通过扩增致病菌所特有的基因序列，可以在短时间内对食品样本中的致病菌进行检测，并且具有高度的准确性和敏感性。
目前，PCR技术在食品检测领域已经建立了一系列标准化的方法，可以广泛应用于不同类型食品的致病菌检测。
另一种快速检测致病菌的方法是基于免疫学原理的技术，如酶联免疫吸附法（ELISA）和免疫荧光法（IFA）。
这些方法通过检测致病菌特异性抗体与目标菌种之间的结合反应，来实现对食品样本中致病菌的快速检测。
这些方法具有操作简便、结果易读等优势，但同时也有一定的局限性，比如无法区分活菌和死菌，以及对样本处理要求较严格等。
同时，在致病菌快速检测方法研究中，纳米材料技术也逐渐走进了人们的视野。
纳米材料具有较大的比表面积和独特的物理化学性质，这使得其在食品中致病菌检测中具有广泛的应用前景。
例如，金纳米颗粒可以通过与致病菌特异性抗体的结合来产生可见的颜色变化，从而实现快速检测。
此外，纳米材料还可以用于电化学传感器的制备，通过检测电流或电压的变化来快速检测食品样品中的致病菌。
除了上述方法外，还有一些新的技术和方法正在被探索和开发。
例如，近年来，基于人工智能算法的快速致病菌检测方法逐渐兴起。
这些方法通过对致病菌的图像进行分析和识别，可以快速、准确地检测食品样品中的致病菌。
人工智能算法的发展使得这一领域具有了更大的潜力和可能性。
总的来说，食品中致病菌的快速检测方法研究一直是食品安全领域的热点。
传统的方法逐渐被一些新兴技术所取代，这些新技术具有快速、准确、简便等优势，有望在实际应用中发挥更大的作用。
肉制品中致病菌的检测与荧光定量PCR方法
食安大讲堂Tlogy科技68 食品安全导刊 2017年1~2月检测肉制品中的致病菌是保障肉制品质量安全、防止食源性疾病爆发的有效手段。
PCR 技术作为一种同时检测多种病原菌的技术，是检测肉制品中致病菌的重要手段。
此次主题由刘磊老师对肉制品致病菌的各种知识和荧光定量PCR 方法进行讲解。
食源性致病菌及其危害食源性疾病是指食品中致病因素进入人体引起的感染性、中毒性等疾病，包括食物中毒。
据不完全统计，约66%的食源性疾病由食源性微生物引起。
据WHO （世界卫生组织）估计，全球每年有数十亿人发生食源性疾病，每年美国大约有7600万人患食源性疾病。
微生物种类主要分为两类，其一为致腐性微生物，如蜡样芽孢杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、微球菌、真菌等，其二是致病性微生物，如李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌、链球菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌小肠结肠炎耶尔森菌在人们的日常生活中，肉制品是人体中微生物的一大重要来源。
肉制品中的微生物的主要有三方面来源—动物本身由于疾病或者创伤感染引入；屠宰、分割过程中引入的（水、肉制品中致病菌的检测与荧光定量PCR 方法Copyright©博看网 . All Rights Reserved.食安大讲堂Jan~Feb 2017 CHINA FOOD SAFETY 69肠道、呼吸道、工具、操作人员、空气，鼠类及蝇虫等）；制作过程中由配料带入。
致病菌限量标准及GB 检测方法我国关于致病菌的限量标准以国家标准（GB）为主，主要包括GB 4789（检测方法）、GB 29921（致病菌限量标准）、产品标准、卫生规范GB 14811和接触材料标准。
除此之外，还有相关的行业标准（SN）、农业部标准（NY）和地方标准（DB）。
肉制品中的国家标准详见表1，肉制品中致病菌的相应标准如表2所示。
一步增菌。
第二，检测项目：例如，致泻性大肠杆菌适宜采用PCR 方法检验，金葡肠毒素则适合采用免疫方法检测。
荧光定量聚合酶链反应检测乳品中肉毒梭菌
荧光定量聚合酶链反应检测乳品中肉毒梭菌孙丽华;王云霞;杜晓华;李翠枝;刘丽君;邵建波【摘要】通过实时荧光定量聚合酶链反应方法检测乳粉与乳清粉中的A、B、E、F 四型肉毒梭菌,对肉毒梭菌荧光定量聚合酶链反应试剂盒中的阳性对照品及10、102、103、104倍梯度稀释的阳性对照品做出AB混合型和EF混合型的标准曲线,循环域值具有极好的特异性、重复性和准确性.对通过国标方法与中华人民共和国出入境检验检疫行业标准方法检测长出疑似菌落的82份乳粉与乳清粉采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测,均检测不到样品中含A、B、E、F四型肉毒梭菌.【期刊名称】《乳业科学与技术》【年(卷),期】2013(036)006【总页数】3页(P24-26)【关键词】肉毒梭菌;荧光定量聚合酶链反应;肉毒毒素【作者】孙丽华;王云霞;杜晓华;李翠枝;刘丽君;邵建波【作者单位】内蒙古伊利实业集团股份有限公司,内蒙古呼和浩特 010110;内蒙古伊利实业集团股份有限公司,内蒙古呼和浩特 010110;内蒙古伊利实业集团股份有限公司,内蒙古呼和浩特 010110;内蒙古伊利实业集团股份有限公司,内蒙古呼和浩特 010110;内蒙古伊利实业集团股份有限公司,内蒙古呼和浩特 010110;内蒙古伊利实业集团股份有限公司,内蒙古呼和浩特 010110【正文语种】中文【中图分类】TS252.7肉毒梭菌主要可引起食物中毒，属单纯性毒性中毒，并非细菌感染。
临床表现与其他食物中毒不同，胃肠症状很少见，主要表现为某些部位的肌肉麻痹，重者可死于呼吸困难与衰竭[1-4]。
肉毒梭菌还可以引起婴儿肉毒病，一岁以下婴儿肠道内缺乏拮抗肉毒梭菌的正常菌群，可因食用被肉毒梭菌芽胞污染的食品后，芽胞在盲肠部位定居，繁殖后产生毒素，引起中毒[5-10]。
实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)技术是近几年发展起来的一种核酸定量检测技术，RT-PCR以其快速简便、定量和防污染等优点很快被应用[11-14]，使用RTPCR检测食品中的肉毒梭菌是快速可行的方法[15-18]。
食品中肉毒梭菌的PCR检测方法
食品中肉毒梭菌的ＰＣＲ检测方法科标检测1、范围本标准适用于食品中Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌的检测。
青岛科标检测研究院通过了山东省质量技术监督局（CMA）和中国合格评定国家认可委员会（CNAS）认证认可，是权威的第三方检测机构。
旗下科标生物实验室在微生物检测领域拥有丰富的经验，可以针对食品、医药、化妆品、农产品、一次性产品以及工业产品等进行微生物检测以及产品微生物污染分析，为客户提供快速、高效、权威的第三方微生物检测服务，保证产品质量安全，专业得到了国内、国际知名企业的广泛认可。
可以按照各种标准提供微生物检测服务。
2、规范性引用文件ＧＢ／Ｔ４７８９．１２食品卫生微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验ＧＢ／Ｔ６６８２分析试验室用水规格和实验方法ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求ＧＢ／Ｔ２７４０３实验室质量控制规范食品分子生物学检测ＳＮ／Ｔ１１９３基因检验实验室技术要求3、术语、定义和略缩语3.1肉毒梭菌肉毒梭菌为梭菌科梭菌属革兰氏阳性芽孢杆菌，厌氧，在适宜的培养基及特定的环境条件下产生一类具有很强毒性的神经麻痹毒素，即肉毒毒素。
3.2聚合酶链式反应模板ＤＮＡ先经高温变性成为单链，在ＤＮＡ聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板ＤＮＡ两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在ＤＮＡ聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸（ｄＮＴＰ）为底物，使退火引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使位于两段已知序列之间的ＤＮＡ片段呈几何倍数扩增。
3.3缩略语Bp 碱基对DNA 脱氧核糖核酸dNTP 脱氧核苷三磷酸dATP 脱氧腺苷三磷酸dCTP 脱氧胞苷三磷酸dGTP 脱氧鸟苷三磷酸dTTP 脱氧胸苷三磷酸Taq 水生栖热菌Tris 三（羟甲基）氨基甲烷EDTA 乙二胺四乙酸4、生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测肉毒梭菌，所有培养物和废弃物应小心处置，并按照ＧＢ１９４８９和ＧＢ／Ｔ２７４０３中的有关规定执行。
肉毒梭菌及肉毒毒素检验 标准文本(食品安全国家标准)
食品安全国家标准食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验1 范围本标准规定了食品中肉毒梭菌（Clostridium botulinum）及肉毒毒素（botulinum Toxin）的检验方法。
本标准适用于食品中肉毒梭菌及肉毒毒素的检验。
2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a）冰箱：2℃～5℃、-20℃;b）天平：感量0.1g;c）无菌手术剪、镊子、试剂勺；d）均质器或无菌乳钵；e）离心机：3000 rpm、14000 rpmf）厌氧培养装置；g）恒温培养箱：35℃±1℃、28℃±1℃；h）恒温水浴箱：37℃±1℃、60℃±1℃、80℃±1℃；i）显微镜：10倍×100倍j）PCR仪；k）电泳仪或毛细管电泳仪；l）凝胶成像系统或紫外检测仪；m）核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计；n）可调微量移液器：0.2µL～2µL、2µL～20µL、20µL～200µL、100µL～1000µL；o）无菌吸管：1.0mL、10.0 mL、25 .0mL；p）无菌锥形瓶：100 mL；q）培养皿：直径90mm；r）离心管：50mL、1.5mL；s）PCR反应管；t）无菌注射器：1.0mL；u）小鼠：15g～20g，每一批次试验应使用同一品系的KM或ICR小鼠。
3 培养基和试剂除另有规定外，PCR试验所用试剂为分析纯或符合生化试剂标准，水应符合GB/T6682中一级水的规格。
3.1 庖肉培养基：见附录A中A.1。
3.2 胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉汤（TPGYT）：见附录A中A.2。
3.3 卵黄琼脂培养基：见附录A中A.3。
3.4 明胶磷酸盐缓冲液：见附录A中A.4。
3.5 革兰氏染色液：见附录A中A.5。
3.6 10%胰蛋白酶溶液：见附录A中A.6。
a型肉毒毒素 检验 标准
a型肉毒毒素检验标准A型肉毒毒素检验标准肉毒杆菌是一种产生毒素的细菌，它分为不同的类型，其中A型肉毒毒素是最常见和最具毒性的类型之一。
A型肉毒毒素检验是一种常规的检测方法，用于确定食物样品或临床样本中是否存在A型肉毒毒素，并确定其含量。
以下将介绍A型肉毒毒素检验的标准和方法。
1. 标本采集和处理：- 食物样品：从疑似受污染的食物中取样，并在无菌条件下将样品放入密封容器中，保持在4摄氏度以下。
- 临床样本：临床样本通常包括血清，呕吐物，粪便等。
采集样本后，应保持冷藏并尽快送到实验室进行检验。
2. 实验室测试：- 谷胱甘肽还原酶（GSHR）抑制试验：这是一种常用的鉴定A型肉毒毒素的方法。
样品中的肉毒毒素会抑制谷胱甘肽还原酶的活性。
首先，将样品稀释后与含有谷胱甘肽还原酶的试剂混合，在一定温度下反应一段时间后，通过检测还原酶的活性来判断样品中是否存在肉毒素。
这种方法可以对含有A型肉毒毒素的样品进行初步筛检。
- 生物学试验：使用小鼠或大鼠进行生物学试验也是一种常规的肉毒毒素检验方法。
将样品注射到动物中，观察注射部位和全身症状，判断是否受到肉毒毒素的影响。
这种方法可以用来评估样品中肉毒毒素的毒性程度，但受到动物福利和伦理规范的限制，使用需慎重。
- 分子诊断：PCR（聚合酶链反应）和实时荧光PCR是最常用的分子诊断方法。
通过检测样品中与A型肉毒杆菌基因相关的特定序列，确定样品是否受到A型肉毒毒素的污染。
这种方法具有高度的灵敏度和特异性，并且可以准确定量A型肉毒毒素的含量。
3. A型肉毒毒素检验标准：- 食品安全标准：各国针对食品中A型肉毒毒素的含量制定了相应的标准。
例如，欧洲食品安全局（EFSA）建议食物中的A型肉毒毒素浓度不得超过1 ng/g。
在美国，食品和药物管理局（FDA）规定了A型肉毒毒素的上限为0.5 ng/g。
- 临床检测标准：临床实验室通常会根据患者的临床症状和病史来确定A型肉毒毒素的存在和水平。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
食品中肉毒梭菌的ＰＣＲ检测方法科标检测1、范围本标准适用于食品中Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌的检测。
青岛科标检测研究院通过了山东省质量技术监督局（CMA）和中国合格评定国家认可委员会（CNAS）认证认可，是权威的第三方检测机构。
旗下科标生物实验室在微生物检测领域拥有丰富的经验，可以针对食品、医药、化妆品、农产品、一次性产品以及工业产品等进行微生物检测以及产品微生物污染分析，为客户提供快速、高效、权威的第三方微生物检测服务，保证产品质量安全，专业得到了国内、国际知名企业的广泛认可。
可以按照各种标准提供微生物检测服务。
2、规范性引用文件ＧＢ／Ｔ４７８９．１２食品卫生微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验ＧＢ／Ｔ６６８２分析试验室用水规格和实验方法ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求ＧＢ／Ｔ２７４０３实验室质量控制规范食品分子生物学检测ＳＮ／Ｔ１１９３基因检验实验室技术要求3、术语、定义和略缩语3.1肉毒梭菌肉毒梭菌为梭菌科梭菌属革兰氏阳性芽孢杆菌，厌氧，在适宜的培养基及特定的环境条件下产生一类具有很强毒性的神经麻痹毒素，即肉毒毒素。
3.2聚合酶链式反应模板ＤＮＡ先经高温变性成为单链，在ＤＮＡ聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板ＤＮＡ两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在ＤＮＡ聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸（ｄＮＴＰ）为底物，使退火引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使位于两段已知序列之间的ＤＮＡ片段呈几何倍数扩增。
3.3缩略语Bp 碱基对DNA 脱氧核糖核酸dNTP 脱氧核苷三磷酸dATP 脱氧腺苷三磷酸dCTP 脱氧胞苷三磷酸dGTP 脱氧鸟苷三磷酸dTTP 脱氧胸苷三磷酸Taq 水生栖热菌Tris 三（羟甲基）氨基甲烷EDTA 乙二胺四乙酸4、生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测肉毒梭菌，所有培养物和废弃物应小心处置，并按照ＧＢ１９４８９和ＧＢ／Ｔ２７４０３中的有关规定执行。
5、防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照ＳＮ／Ｔ１１９３中的规定执行。
6、方法提要样品经增菌后划平板分离单菌落，挑取可疑菌落到ＴＰＧＹ培养，对培养物采用热裂解抽提ＤＮＡ法，或商品化细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒抽提ＤＮＡ法制备ＰＣＲ模板，进行ＰＣＲ扩增，琼脂糖凝胶电泳检验ＰＣＲ产物是否有特征条带，从而对食品中是否污染肉毒梭菌进行快速检验。
7、设备和材料7.1天平：感量０．００１ｇ。
7.2生物安全柜。
7.3厌氧培养装置。
7.4恒温培养箱：３５℃±１℃和２８℃±１℃。
7.5高压灭菌锅。
7.6恒温水浴：３７℃±１℃和６０℃±１℃。
7.7速台式冷冻离心机：１４０００ｇ。
7.8冰箱：－２０℃和－７０℃。
7.9ＰＣＲ仪。
7.10电泳仪。
7.11凝胶成像分析系统。
7.12紫外分光光度计。
7.13微量可调移液器：０．２μＬ～２μＬ、２μＬ～２０μＬ、２０μＬ～２００μＬ、１００μＬ～１０００μＬ。
7.14离心管：１．５ｍＬ。
7.15ＰＣＲ反应管：２００μＬ～５００μＬ。
8、培养基和试剂除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。
8.1庖肉培养基8.2胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤（ＴＰＧＹ）8.3厌氧卵黄琼脂8.4无水乙醇和９５％乙醇8.5ＰＢＳ缓冲液：氯化钠７．６５０ｇ／Ｌ、磷酸氢二钠０．７２４ｇ／Ｌ、磷酸二氢钾０．２１０ｇ／Ｌ（ｐＨ７．４）8.6ＴＥ缓冲液：１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）8.7蛋白酶Ｋ溶液：用ＴＥ配制，使用浓度为１０ｍｇ／ｍＬ8.8溶菌酶溶液：用ＴＥ配制，使用浓度为１０ｍｇ／ｍＬ8.9３ｍｏｌ／Ｌ乙酸钠溶液（ｐＨ５．２）8.10２０％ＳＤＳ溶液8.11引物：根据附录Ｂ中表Ｂ．１的序列合成引物，加超纯水配制成１００μｍｏｌ／Ｌ储液，用于ＰＣＲ测试的引物浓度为１０μｍｏｌ／Ｌ。
8.12TaqＤＮＡ聚合酶8.13ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。
8.14琼脂糖：电泳级8.15溴化乙锭8.16ＤＮＡ分子量标准8.17阳性对照：含有扩增片段的质粒或Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌的基因组ＤＮＡ8.18商品化细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒8.19１０×ＰＣＲ缓冲液：２００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．４）、２００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾、１５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁。
8.20５×ＴＢＥ电泳缓冲液：Ｔｒｉｓ５４ｇ、硼酸２７．５ｇ、０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２０ｍＬ，加蒸馏水至１０００ｍＬ，使用时稀释为０．５×ＴＢＥ电泳缓冲液8.21６×加样缓冲液：３０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，３６％（体积分数）甘油，０．０５％（质量浓度）二甲苯腈蓝ＦＦ，０．０５％（质量浓度）溴酚蓝9、检验程序检验程序见图１10、检验步骤10.1样品制备和增菌培养接种前，先将增菌培养基煮沸１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ，以排除溶解于培养基中的氧，并迅速冷却，切勿摇动。
每１５ｍＬ增菌肉汤中接种１ｇ～２ｇ固体食品或１ｍＬ～２ｍＬ液体食品，接种时将接种物慢慢接入肉汤液面以下。
每份样品接种两管庖肉培养基，置３５℃±１℃，同时接种两管ＴＰＧＹ培养基，置２８℃±１℃，厌氧培养５ｄ。
检查培养物的浊度、产气、肉粒的消化和产生的气味。
若有生长，按１０．２分离纯培养物。
若未见生长，则继续培养１０ｄ。
10.2分离纯培养物取１ｍＬ～２ｍＬ培养液置于螺旋帽试管中，加入等量过滤除菌的无水乙醇。
混匀，在室温下放置１ｈ。
或８０℃加热１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ以破坏其繁殖体。
用接种环取１环～２环经乙醇或加热处理的培养物在厌氧卵黄琼脂上划线接种，置厌氧条件下３５℃±１℃培养４８ｈ。
挑取约１０个单个的典型菌落。
肉毒梭菌的菌落为隆起或扁平，光滑或粗糙，容易蔓延生长并有不规则边缘。
在卵黄培养基上用斜射光检查时，菌落表面通常呈虹彩样，亦称为珠色层。
彩带通常向外延伸，继而菌落产生不规则外形。
接种可疑菌落到ＴＰＧＹ培养基中，置３５℃±１℃厌氧培养２４ｈ。
10.3模板ＤＮＡ的制备以下两种方法任选一种进行。
剩余培养液置４℃保存，以备确证试验使用。
10.3.1热裂解抽提ＤＮＡ法取１．４ｍＬＴＰＧＹ培养物转移至１．５ｍＬ离心管中，１４０００ｇ离心２ｍｉｎ，弃去上清液。
加入１．０ｍＬＰＢＳ悬浮菌体沉淀，１４０００ｇ离心２ｍｉｎ，去上清。
用４００μＬＰＢＳ重悬沉淀，加入１０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶溶液１００μＬ，３７℃±１℃水浴１５ｍｉｎ，期间每５ｍｉｎ～７ｍｉｎ颠倒混匀离心管。
加入１０ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ溶液１０μＬ，６０℃±１℃水浴１ｈ，期间每１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ颠倒混匀离心管。
沸水浴１０ｍｉｎ，１４０００g离心２ｍｉｎ，上清液转移至新的灭菌小离心管中。
加入３ｍｏｌ／ＬＮａＡｃ溶液５０μＬ和９５％乙醇１．０ｍＬ，颠倒混匀，－７０℃或－２０℃放置３０ｍｉｎ，１４０００ｇ１０ｍｉｎ，弃去上清，沉淀干燥后溶于２００μＬＴＥ溶液。
按１０．４进行纯度和浓度测定后置于－２０℃保存。
10.3.2试剂盒抽提ＤＮＡ法取１．４ｍＬＴＰＧＹ培养物转移至１．５ｍＬ离心管中，１４０００ｇ离心２ｍｉｎ，弃去上清液。
菌体沉淀用１．０ｍＬＴＥ缓冲液洗两次后重悬于１２０μＬ的２５％蔗糖溶液中。
加入１０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶溶液１２０μＬ，混匀，３７℃±１℃水浴３０ｍｉｎ；然后加入２０％ＳＤＳ溶液３０μＬ，轻轻混匀，室温放置５ｍｉｎ；再加入１０ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ溶液９．０μＬ，混匀后３７℃±１℃水浴３０ｍｉｎ。
悬浮液采用商品化细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒提取ＤＮＡ，使用时按照试剂盒说明书进行操作。
提取的ＤＮＡ按１０．４进行纯度和浓度测定后置于－２０℃保存。
10.4核酸纯度和浓度的测定取适量ＤＮＡ溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处的吸收值。
ＤＮＡ的浓度按照式（１）计算。
C＝Ａ260×Ｎ×５０……………………（１）式中：C——ＤＮＡ浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；Ａ260——２６０ｎｍ处的吸光值；Ｎ——核酸稀释倍数。
当浓度为０．３４μｇ／ｍＬ～３４０μｇ／ｍＬ，Ａ260／Ａ280比值在１．７～１．９之间时，适宜于ＰＣＲ扩增。
10.5ＰＣＲ扩增10.5.1采用分别针对Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌肉毒毒素基因设计的型特异性引物，进行多个ＰＣＲ扩增，每个ＰＣＲ反应管检测一种类型的肉毒梭菌。
10.5.2ＰＣＲ反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当的调整。
10.5.3ＰＣＲ检测时反应体系应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。
用含有扩增片段的质粒或Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌的基因组ＤＮＡ作阳性对照，用非肉毒梭菌基因组ＤＮＡ作阴性对照，用无菌水作空白对照。
10.6凝胶电泳检测ＰＣＲ产物用０．５×ＴＢＥ缓冲液制备１．２％～１．５％（质量浓度）的琼脂糖凝胶（凝胶加热融化后冷却至６０℃左右加入溴化乙锭至０．５μｇ／ｍＬ，或者在电泳后用０．５μｇ／ｍＬ溴化乙锭溶液进行染色），将１０μＬ的ＰＣＲ产物与２．０μＬ６×加样缓冲液混合，点样，其中一孔加入ＤＮＡ分子量标准，以判断ＰＣＲ产物的片段大小。
０．５×ＴＢＥ电泳缓冲液，１０Ｖ／ｃｍ恒压电泳，电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定，电泳检测结果用凝胶成像系统记录。
11、ＰＣＲ结果判定阴性对照和空白对照均未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，待测样品出现预期大小的扩增条带，判定为ＰＣＲ结果阳性，按第１２章进行确证试验；待测样品未出现预期大小的扩增条带，判定ＰＣＲ结果为阴性，按第１３章直接报告结果。
实验中设置的阴性对照、空白对照和阳性对照ＰＣＲ检测结果应符合上述情况。
否则，任一种对照如果出现非上述正常结果，应重做实验。
12、确证试验取１０．３剩余培养液，按ＧＢ／Ｔ４７８９．１２规定的方法进行确证试验。
13、结果报告ＰＣＲ结果阴性，直接报告“未检出Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌”。
确证试验结果为检出肉毒梭菌，则报告“检出某型（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型）肉毒梭菌”。
确证试验结果为未检出肉毒梭菌，则报告“未检出Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌”。
附录 A（规范性附录）培养基和试剂的配制A.1 庖肉培养基A.1.1成分新鲜牛肉５００．０ｇ蛋白胨３０．０ｇ酵母浸膏５．０ｇ磷酸二氢钠５．０ｇ葡萄糖３．０ｇ可溶性淀粉２．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬA.1.2制法将新鲜除脂肪和筋膜的牛肉５００ｇ切碎，加入蒸馏水。