中华按蚊对菊酯类杀虫剂的抗性及kdr突变

基金项目： 国家科技重大专项子课题（ 编号： 2012ZX10004219 ） 。 作者简介： 谭伟龙（ 1973 － ） ， 男， 湖南汩罗市人， 副主任医师， 主要从事消毒与媒介生物防治研究工作 。 E － mail： zhaotongyan@ 263． com 通讯作者： 赵彤言， ． 中华卫生杀虫药械， 2015 ， 21 引用格式： 谭伟龙， 朱长强， 艾乐乐， 等． 中华按蚊对菊酯类杀虫剂的抗性及 kdr 突变［J］
Abstract ： Objective Province． Methods
To understand the pyrethroid insecticides resistance level and mutations in the para type sodiAn． sinensis adult mosquitoes were collected in primarily milk cowsheds and pigsties of coun-
um channel gene that confers kdr in Anopheles sinensis from malaria endemic areas along the Hongze Lake in Jiangsu tryside Jiangsu Province from August to September in 2012 － 2013． The insecticide resistance bioassays were performed on adult mosquitoes by using the pesticide impregnated mesh WireBalls assay． MultiplePCＲ method was used to distinguish the mosquito species and genotyping the kdr mutations． Ｒesults All the mosquitoes collected in the five counties were An． sinensis． The average KT50 s of the three pyrethroid insecticides were 16. 92 min to permethrin， 16. 53 min to beta cypermethrin and 22. 98 min to deltamethrin in the five population respectively． The Ｒ / S values were 4. 61 ， 5. 45 ， 4. 60 which suggested that the five populations were resistant to the insecticides． There were two kinds of substitutions （ L1014C and L1014f ） and seven genotypes （ TTG / TTG， TTG / TTT， TTG / TTC， TTG / TTG， TTT / TTT， TTT / TTC， TGT / TGT） in the para sodium channel based on the multiplePCＲ method． The mutation frequencies of 1014F and 1014C were 72% － 87% and 12% － 21% respectively． Conclusion The mosquito population from the five regions around the Hongze Lake all develope resistance to the tested insecticides． High genotyping
摘要： 目的 了解江苏省洪泽湖地区疟疾媒介中华按蚊对菊酯类杀虫剂的抗性状况及钠离子通道部分位点 沿洪泽湖周边采集淮安 、 洪泽、 泗洪、 盱眙、 泗阳等地区中华按蚊成 突变情况。方法 2012 － 2013 年 8 － 9 月， 蚊样本， 圆球法检测击倒中时间（ KT50 ） 。多重 PCＲ 法检测钠离子通道 1014 位点 kdr 基因突变情况。结果 5 个地区采集的按蚊均为中华按蚊， 中华按蚊成蚊对氯菊酯 、 高效氯氰菊酯、 溴氰菊酯 3 种杀虫剂的平均 KT50 16. 53 、 22. 98 min， 5. 45 和 4. 60 ， 分别为 16. 92 、 抗性倍数为 4. 61 、 均为抗性种群。部分 kdr 基因发生突变， 存在 L1014C 和 L1014F 两种突变类型， 7 种基因型（ TTG / TTG， TTG / TTT， TTG / TTC， TTG / TTG， TTT / TTT， TTT / TTC， TGT / TGT） 主要突变类型为 TTT （ 或 TTC ） ， 突变频率为 72% ～ 87% ， 其次为 TGT 突变 12% ～ 21% ， 敏感的 TTG 较少。结论 治理。 关键词： 中华按蚊； 拟除虫菊酯类杀虫剂； 击倒抗性； kdr 基因突变 + 2781 （ 2015 ） 04033404 中图分类号： Ｒ384． 1 ； S481 ． 4 文献标识码： A 文章编号： 1671该地区中华按蚊对 3 种菊酯类杀虫剂产生一定的抗性， 钠离子通道 kdr 基因 L1014 位点出 现高频率的突变， 突变类型主要为 TTT 和 TGT， 提示该地区中华按蚊成蚊防治需根据抗性监测结果加强抗性
疟疾是由疟原虫寄生于人体而引起的传染性疾 病， 也是一种影响社会经济发展的重要虫媒传染病 ， 虽然我国绝大部分地区疟疾疫情得到有效遏制 ， 但 是在江苏的洪泽湖地区， 驻地部队每年还会有非输 ［1 － 2 ］ ， 入性疟疾病例报告 个别地区还会出现疟疾疫 情回升的势头。按蚊作为疟疾传播的媒介， 是影响 疟疾流行的重要因素。以菊酯类杀虫剂室内滞留喷 洒（ IＲS） 和浸泡蚊帐为主的成蚊控制措施依然是控 ［3 ］ 制疟疾的最重要手段之一 。 随着蚊虫对杀虫剂 抗性的产生与发展， 有的地方甚至到了防治失效的 ［4 ］ 程度 。成蚊对菊酯类杀虫剂抗性的分子机制是 靶标位点的神经细胞膜钠离子通道产生击倒抗性基 ［5 ， 6 ］ 。 将这 因（ kdr） 突变， 这种突变是稳定可遗传的 种突变作为研究蚊虫抗性的分子标记物， 用于击倒 ［7 ］ 抗性的快速监测， 简便、 稳定而且可靠 。 为确切了解江苏省疟疾病例较突出的洪泽湖地 区中华按蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性现状及抗性 基因突变情况， 以洪泽湖周边的 5 个区县作为实验 捕获中华按蚊进行菊酯类杀虫剂敏感性测定 现场， 以及抗药性相关生化分子检测分析 ， 结果报道如下。 1 材料与方法
溴氰菊酯购买于江苏华南化工研究所。 KOD plus Taq 高保真酶 （ TOYOTO ） ； Pyrobest DNA Polymerase， dNTP， DNA Marker DL2000 购自大连宝 Polymerase， 生物公司； TaKaＲa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2. 0 ， 购自 TaKaＲa 公司； ＲNase H （ ＲNA 酶 H ） 购 其他 自 TaKaＲa 公司； 其他试剂均为国产分析纯级， 10 × PCＲ 试剂均为国产分析纯级。TaqDNA 聚合酶、 Buffer （ without Mg2 + ： 100 mM Tris － HCl pH 8. 8 at 0. 8% （ v / v ） Nonidet ） ； Mg2 + （ 25 25℃ ； 500 mM Kcl， mM） 、 dNTP （ 10 mM ） 、 Marker、 6 × DNA Loading Dye （ 北京生工） ； 5 × TBE （ 445mM Tris 碱， 445 mM 硼酸 10mM EDTA， pH8． 0 ） 。 盐，
图1
中华按蚊采样点% 氯菊酯、 95%
1． 3 引物合成和 DNA 测序 蚊种形态鉴定采用陆 ［8 ］ 宝麟主编 的《新 版 蚊 科 形 态 鉴 定 》 和 根 据 文 献 ［9 ］ ITS2 与 28S rDNA 区域设计的引物 进行种群分子 鉴定， 所用引物为： 上游引物 UP： 5' － CCATGACGTACACAACTTG － 3' ； 中华按蚊下游引物 PS： （ 5' － GTTGTCCAGCCCGCTAACAT － 3' ） ， 425 bp； 嗜人按 蚊 下 游 引 物 PA： （ 5' － GCTCCA TCTACACACA GCGT － 3' ） ， 253 bp。钠离子通道 kdr 检测引物根据 + para 中华按蚊 型 Na 通道击倒抗性基因 SII4 － SII6 片段 的 序 列 设 计 （ 上 游 引 物 P1 ： 5' － TGATCGTGTTTCGCGTGCTG － 3' ； 下 游 引 物 P2 ： 5' － GAGCGATGATGATCCGAAAT － 3' ） ， P3 ： 5' TGCGGTGGTAATTGGAAACTGT 3' ， P4 ： 5' aagg CCCGGTGGTAATTGGAAACTTG 3' ， P5 ： 5' TGCGGTGGTAATTGGAAACTTC 3' ， P6 ： 5' aaggttgg TGCGGTGGTAATTGGAAACTTT 3' （ 图 2 － A） 。引物合成由上海生工生 物基因公司完成。 1． 4 抗药性生物测定 采用 WHO 推荐的圆球法 ［10 ］ 。 圆球直径 13 测定成蚊雌蚊击倒中时间 （ KT50 ） cm， 测定按蚊 11 只， 观察第 6 只被击倒时间， 实验 至少重复 3 次， 同时设立空白对照组， 计算击倒率。 后将蚊虫移入恢复筒中以 10% 葡萄糖水恢复饲养
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中华卫生杀虫药械 2015 年 8 月第 21 卷第 4 期
Chin J Hyg Insect ＆ Equip Aug 2015 Vol. 21 No. 4
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frequencies of kdr mutations exist in the five populations． Ｒesistance management should be introduced in these regions． Key words： An． sinensis； pyrethroid insecticide； knockdown resistance； kdr substitution
表1 编号 采集地点 中华按蚊种群现场采样点的分布 地理坐标 采集时间 2013 年 7 月 2013 年 7 月
1 江苏泗洪县 33°13'18''N， 118°10'75''E 2 江苏泗阳县 33o72'18''N， 118°68'75''E
3 江苏盱眙县 33°01' 18''N， 118°28' 54''E 2012 年 8 月 4 江苏淮安县 33°62'63''N， 119°48'90''E 5 江苏洪泽县 33°03'36''N， 118°18'26''E 2012 年 8 月 2013 年 8 月
1． 1 试虫 2012 － 2013 年 8 、 9 月， 在江苏省洪泽 湖周边地区的洪泽、 泗阳、 泗洪、 淮安等 5 个区县， 每 个区县选取 1 个乡（ 镇） 作为采集点（ 图 1 ） 。采集生 牛棚和人居房屋为主， 白天电动吸蚊器人 境以猪圈、 工捕获方法采集按蚊成蚊 （ 表 1 ） 。 成蚊检测 KT50 值， 然后放置于相对稳定温度 （ 26 ± 1 ） ℃ 、 相对湿度 （ 80 ± 5 ） % 、 光照 12 h / d 的条件下饲养， 观察死亡 24 h 后取部分成蚊腹部用于种群分子鉴定， 率， 头 kdr 。 部用于 检测 实验室敏感中华按蚊为军事医学 科学院流行病学研究所昆虫饲养室驯化饲养多代的 敏感品系。
成蚊对菊酯类杀虫剂抗性的分子机制是靶标位点的神经细胞膜钠离子通道产生击倒抗性基因kdr突变这种突变是稳定可遗传的56种突变作为研究蚊虫抗性的分子标记物用于击倒抗性的快速监测简便稳定而且可靠为确切了解江苏省疟疾病例较突出的洪泽湖地区中华按蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性现状及抗性基因突变情况以洪泽湖周边的5个区县作为实验现场捕获中华按蚊进行菊酯类杀虫剂敏感性测定以及抗药性相关生化分子检测分析结果报道如下
Pyrethroid resistance and kdr mutations in Anopheles sinensis
2 TAN Weilong1， ， ZHU Changqiang1 ， AI Lele1 ， HAN Zhaojiu1 ， JIANG Zhikuan1 ， ZHAO Tongyan2 （ 1 ． Center of Disease Prevention and Control of Nanjing Command， Nanjing 210002 ， China； 2 ． Academy of Military Medical Science， Beijing 100071 ， China）
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中华卫生杀虫药械 2015 年 8 月第 21 卷第 4 期
Chin J Hyg Insect ＆ Equip Aug 2015 Vol. 21 No. 4
【 论著 】
·药械研究·
中华按蚊对菊酯类杀虫剂的抗性及 kdr 突变
1， 2 1 1 1 1 2 谭伟龙 ， 朱长强 ， 艾乐乐 ， 韩招久 ， 姜志宽 ， 赵彤言 （ 1． 南京军区疾病预防控制中心 ， 江苏 南京 210002 ； 2． 军事医学科学院， 北京 100071 ）