响应面法优化益母草总黄酮的提取工艺研究

响应面法优化益母草总黄酮的提取工艺研究
张新勇;窦金凤;周国梁;毛斌斌
【摘要】采用响应面法优化超声提取益母草总黄酮的工艺条件.方法:在超声时间、超声功率、超声温度、料液比等单因素的基础上,通过中心组合设计原理采用三因
子三水平的响应面分析法设计,对单因子显著性和交互作用进行分析.结果:超声提取益母草总黄酮的最佳工艺条件为:超声时间35.54 min,料液比1:30.63,乙醇浓度73.41％.此时吸光度为0.295 9.在此条件下益母草的总黄酮提取率为1.21％.结论:优化的提取工艺条件,益母草的总黄酮提取率高,节约资源.
【期刊名称】《中国野生植物资源》
【年(卷),期】2017(036)006
【总页数】6页(P14-18,28)
【关键词】响应面法;提取工艺;益母草;总黄酮
【作者】张新勇;窦金凤;周国梁;毛斌斌
【作者单位】安徽科技学院食品药品学院,安徽凤阳233100;安徽科技学院食品药
品学院,安徽凤阳233100;安徽科技学院食品药品学院,安徽凤阳233100;安徽科技学院食品药品学院,安徽凤阳233100
【正文语种】中文
【中图分类】R284.2
益母草(Leonurus japonicus Houtt.)是唇形科二年生植物益母草的新鲜或干燥地
上部分[1]，其应用较为广泛，在多种古代典籍中均有记载。

最早在《神农本草经》
中就有记载。

其别名有益母蒿、益母艾、红花艾、坤草、茺蔚、、四楞子棵等。

本品性味苦、辛，微寒。

主入血分，功善活血调经，常治妇女淤血经产诸证，为妇科经产要药，故有“益母”之称。

归肝、心包经[2]。

有活血调经，利尿消肿的功效，是妇科常用的活血调经药[3]。

用于月经不调，痛经，经闭，恶露不尽，水肿尿少;
急性肾炎水肿。

益母草主要活性成分是益母草碱和水苏碱。

益母草碱具有抗炎镇痛、利尿、心肌保护等作用。

水苏碱具有多方面的生理学活性，能提高冠状动脉和心肌营养性血流量，减少心肌细胞坏死量，降低血管阻力，改善微循环等作用[4]。

益
母草全国大部分地区均有分布,具有广阔的开发应用前景。

益母草中有效成分的提取方法有水醇法、回流法、煎煮法等。

这些方法不仅提取时间长，而且有效成分提取率低，成本比较高。

超声波作为一种新兴的技术近年来已被广泛的应用于中药的有效成分提取。

当超声波在介质中传播时，由于超声波与介质的相互作用，使介质发生物理的和化学的变化，从而产生一系列力学的、热学的、电磁学的和化学的超声效应，包括机械效应、空化作用、热效应、化学效应[5]。

因此它具有耗时短、提取率高、节约资源等优点。

国内外对益母草总黄酮的的研究虽然比较多，但未见关于响应面法优化益母草总黄酮提取工艺的报道。

本试验采用响应面法对超声提取益母草中总黄酮的工艺进行优化，为工业化生产提供高效的提取方法。

响应面法(response surface methodology，RSM)是数学方法和统计方法结合的产物，是用来对所感兴趣的响应受多个变量影响的问题进行建模和分析，其最终目的是优化响应值[6]。

它采用二次回归方程拟合多个因素与多个响应值之间的函数
关系，通过回归方程分析寻求最佳工艺参数[7-8]。

1.1.1 药品与试剂
本试验所用益母草(Leonurus japonicus Houtt.)于2015年10月购自安徽省凤阳县回春堂大药房，由安徽科技学院食品药品学院毛斌斌老师鉴定为正品。

对照品芦丁(100080-200905)购自中国药品生物制品检定所；硝酸铝(天津市河东
区红岩试剂厂)，亚硝酸钠(天津市永大化学试剂有限公司)，氢氧化钠(天津市永大
化学试剂有限公司)，乙醇(天津市永大化学试剂有限公司)均为分析纯，水为蒸馏水。

1.1.2 仪器
高速中药粉碎机(XFB-400,吉首市中州制药机械厂);超声波清洗机(JK-500DB，合
肥金尼克机械制造有限公司);紫外可见分光光度计(UV5500，上海元析仪器有限公司);精密分析天平(FA2204C，上海精科天平有限公司);循环水真空泵(SHZ-DLLL,
郑州英峪予华予华仪器有限公司)等。

1.2.1 益母草总黄酮提取工艺
益母草干粉—水溶液超声提取—提取液抽滤—测定吸光度。

将采购的益母草经过鉴定后用烘箱烘干后，用粉碎机打成粗粉，准确称取益母草粉末1.0 g，置于100 mL的具塞锥形瓶中，加入一定量70%的乙醇溶液，在一定功率、温度下提取一定的时间，抽滤后倒入容量瓶中，滤液常压浓缩并用70%的乙
醇定容至10 mL容量瓶中(0.1g生药/ mL)，即得益母草总黄酮粗提液。

再取一定量放入比色皿中，再用紫外可见分光光度计测其吸光度。

(1)标准品溶液制备
精密称取芦丁标准品2 mg，用70%的乙醇在10 mL容量瓶中溶解并定容至刻度，精密量取芦丁标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL分别置于10 mL量瓶中，各加70%乙醇2.4 mL，5%NaNO2溶液0.4 mL，摇匀，静置6 min，加10%Al(NO3)3溶液0.4 mL，摇匀，静置6 min，再加入4%NaOH溶液4 mL。

最后用70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min，备用。

用第一支做空白，标准溶液在400～600 nm扫描其吸收光谱，确定最大吸收波长为509 nm，在509 nm波长处测定吸光度。

(2)绘制标准曲线
分别将上述滤液放入比色皿中,先扫描最大吸收波长，用第一支做空白，标准溶液在400～600 nm扫描其吸收光谱，确定最大吸收波长为509 nm，在509 nm波长处进行定量分析，记录吸光度A。

本实验以芦丁对照品质量浓度(C)为纵坐标、吸光度(A)为横坐标，绘制标准曲线。

测得线性回归为C=0.079A+0.000 5，
r=0.998 6。

结果表明，益母草总黄酮吸光度A含量在0～0.1mg/mL范围内与吸光度A线性关系良好。

(3)供试液制备及测定
再精密吸取样品溶液2.0 mL于10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，最后分别精密吸取供试液1 mL于10 mL试管中，加5%NaNO2溶液0.3 mL，振荡摇匀，放置6 min，10%Al(NO3)30.3 mL，振荡摇匀，放置6 min，再加
4%NaOH 4 mL，振荡摇匀，用30%乙醇定容至刻度，振荡摇匀，放置15 min 后置比色皿中在509 nm处测定吸光值，以70%乙醇溶液作为空白溶液。

1.2.2 益母草总黄酮提取率的计算
益母草总黄酮提取率(%)=[总黄酮含量(g)/原料重量(g)]×l00%
1.2.3 单因子实验
(1) 液料比对益母草总黄酮提取率的影响。

分别称取1 g益母草干粉, 置于5个合适锥形瓶中, 按液料体积质量比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1加入蒸馏水, 50 ℃水浴浸提30 min,抽滤后测定其吸光度，求出益母草总黄酮的提取率。

(2) 乙醇浓度对益母草总黄酮提取率的影响。

分别称取1 g益母草干粉, 置于5 个100 mL 锥形瓶中, 液料比为30∶1, 分别在50%、60%、70%、80%、90%的乙醇中提取30 min提取温度为50 ℃，抽滤后测定其吸光度，求出益母草总黄酮的提取率。

(3) 提取时间对益母草总黄酮提取率的影响。

分别称取1g 益母草干粉, 置于5个
100 mL 锥形瓶中, 液料比为30∶1, 分别在50 ℃水浴中提取10、20、30、40、50 min，抽滤后测定其吸光度，求出益母草总黄酮的提取率。

1.2.4 响应面法对益母草总黄酮提取条件进行优化
先通过上述单因素超声提取功率探究，得出结果，选用最佳超声功率，固定功率后，用响应面法对益母草总黄酮提取条件进行优化综合单因子实验结果, 根据Box-Benhnken 的中心组合实验设计原理,采用响应面法在三因子三水平上对益母草总
黄酮的提取条件进行优化。

实验因子和水平见表1。

2.1.1 液料比对益母草总黄酮吸光度的影响
从图1可以看出在液料比为10∶1到30∶1范围内，随着液料比的增大，吸光度
越大，当液料比继续增大到40∶1时，吸光度有所下降，故选择30∶1为最佳提
取液料比。

2.1.2 醇浓度对益母草总黄酮吸光度的影响
从图2可以看出在乙醇浓度从50%到70%范围内随着乙醇浓度的不断升高，吸光度越来越大，当乙醇浓度增至80%以后急剧下降，可能是黄酮结构被破坏，故选
择乙醇浓度为70%时为最佳提取浓度。

2.1.3 提取时间对益母草总黄酮吸光度影响
从图3可以看出在10 min到30 min内随着提取时间的增加，吸光度逐渐增加，当增加到40 min时吸光度开始下降，故选择提取时间为30 min时为最佳提取时间。

在单因子实验的基础上，在300 W超声功率，70%乙醇为提取液，选取超声时间、料液比为考察因素。

根据Box-Behnken的中心组合设计原理，采用响应面法在3因子3水平上对超声提取益母草总黄酮的工艺条件进行了优化。

吸光度(Y)为响应值，提取时间(A)，乙醇浓度(B)，料液比(C)。

进行响应面分析实验。

实验结果见
表2。

建立的回归曲线为:
Y=0.29+6.750×10-3A-0.010B-0.011C-0.017AB+3.000×10-3AC+0.041BC-
0.045A2-0.075B2-0.013C2
应用SAS 程序对实验结果进行方差分析，分析结果见表3。

表中“Pr>F”项表示
大于F的概率，从表可以看出B2(乙醇浓度)、对吸光度的影响高度显著(“Pr>F”的值小于0.005),BC、A2对总黄酮得率影响显著(“Pr>F”的值小于0.05)。

表明
实验因素对响应值不是简单的线性关系，因素间的交互关系影响也较大。

这和回归方程中一次项、二次项、交互项影响显著相一致。

图4～6直观给出了各个因素交互作用的相应面图。

可以看出，提取时间、料液比、提取温度对响应值的影响较大，表现出曲线比较陡，这与回归分析结果相符合。

通过Design-Expert 8.05b软件进行数据拟合综合分析得出最佳提取条件为
A=35.54 min, B=73.41%, C=30.63，此时模型预测的是0.295 9。

为了检验响应面法的可行性, 采用得到的最佳提取条件进行益母草总黄酮超声提取的验证实验,同时考虑到实际操作和生产的便利, 以液料比30∶1、提取时间35 min、乙醇浓度70%为最佳。

通过5 次平行实验得到的实际平均提取率为1.21%，与理论值相差0.02%。

因此, 响应面法对益母草总黄酮的超声提取条件的优化是可行的,得到的益母草总黄酮提取条件具有实际应用价值。

(1)本文在单因子实验的基础上, 将响应面法应用于优化益母草总黄酮的提取。

实验结果表明,液料比、提取时间，液料比的平方项和时间的平方项对益母草总黄酮提
取率的影响显着。

说明乙醇浓度、提取时间和液料比对益母草总黄酮提取率的影响不是简单的线性关系。

(2)回归分析和验证实验结果表明, 此方法合理可行。

得到总黄酮提取的最佳条件为: 液料比30∶1, 提取时间35 min, 乙醇浓度70%, 总黄酮提取率为1.21%。

【相关文献】
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