转录组实战讲解第三讲之测序质量评估和reads回贴PPT课件

2021/7/24
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这一堂课 关注内容
Fusions Junctions
测序数据
测序评估及 低质量过滤
和参考基因 组比对
转录本重构
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编码基因表 达注释
编码基因差 异(特异)表达
GO功能显著 Pathway显著
性富集
性富集
功能富集网 络图
Genome Browser 可视化
长非编码鉴 定
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• 长非编码RNA测序介绍 • 一个测序实例 • 长非编码RNA分析流程 • 步骤一详解：Reads质量评估 • 步骤二详解：基因组比对 • 附录：运行命令
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长非编码RNA测序
• 长非编码RNAs（long non-coding RNAs， lncRNAs）是一类长度大于200 nt且不编码 蛋白质的RNAs
hg19为基因组的bowtie2的index文件
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运行命令汇总(三)
3, 比对转录组：
bowtie –o bwt_outdir_N refgene -1 N_R1.fastq -2 N_R2.fastq -S N.sam
bowtie –o bwt_outdir _P refgene -1 P_R1.fastq -2 P_R2.fastq -S P.sam
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和参考基因组比对
• 转录组比对工具选择：
– Tophat
Mapping and discovering splicing junctions with RNA-seq
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几种常见比对工具对比
Total Failed by Bowtie Failed by Bowtie2 Failed by BWA Failed by Tophat
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运行命令汇总(二)
2, 比对基因组：
tophat –o tophat_outdir_N --library-type fr-firststrand --fusion-search hg19 N_R1.fastq N_R2.fastq
tophat –o tophat outdir _P --library-type fr-firststrand --fusion-search hg19 P_R1.fastq P_R2.fastq
Quality Score与错误率：
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测序质量评估
• 工具
• fastQC（推荐） • fastX-Tookit
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注意adpter或是barcode的存在
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• 长非编码RNA测序介绍 • 一个测序实例 • 长非编码RNA分析流程 • 步骤一详解：Reads质量评估 • 步骤二详解：基因组比对 • 附录：运行命令
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• 长非编码RNA测序介绍 • 一个测序实例 • 长非编码RNA分析流程 • 步骤一详解：Reads质量评估 • 步骤二详解：基因组比对 • 附录：运行命令
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转录组分析的通用套路
鉴定
有多少RNA
定量
RNA的表达量
差异
功能
结构、表达量、 比例的变化
功能注释
N_R2.fastq
@HWI-EAS724_0001:8:32:374:374#0/2 TACCGTTAATAGCAGTAATATCATAATAGTAATAGCATCATAACGGTAGTCCCATAAAAGTGTGTCAGTAGTAGTAGTA +HWI-EAS724_0001:8:32:374:374#0/2 ggggfgggggd_adcggggeggfggeggegf`geececdegggggfegcfegggegggfgac[aced`bd__\_c[[Yb
– /
• Tophat-fusion
– /
• Fastqc
– /project s/fastqc/
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一个测序实例
• 取样：晚期肝癌病人的肝组织(共4个)
– 癌旁组织(N) – 原发灶(P) – 转移灶(M) – 门脉血栓转移灶(V)
一组时间序列上的4个点的取样
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RNA提取和测序参数
• RNA提取
– 提取带有polyA的所有RNA
• 测序
– Illu_outdir_M --library-type fr-firststrand --fusion-search hg19 M_R1.fastq M_R2.fastq
tophat –o tophat_outdir_V --library-type fr-firststrand --fusion-search hg19 V_R1.fastq V_R2.fastq
microRNAs，piRNAs 和lncRNAs等）
• 转录组内的RNA, 按polyA形态：
– 带polyA的RNA (mRNA和大部分的lncRNA) – 不带polyA的RNA (小RNA和小部分的lncRNA)
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长非编码RNA测序
方案一 总的RNA(>200)
方案二 总的RNA(>200)
长非编码表 达注释
长非编码差 异表达
GO功能显著 性富集
功能富集网 络图
Pathway显著 性富集
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• 长非编码RNA测序介绍 • 一个测序实例 • 长非编码RNA分析流程 • 步骤一详解：Reads质量评估 • 步骤二详解：基因组比对 • 附录：运行命令
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测序下机数据
测序输出的两个文件(双端测序数据)：
^对应的就是Q30
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Q-score
Q-score
Q10 Q20 Q30 Q40
不正确的碱基识 别
1/10 1/100 1/1000 1/10000
碱基正确识别率
90% 99% 99.9% 99.99%
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ASCII码、Q-score与错误率计算
Ascii码与Quality Score： Sanger: Q=ASCII值-33 Illumina1.3之后：Q=ASCII值-64
长非编码RNA测序分析实战讲解之 测序质量评估和Reads回贴
卜德超 budechao@ 中国科学院计算技术研究所
2014-12-20
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概要
• 长非编码RNA测序介绍 • 一个测序实例 • 长非编码RNA分析流程 • 步骤一详解：Reads质量评估 • 步骤二详解：基因组比对 • 附录：运行命令
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运行命令汇总(一)
1, 质量评估：
fastqc –o QC_outdir_N N_R1.fastq N_R2.fastq fastqc –o QC_outdir_P P_R1.fastq P_R2.fastq fastqc –o QC_outdir_M M_R1.fastq M_R2.fastq fastqc –o QC_outdir_V V_R1.fastq V_R2.fastq
思考：为何比对转录组？
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比对结果统计
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比对结果解读
基因组比对率 >80% >80% <40% <10%
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转录组比对率 >50% <10% <30% <10%
评估
比对结果?好? ！ DNA污染?? 测序质量?差? 、
reads接头?、? barcode、 ployA等未去净.
– Junctions.bed – Insertions.bed – Deletions.bed
Tophat直接报出junctions 结果
• Tophat-fusion：Fusions鉴定工具
Tophatfusion:从tophat的 输出挖掘fusions
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• 长非编码RNA测序介绍 • 一个测序实例 • 长非编码RNA分析流程 • 步骤一详解：Reads质量评估 • 步骤二详解：基因组比对 • 附录：运行命令
bowtie –o bwt_outdir_M refgene -1 M_R1.fastq -2 M_R2.fastq -S M.sam bowtie –o bwt_outdir_V refgene -1 V_R1.fastq -2 V_R2.fastq -V P.sam
refgene为bowtie产生的index文件
N_R1.fastq
@HWI-EAS724_0001:8:32:374:374#0/1 GAGCTGTATATGAATAATAGTTCGTTTTTCATTATCCAAGATGGATCGGTATAAAGTCTGCTAAAATAAAGGTACAACG +HWI-EAS724_0001:8:32:374:374#0/1 fcfcfggdfggggfggggcggggggggfgggggcgggfWgggggggggfgcggdgcgcggggfacbbb][bgcgggggd
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运行命令汇总(三)
4, Fusions鉴定：
tophat-fusion-post hg19
在tophat输出目录下执行上述命令
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软件链接
• Tophat
– /software/tophat/index.shtml
• Bowtie
用字符来表示每个碱基的质量值
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字符值--如何计算Q值
字符 f c g ^
ASCII码 值 102
99
103
94
Quality Score
102-64 =38
99-64 =35
103-64 =39
94-64 =30
错误率 <0.1% <0.1% <0.1% 0.1%
ASCII码表
去掉rRNA后的RNA polyA富集
带polyA的 RNA
不带polyA 的RNA
mRNA测序 (mRNA+lncRNA)
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测序(lncRNA)
去掉rRNA后的RNA 测序(mRNA+lncRNA)
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• 长非编码RNA测序介绍 • 一个测序实例 • 长非编码RNA分析流程 • 步骤一详解：Reads质量评估 • 步骤二详解：基因组比对 • 附录：运行命令
• 长非编码RNA测序：通过测序技术，获得某 个物种或特定细胞在某一生理条件下产生 的所有的长非编码RNA
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想测长非编码RNA，提取 RNA的步骤是怎样的？
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转录组内的RNA
• 转录组RNA，按功能分类：
– mRNA – 非编码RNA（即Non-coding RNA，如 tRNA，rRNAs，
若双端中有一端比对率高，一端比 对率很低，则类同第四种情况
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Tophat回贴原理
Mapped to the genome
Reads
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Unmapped
Searching the splicing sit
Split and Mapped
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Junctions和Fusions鉴定
• Tophat比对后的输出目录：
拿到共4对这样的测序文件
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Fastq文件质量值表示
N_R1.fastq
@HWI-EAS724_0001:8:32:374:374#0/1 GAGCTGTATATGAATAATAGTTCGTTTTTCATTATCCAAGATGGATCGGTATAAAGTCTGCTAAAATAAAGGTACAACG +HWI-EAS724_0001:8:32:374:374#0/1 fcfcfggdfggggfggggcggggggggfgggggcgggfWgggggggggfgcggdgcgcggggfacbbb][bgcgggggd
转录组比对数
2000 588 271 26 0
Note
No gap allowed Allow small gap Allow small gap Detection Intron
输入：RNA-seq data
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双比对策略
• 基因组-转录组双比对策略：
– Bowtie比对到已知编码基因集合(转录组) – Tophat比对到基因组(基因组)