大黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴定

⼤黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴定
⼤黄中游离蒽醌类成分的提取、分离与鉴定
⼀、实验⽬的
1.掌握蒽醌苷元的提取⽅法--双相酸⽔减法
2.掌握梯度PH萃取法提取分离⼤黄中各种蒽醌苷元的原理及操作⽅法
3.掌握羟基蒽醌类化合物的颜⾊反应及薄层⾊谱鉴别⽅法
⼆、实验原理
1.提取原理
双向酸⽔解法，为⼀相与酸⽔不相互溶的有机溶剂，另⼀相为酸⽔，加热回流⽔解的⽅法。

由于⼤黄中的羟基蒽醌类化合物多以苷的形式存在，所以⾸先要将苷⽔解成苷元，本实验选⽤硫酸和⼄酸⼄酯作为双向酸⽔解的溶剂，采⽤加热回流⽅法，提取⼤黄药材中的游离蒽醌类化合物。

根据苷元不溶于⽔，可溶于⼄醚、⼄酸⼄酯等亲脂性有机溶剂的性质，即在加热回流提取过程中，稀硫酸可将蒽醌苷元⽔解成苷元，游离出来的蒽醌苷元随即溶于⼄酸⼄酯中，从⽽将蒽醌苷元提取出来。

2.分离原理
pH梯度萃取法羟基蒽醌类化合物酸性强弱不同，⽤pH梯度法进⾏分离。

具有羧基或多个β位酚羟基的蒽醌可溶于5%碳酸氢钠溶液；具有⼀个β位酚羟基的蒽醌可溶于5%碳酸钠溶液；只具有α位酚羟基的蒽醌，酸性弱，只溶于氢氧化钠溶液。

以分离酸度不同的蒽醌苷元。

也可利⽤游离蒽醌的极性不同，采⽤硅胶柱⾊谱法进⾏分离。

（1）⼤黄中游离蒽醌的酸性强弱顺序⼤黄酸（-COOH）＞⼤黄素（β酚-OH）＞芦荟⼤黄素（醇-OH）＞⼤黄素甲醚（-OCH3）≈⼤黄酚（-CH3）
（2）⼤黄中游离蒽醌的极性⼤⼩顺序⼤黄酸＞⼤黄素＞芦荟⼤黄素＞⼤黄素甲醚＞⼤黄酚
⼤黄酚和⼤黄素甲醚酸性相近，但极性不同，可⽤硅胶柱⾊谱法进⾏分离。

三、实验⽅法
四、 1.总蒽醌苷元的提取、分离⼯艺流程
⼤黄药材（粗粉）50g
⼄酸⼄酯提取液药渣去除下层酸⽔层，再⽤蒸馏⽔⽔洗2次（50ml/次）
直⾄⼄酸⼄酯层pH值呈中性
⼄酸⼄酯提取液
碱⽔层⼄酸⼄酯层
滴加浓盐酸，调节pH=2，放置 5%Na2CO3溶液萃取三次（40ml/次）
沉淀物（黄⾊结晶或
黄⾊絮状沉淀）碱⽔层
沉淀过滤，冰醋酸精制滴加浓盐酸，调节溶液萃黄⾊结晶（⼤黄酸）沉淀物（橙⾊结晶或40ml/次）
橙⾊絮状沉淀）
沉淀过滤，碱⽔层
丙酮精制
橙⾊结晶（⼤黄素）节pH=2
沉淀物
（橙⾊絮状沉淀）黄⾊沉淀物⼄酸⼄酯层
沉淀过滤，⼄酸⼄酯精制硅胶柱⾊谱
黄⾊针晶洗脱剂为⽯油醚（60-90℃）
（芦荟⼤黄素）-⼄酸⼄酯（15：1）
⼤黄酚和⼤黄素甲醚混合物2.总蒽醌苷元的提取
⼤黄粗粉50g，置500ml烧瓶中，加20%硫酸溶液100ml和⼄酸⼄酯250ml，⽔浴回流提取2h，放置，冷后过滤，残渣弃去，⼄酸⼄酯提取液置分液漏⽃中，分出酸⽔层，⼄酸⼄
酯提取液⽤蒸馏⽔洗2次（20ml/次），将⼄酸⼄酯放置在锥形瓶中，密封。

3.游离蒽醌的分离和精制
（1）将⼄酸⼄酯提取液置500ml分液漏⽃中，⽤5%NaHCO3溶液萃取三次（80ml，60ml，40ml），合并碱液，在搅拌下滴加浓盐酸，调节pH=2，放置，待沉淀析出完全后，过滤，并⽤少量⽔洗沉淀物⾄洗出液呈中性，60℃⼲燥，得深褐⾊粉末，主为⼤黄素。

沉淀⼲燥后，样品加冰醋酸10ml加热溶解，趁热过滤，滤液放置析晶，过滤，⽤少量冰醋酸淋洗结晶，得黄⾊针晶为⼤黄酸。

（2）⼤黄素的分离和精制
经NaHCO3 溶液提取的⼄酸⼄酯液，继⽤5%NaHCO3 萃取三次，每次⽤量40ml，合并酸碱，在搅拌下滴加浓盐酸，调节pH=2，析出棕黄⾊沉淀，抽滤，⽔洗沉淀物⾄洗出液呈中性，60℃⼲燥，沉淀经⼲燥后，⽤15ml丙酮热熔，趁热过滤，滤液静置，析出橙⾊针晶，过滤后，⽤少量丙酮淋洗结晶，得⼤黄素。

（3）芦荟⼤黄素的分离和精制
经Na2CO3提取过的⼄酸⼄酯液，再⽤0.25%NaOH溶液提取三次，每次⽤量40ml，合并后的碱液同（1）法处理。

萃取液经酸化后析出黄⾊沉淀，过滤，⽔洗⾄中性，⼲燥，⽤10ml ⼄酸⼄酯精制，得黄⾊针晶的芦荟⼤黄素。

（4）⼤黄素甲醚和⼤黄酚混合物的分离和精制
萃取除去芦荟⼤黄素后余下的⼄酸⼄酯层，再⽤5%NaOH溶液萃取多次（每次100ml），⾄碱⽔液呈⽆⾊为⽌，合并碱⽔层，加盐酸⾄呈酸性（pH2~3），析出黄⾊沉淀，过滤，⽔洗⾄中性，⼲燥，为⼤黄酚和⼤黄素甲醚的混合物。

将此混合物溶于⼄酸⼄酯，⽤硅胶柱⾊谱分离。

（5）柱层析分离⼤黄酚和⼤黄素甲醚
●装柱取⼀玻璃层析柱，垂直固定在铁架台上，在管的下端垫⼊少量棉花，装⼊100~200
⽬硅胶（约1/3⾼，湿法装柱）。

●上样将样品置于⼩蒸发⽫中，⽤少量⽯油醚分散，另加⽤3倍量硅胶拌和均匀，并于
⽔浴上缓缓蒸去溶剂。

然后将含有样品的硅胶装⼊⾊谱柱的上端，并盖⼀圆形滤纸。

●洗脱将⾊谱柱活塞打开，洗脱剂为⽯油醚（沸程60-90℃）-⼄酸⼄酯（15:1）混合
液。

●收集洗脱液25ml⼀份，分别收集，回收溶剂⾄⼩体积，放置，即可析出结晶，合并
相同晶形部分。

先洗脱下的化合物为⼤黄酚，后洗脱下的化合物为⼤黄素甲醚。

4.游离蒽醌类化合物的鉴定
（1）化学鉴定
①碱液试验分别取各蒽醌结晶少许置于⼩试管中，加1ml⼄醇溶液，加10%氢氧化钠溶液数滴，观察颜⾊变化。

羟基蒽醌应显橙⾊到蓝紫⾊。

②醋酸镁试验分别取各蒽醌结晶少许置于⼩试管中，各加⼄醇1ml使溶解，滴加0.5%醋酸镁⼄醇溶液，观察颜⾊变化，羟基蒽醌应显橙⾊到
蓝紫⾊。

（2）⾊谱鉴定
①薄层⾊谱鉴定
吸附剂：硅胶G-CMC-Na板
样品：上述分别获得的⼤黄酸、⼤黄素、芦荟⼤黄素、⼤黄素甲醚和⼤黄酚的三氯甲烷溶液及各相应对照品的三氯甲烷溶液。

展开剂：⽯油醚-⼄酸⼄酯-醋酸（2:1:0.2）
展开⽅式：上⾏展开。

显⾊：在可见光下观察，记录黄⾊斑点出现的位置，然后⽤浓氨⽔熏成或喷5%醋酸镁甲醇溶液，斑点显红⾊。

实验结果记录：观察斑点颜⾊，记录图谱并计算Rf值。

四．数据记录、结果讨论与分析：
1.实验现象
加5% NaHCO3溶液萃取后，收集下层溶液，⼀天后未发现结晶，使⽤旋转蒸发仪蒸发后，最终得到黄⾊絮状⼤黄酸沉淀。

加5% Na2CO3溶液萃取后，最终得到橙⾊⼤黄素结晶。

加0.25% NaOH溶液萃取后，精制最终得到黄⾊芦荟⼤黄素结晶。

加5% NaOH溶液萃取后，得到黄⾊的⼤黄酚和⼤黄素甲醚混合物，⽆法调节pH值分开，故使⽤柱层析分离。

（1）碱液试验：取各类蒽醌的标准⼄醇溶液，滴加10% NaOH后。

⼤黄酸呈红⾊，⼤黄素呈粉红⾊，芦荟⼤黄素呈红⾊，⼤黄酚呈红⾊。

（2）醋酸镁试验：取各类蒽醌的标准⼄醇溶液，滴加0.5%的醋酸镁溶液后，⼤黄酸呈红⾊，⼤黄素呈粉红⾊，芦荟⼤黄素呈橘黄⾊，⼤黄酚呈橘黄⾊。

（3）薄层板鉴定
点样次序为：1.2.3.4依次为柱层析洗脱液，5为⼤黄酚标准液，6为⼤黄酸标准液，7为⼤黄酸⾃制，8为⼤黄素标准液，9为⼤黄素⾃制，10为芦荟⼤黄素标准液，11为芦荟⼤黄素⾃制，12为⼤黄素甲醚标准液。

测得Rf 值：
⼤黄酸：标准液的Rf 值为2.75/6.6=0.42，我组制得产物的数据缺失，图上⽆明显斑点⼤黄素：标准液的Rf 值为4.21/6.6=0.64,我组制得产物的Rf 值为5.8/6.6=0.88
芦荟⼤黄素：标准液的Rf 值为3.95/6.6=0.60,我组制得产物的Rf 值为4.81/6.6=0.73 ⼤黄酚标准液的Rf 值为5.65/6.6=0.86,⼤黄素甲醚标准液的Rf 值为5.7/6.6=0.86
柱层析洗脱液1.2.3.4的Rf 值依次为6.05/6.6=0.92; 5.9/6.6=0.89; 5.8/6.6=0.88;
5.71/
6.6=0.87
2.结果讨论
加5% NaHCO 3溶液萃取后，收集下层溶液，⼀天后未发现结晶，可能与之前加的NaCl 溶液
过多，使收集的液体体积过⼤，⼤黄酸浓度过低引起，使⽤旋转蒸发仪蒸发后，最终得到黄⾊絮状⼤黄酸沉淀。

蒽醌类与醋酸镁显⾊反应的必要条件是蒽醌化合物中有α-酚羟基或邻⼆酚羟基结构。

3.分析
（1）游离蒽醌的提取要控制温度，回流不宜太剧烈。

要注意碱液浓度及萃取时的静置时间对实验结果的影响。

（2）
A⼤黄酸R1=H R2=COOH
B⼤黄素R1=CH3 R2=OH
C芦荟⼤黄素R1=CH2OH R2=H
D⼤黄素甲醚R1=CH3 R2=OCH3
E⼤黄酚R1=CH3 R2=H
酸性：A>B>C>E≈D
本实验采⽤了 pH梯度萃取法，其原理是由于溶剂系统pH变化⽽改变了它们的存在状态（游离型或解离型），从⽽改变了他们在溶剂系统中的分配系数。

由于各羟基蒽醌结构上的不同所表现的酸性不同，⽤pH梯度萃取法分离他们；⼤黄酚和⼤黄素甲醚酸性相近，利⽤其极性的
差异，⽤柱⾊谱分离之。