3种黄酮对脂肪肝细胞氧化应激的影响_谢丽阳

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD)被认为是除酒精外的其他因素引起的一种肝脏疾 病，表现为在病人的肝脏细胞内有大量的甘油三酯 (triglyceride，TG)积累。普遍认为 NAFLD 的形成符合 “二次打击”假说[ 1 ]：“第一次”打击为 T G 在肝脏细 胞 内 的 堆 积 ， 即 单 纯 性 脂 肪 肝 ；“ 第 二 次 ” 打 击 为 多 种因素诱导的脂肪肝炎、肝脏纤维化和肝硬化的形成。 氧化应激被认为是引发“第一次”打击到“第二次” 打击转变的主要因素[ 2 ] 。
收稿日期：2011-03-29 作者简介：谢丽阳(1985 —)，女，硕士研究生，主要从事功能食品研究。E-mail：liyangxie@ * 通信作者：籍保平(1958 —)，男，教授，硕士，主要从事功能食品研究。E-mail：baopingji@
※营养卫生
食品科学
Effect of Foodborne Flavonoids on Oxidative Stress in HepG 2 Cells
XIE Li-yang1，ZHANG Di1，WU Wei2，JI Bao-ping1,*，ZHAO Lei3，SU Chun-yuan1 (1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China ； 2. College of Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；3. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)
2011, Vol. 32, No. 17 345
线粒体功能，导致细胞氧化应激水平的变化，促进肝 脏细胞发生病变。
黄酮是一类具有抗氧化和生物活性的植物化学性物 质，广泛分布于水果、蔬菜和全谷类食物中，其抗氧 化能力被认为与疾病风险的降低有关[9-10]。但是黄酮对 脂肪肝的缓解效果，特别是对缓解脂肪肝氧化应激状态 的相关研究明显不足。研究发现，具有抗脂肪肝形成 和预防 NAFLD 进一步恶化的物质通常具有抗氧化的作 用，Cai 等[9]发现燕麦的乙酸乙酯提取组分具有最高的总 酚含量、最强的 DPPH 自由基清除能力和抗油酸(oleic acid，OA)诱导的脂肪肝形成能力，并鉴定出其中的主 要成分是蒽酰胺(avenanthramides)；此外，VC 和 VE 等 一些常见的具有抗氧化能力的功能成分，也被认为是优 秀的脂肪肝预防治疗物质[11-13]。
1.3.7 功能成分抗氧化能力的测定 将损伤剂处理过的细胞用含有不同浓度的功能物质
标准品的不完全培养基在 37℃条件下培养 3h，确保功能 成分完全进入细胞后，按 1.3.5 节方法进行 ROS 测定。
1.3.6 TG 的检测 将细胞接种于 24 孔板中，培养 24h 后，加样培养
24h，去除培养液，用 PB S 缓冲液小心洗两遍，加入 RIPA 裂解液，充分裂解后，3000r/min 离心 3～5min， 取上清液，用 TG 试剂盒测定 TG 含量、BCA 试剂盒测 定细胞总蛋白含量，结果以 nmol/mg pro 表示。
XDOS-1B 倒置显微镜 重庆光电有限公司；SWCJ-2FD 双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司； MCO-20AIC 二氧化碳培养箱 日本 Sanyo 公司；MD SpectraMax 荧光酶标仪 美国 Molecular Devices 公司。 1.3 方法
1.3.1 HepG2 细胞的培养 HepG2 细胞培养于 DMEM 完全培养基(含 10%FBS，
100U/mL 青霉素和 100μg/mL 链霉素)，置于 37℃、5%CO2 饱和湿度的培养箱中培养。取对数生长期的细胞，以 6 × 104 个 /mL 的密度接于 96 孔板，每孔 200μL 细胞悬 液。待 24h 后细胞单层贴壁。随后用不同浓度 OA 损伤，
同时设立不加损伤剂的空白对照组，每组设置 6 个平行 样本。培养箱中分别培养 2 4h 后，分别测定细胞存活 率，LDH 释放量以及 ROS 生成量。
1.3.2 MTT 法测定细胞存活率 小心移出 96孔板中的培养液，每孔加入 20μL 5mg/mL
MTT 培养液，180μL 无酚红不完全 DMEM 培养基。37℃ 继续培养，4h 后终止培养，吸弃孔内的上清液，每孔 加入 150μL DMSO，振荡 5min 使紫色结晶物充分溶解。 在酶标仪上 490nm 波长处测定各孔的 OD 值。以细胞接 板 24h 后，未加脂肪酸处理时的细胞存活率为 0h 时细胞 存活率。根据式(1 )计算细胞相对存活率。
100083；
摘 要：目的：评价表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素、柚皮素 3 种食源性黄酮对降低脂肪肝细胞模 型中氧化应激水平的作用。方法：采用油酸诱导的 HepG2 细胞建立脂肪肝模型，根据细胞存活率、乳酸脱氢酶 (LDH)释放量和活性氧产生量反映细胞损伤程度及氧化应激状态，通过黄酮物质处理后的脂肪肝细胞模型活性氧减 少量评价其缓解脂肪肝氧化应激状态的功效。结果：EGCG 的抗氧化能力优于表儿茶素，两种物质的抗氧化能力 随浓度增加而增强，呈量效关系。柚皮素的抗氧化作用最弱，10 0μmol /L 柚皮素具有促氧化作用。 关键词：黄酮；H e p G 2 细胞；活性氧基团；脂肪肝
assessed based on ROS reduction after treatment with each flavonoid. Results: EGCG had better antioxidant effect than (-)-
epicatechin and their antioxidant effects were both increased in a dose-dependent fashion. Naringenin revealed the weakest
antioxidant effect and was an oxidation promoter at the concentration of 100μmol/L.
Key words：flavonoids；HepG2；ROS；fatty 文献标识码：A
文章编号：1002-6630(2011)17-0344-05
344 2011, Vol. 32, No. 17
食品科学
※营养卫生
3 种黄酮对脂肪肝细胞氧化应激的影响
谢丽阳 1，张 迪 1，吴 薇 2，籍保平 1,* ，赵 磊 3，苏春元 1
(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.中国农业大学工学院，北京 3.北京工商大学 食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048)
脂肪肝中发生的氧化应激的可能机制是当游离脂肪 酸(fatty acid，FA)和甘油三酯(triglyceride，TG)过多堆
积在肝脏细胞内时，线粒体的负担加重，β氧化增强， 产生大量的乙酰 -CoA，乙酰 -CoA 参与三羧酸循环，诱 导还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide reduced form，NADH)和还原型黄素腺嘌呤二 核苷酸(flavin adenine dinucleotide reduced form，FADH2) 的形成，以及促使电子传递链上传递的电子增多，造 成更多的电子漏，最终产生活性氧簇(reactive oxygen s p e c i e s ，R O S ) [3 -4 ]。随后的实 验 证 明 ， 脂 肪 肝 病 人 的 肝 脏 组 织 中 线 粒 体 出 现 异 常 [ 5 ] ， 呼 吸 链 复 合 体活性下 降[6]，线粒体 DNA 降解[7]和编码线粒体 DNA 的聚合酶 表达下降[8]等现象。这表明，FA 和 TG 确实是通过影响
1.3.4 细胞蛋白含量测定 取细胞培养液上清，用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒
测定上清中的总蛋白含量。
1.3.5 细胞内 ROS 测定 将样品处理过的细胞用含有 25μmol/L 的 2’,7’- 二
氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)的 HBSS(Hank, s Balanced Salt Solution)在 37℃条件下培养 30min。用 PBS 缓冲液 清洗两次，之后加入 200μL 的 HBSS。用酶标仪测定 96 孔板中单层细胞在发射光 535nm 波长处的荧光值，激发 光波长为 490nm。荧光值以零时刻阳性对照(以 OA 培养 的细胞) 的百分比表示。
Abstract ：Objective: To evaluate the effects of three foodborne flavonoids including (-)-epicatechin, naringenin and (-)-
epigallocatechin gallate (EGCG) on reducing oxidative stress in HepG2 cells. Methods: Oleic acid (OA) was used to induce a
本实验以HepG2细胞(一种常用于模拟人正常肝脏细 胞的细胞株系)为对象[14-15]。采用 OA 诱导细胞产生脂肪 变性和氧化应激(油酸诱导 HepG2 细胞建立的脂肪肝模型 有诸多报道，这种模型通常用于功能成分筛选和代谢机 理的研究中[9,16-17]。)，以 ROS 水平为评价指标，研究表 儿茶素、柚皮素和表没食子儿茶素没食子酸酯 (epigallocatechin gallate，EGCG)3 种物质对 HepG2 细 胞氧化应激的缓解作用。以期为相关功能食品的开发 提供参考。