甘蓝黑腐病苗期抗性鉴定方法研究

甘蓝黑腐病苗期抗性鉴定方法研究作者：张鑫鑫张恩慧吴云锋许忠民蔡美杰孙庆国
来源：《中国瓜菜》2021年第06期
摘要：為了建立快速、准确的甘蓝黑腐病苗期抗性鉴定方法，以田间对黑腐病抗感差异表现明显的5个供试材料作为鉴别寄主，喷雾接种黑腐病菌株，设置1叶1心、2叶1心、3叶1心、4叶1心、5叶1心等5个接种苗龄，1×105、1×106、1×108、1×1010 CFU·mL-1等4种菌液接种浓度，26 ℃/19 ℃、28 ℃/19 ℃、30 ℃/19 ℃等3种培养温度，接种后0、12、24、36、48 h等5个保湿时间及接种后7、9、12、16 d等4个时间分别调查发病症状，确定影响抗性鉴定方法的关键因子。

结果表明，上述处理组合能反映5个寄主材料的抗感特性，且高感与
高抗材料的病情指数差值最大的分别为73.61、74.77和72.22。

当甘蓝幼苗生长至3叶1心期，喷雾法接种浓度为1×108 CFU·mL-1菌液，接种后90%湿度下保湿36 h，在14 h光照、温度26 ℃/19 ℃培养下诱导病害发生，第12天调查幼苗发病程度，能够鉴定甘蓝材料的抗病性。

关键词：甘蓝;黑腐病;抗病性;苗期;鉴定方法
中图分类号：S635 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）06-039-08
Study on the method of identification of resistance to black rot in cabbage at seedling stage
ZHANG Xinxin1， ZHANG Enhui1， WU Yunfeng2， XU Zhongmin1， CAI Meijie1，SUN Qingguo1
（1. State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas/College of Horticulture，Northwest A&F University， Yangling 712100， Shaanxi， China; 2. College of Plant Protection，Northwest A&F University， Yangling 712100， Shaanxi， China）
Abstract： In order to establish a rapid and accurate method for identification of resistance to black rot in cabbage at the seedling stage， we used 5 materials with significant differences in resistance to black rot in the field as identification hosts， sprayed inoculation with black rot strains，set 5 inoculation seedling ages （one leaf and one heart， two leaves and one heart， three leaves and one heart， four leaves and one heart， five leaves and one heart）， 4 kinds of inoculation concentrations （1×105 CFU·mL-1， 1×106 CFU·mL-1， 1×108 CFU·mL-1， 1×1010 CFU·mL-1）， 3 culture temperature treatments （26 ℃/19 ℃， 28 ℃/19 ℃， 30 ℃/19 ℃）， 5 moisturizing times （0 h， 12 h， 24 h， 36 h， 48 h） and 4 investigation time （7 d， 9 d， 12 d， 16 d） to determine the key factors of the identification method. The results show that the above treatment combination can reflect the anti-susceptibility characteristics of the five host materials，and the difference between the disease indices of the high-sensitivity and high-resistance materials is 73.61， 74.77 and 72.22， respectively. When the seedlings grew to the three leaves and one heart stage， the bacterial suspension with a concentration of 1×108 CFU·mL-1，was inoculated by spraying method， moisturized at 90% humidity for 36 hours after inoculation， and the disease was induced under 14 h light and 26 ℃/19 ℃， the incidence of seedlings was investigated on the 12th day， the disease resistance of cabbage material could be identified.
Key words： Cabbage; Black rot; Resistance; Seedling stage; Identification method
甘蓝黑腐病是由野油菜黄单胞菌（Xanthomonas Campestris pv. campestris，Xcc）引起的一种细菌性病害[1]，是亚洲、欧洲、北美洲十字花科蔬菜的主要病害[2-4]。

病斑从叶片边缘的
褪绿斑点逐渐向叶片的主脉扩张，形成“V”形病斑，颜色从黄色逐渐变为褐色，最后变为黑色
[5]。

甘蓝黑腐病野油菜黄单胞菌主要通过种子带菌和幼苗移植进行传播，也可以通过昆虫、灌溉用水、农场设备及工人进行农事活动等进行传播[6]。

病菌也能在十字花科杂草寄主和土壤中受感染的作物残茬中存活[7-8]。

亚热带许多蔬菜生产区典型的温暖潮湿气候有利于疾病的流行[9]。

近年来，甘蓝黑腐病在我国蔬菜主产区普遍发生，对甘蓝生产造成了很大危害，使甘蓝严重减产[10]。

尽管市场上有一些用于防治黑腐病的农药，但由于病原菌对杀菌剂的抗药性，黑腐病很难得到控制[11]，选育抗病品种是防治甘蓝黑腐病最经济有效的途径之一，因此依据甘蓝黑腐病发生条件、发病规律和作物的感病特性、发病特征，制定一套较为科学的苗期抗病性鉴定方法，对于抗源筛选和抗病品种选育非常重要。

有研究表明，甘藍苗期和成株期抗病性基本一致[12-13]，苗期鉴定抗病性速度快，可在较短时间内得到鉴定结果，并且苗期鉴定可在室内进行，条件容易控制[14-16]。

因此，笔者在前人研究的基础上，从甘蓝幼苗接种黑腐病菌保湿时间、病原菌接种浓度及温度、甘蓝接种苗龄和调查时间等主因入手进行探究，旨在进一步完善并制定出甘蓝黑腐病苗期抗病性鉴定方法，以期为甘蓝抗病育种提供帮助。

1 材料与方法
1.1 材料与菌株
供试甘蓝材料为甘蓝田间黑腐病自然病圃经多年抗病性自然鉴定表现对黑腐病菌抗感差异显著的5个材料（表1），均由西北农林科技大学甘蓝研究室提供。

供试甘蓝黑腐病菌株为致病力较强的甘蓝黑腐病菌株YU[17]，该菌株由西北农林科技大学甘蓝研究室提供。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、酵母粉1 g、葡萄糖10 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L、pH 7.2;牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、酵母粉1 g、葡萄糖10 g、蒸馏水1 L、pH 7.2。

1.2 方法
1.2.1 幼苗培养试验于2019年3—10月在西北农林科技大学试验基地日光温室进行，将5个材料的种子先在75%酒精中处理1 min，再用灭菌蒸馏水冲洗2～3次后，于25 ℃培养箱内催芽2 d，选取发芽一致的种子播种于50孔穴盘（540 mm × 270 mm × 50 mm）基质中，所用基质提前进行灭菌处理，育苗盘置于日光温室中正常生长。

1.2.2 病原菌接种方法和抗性类型划分接种材料准备：供试甘蓝材料幼苗长至一定时期时，将幼苗浇透水并覆盖塑料薄膜保湿24 h（25 ℃/19 ℃）。

黑腐病菌悬浮液制备：将4 ℃保存的菌株YU于牛肉膏蛋白胨固体培养基上活化24 h，挑取活化的菌株于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在28 ℃、190 r·min-1条件下振荡培养18 h，用无菌水调节浓度用于接种。

接种：用小型喷雾器将配制好的菌液均匀喷洒到植株叶片上，每株幼苗平均喷施1 mL左右，以叶片无液滴滴落为宜，以喷施无菌水为空白对照，3次重复，每次重复16株。

接种后继续用薄膜保湿，之后除去薄膜将幼苗放置光照14 h、湿度90%下栽培生长。

整个试验采用完全随机设计，接种后数日开始调查发病情况（每株幼苗随机选2片真叶进行调查），统计发病级别，计算病情指数，进行抗性类型划分。

病情指数计算和抗性类型划分：病情指数（Disease Index，DI）=Σ（病级叶数×该病级值）/（调查总叶数×最高病级）×100。

抗性类型（Resistance Type，RT）划分：依据甘蓝材料的叶片病情级别，分别计算出DI平均值，进而确定其抗性类型。

1.2.3 病原菌接种后最适保湿和发病调查时间确定用小型喷雾器将浓度为1×108 CFU·mL-1的菌液均匀喷施到3叶1心期的供试甘蓝幼苗上，分别设置塑料薄膜保湿0、12、24、36、48 h等5个处理，每个处理3次重复，每次重复16株幼苗。

接种后的幼苗置于28 ℃/19 ℃光照14 h培养箱内培养;接种后分别于7、9、12、16 d调查发病症状，比较5个材料的田间自然抗病性与苗期接种黑腐病的抗病性，筛选病原菌接种后的最适保湿条件和发病调查时间。

1.2.4 病原菌接种最适浓度和温度确定利用血球计数板分别配置1×105、1×106、1×108、1×1010 CFU·mL-1等4种浓度的黑腐病病原菌悬浮液，用小型喷雾器于3叶1心期的甘蓝幼苗进行喷雾接种，采用1.2.3确定的最适保湿时间和发病调查时间，将接种后除去薄膜的甘蓝幼苗置于光照培养箱内培养（光14 h/暗10 h），温度分别设置26 ℃/19 ℃、28 ℃/19 ℃、
30 ℃/19 ℃等3个处理，湿度90%下培养;每个处理3次重复，每次重复16株。

比较5个材料的田间自然抗病性与苗期接种黑腐病的抗病性，筛选病原菌接种后的最适浓度和温度。

1.2.5 病原菌接种最适苗龄的确定采用1.2.3和1.2.4确定的保湿时间、发病调查时间、接种浓度和温度，设置1叶1心、2叶1心、3叶1心、4叶1心、5叶1心等5个接种苗龄处理。

接种后幼苗于光照培养箱培养，湿度90%，每个处理3次重复，每次重复16株。

比较5个材料的田间自然抗病性与苗期接种黑腐病的抗病性，筛选病原菌接种的最适苗龄。

1.2.6 甘蓝不同种质资源材料的抗病性鉴定采用本试验中建立的甘蓝黑腐病苗期抗性鉴定方法，对国内外引进的44份甘蓝种质资源进行苗期抗病性鉴定，以高抗材料QK2502和感病材料QG50作为对照，根据鉴定结果选择有代表性的10份材料进行重复鉴定与验证。

甘蓝黑腐病是由野油菜黄单胞菌（Xanthomonas Campestris pv. campestris，Xcc）引起的一种细菌性病害[1]，是亚洲、欧洲、北美洲十字花科蔬菜的主要病害[2-4]。

病斑从叶片边缘的褪绿斑点逐渐向叶片的主脉扩张，形成“V”形病斑，颜色从黄色逐渐变为褐色，最后变为黑色
灌溉用水、农场设备及工人进行农事活动等进行传播[6]。

病菌也能在十字花科杂草寄主和土壤中受感染的作物残茬中存活[7-8]。

亚热带许多蔬菜生产区典型的温暖潮湿气候有利于疾病的流行[9]。

近年来，甘蓝黑腐病在我国蔬菜主产区普遍发生，对甘蓝生产造成了很大危害，使甘蓝严重减产[10]。

尽管市场上有一些用于防治黑腐病的农药，但由于病原菌对杀菌剂的抗药性，黑腐病很难得到控制[11]，选育抗病品种是防治甘蓝黑腐病最经济有效的途径之一，因此依据甘蓝黑腐病发生条件、发病规律和作物的感病特性、发病特征，制定一套较为科学的苗期抗病性鉴定方法，对于抗源筛选和抗病品种选育非常重要。

有研究表明，甘蓝苗期和成株期抗病性基本一致[12-13]，苗期鉴定抗病性速度快，可在较短时间内得到鉴定结果，并且苗期鉴定可在室内进行，条件容易控制[14-16]。

因此，笔者在前人研究的基础上，从甘蓝幼苗接种黑腐病菌保湿时间、病原菌接种浓度及温度、甘蓝接种苗龄和调查时间等主因入手进行探究，旨在进一步完善并制定出甘蓝黑腐病苗期抗病性鉴定方法，以期为甘蓝抗病育种提供帮助。

1 材料与方法
1.1 材料与菌株
供试甘蓝材料为甘蓝田间黑腐病自然病圃经多年抗病性自然鉴定表现对黑腐病菌抗感差异显著的5个材料（表1），均由西北农林科技大学甘蓝研究室提供。

供试甘蓝黑腐病菌株为致病力较强的甘蓝黑腐病菌株YU[17]，该菌株由西北农林科技大学甘蓝研究室提供。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、酵母粉1 g、葡萄糖10 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L、pH 7.2;牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、酵母粉1 g、葡萄糖10 g、蒸馏水1 L、pH 7.2。

1.2 方法
1.2.1 幼苗培养试验于2019年3—10月在西北农林科技大学试验基地日光温室进行，将5个材料的种子先在75%酒精中处理1 min，再用灭菌蒸馏水冲洗2～3次后，于25 ℃培养箱内催芽2 d，选取发芽一致的种子播种于50孔穴盘（540 mm × 270 mm × 50 mm）基质中，所用基质提前进行灭菌处理，育苗盘置于日光温室中正常生长。

1.2.2 病原菌接种方法和抗性类型划分接种材料准备：供试甘蓝材料幼苗长至一定时期时，将幼苗浇透水并覆盖塑料薄膜保湿24 h（25 ℃/19 ℃）。

取活化的菌株于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在28 ℃、190 r·min-1条件下振荡培养18 h，用无菌水调节浓度用于接种。

接种：用小型喷雾器将配制好的菌液均匀喷洒到植株叶片上，每株幼苗平均喷施1 mL左右，以叶片无液滴滴落为宜，以喷施无菌水为空白对照，3次重复，每次重复16株。

接种后继续用薄膜保湿，之后除去薄膜将幼苗放置光照14 h、湿度90%下栽培生长。

整个试验采用完全随机设计，接种后数日开始调查发病情况（每株幼苗随机选2片真叶进行调查），统计发病级别，计算病情指数，进行抗性类型划分。

病情指数计算和抗性类型划分：病情指数（Disease Index，DI）=Σ（病级叶数×该病级值）/（调查总叶数×最高病级）×100。

抗性类型（Resistance Type，RT）划分：依据甘蓝材料的叶片病情级别，分别计算出DI平均值，进而确定其抗性类型。

1.2.3 病原菌接种后最适保湿和发病调查时间确定用小型喷雾器将浓度为1×108 CFU·mL-1的菌液均匀喷施到3叶1心期的供试甘蓝幼苗上，分别设置塑料薄膜保湿0、12、24、36、48 h等5个处理，每个处理3次重复，每次重复16株幼苗。

接种后的幼苗置于28 ℃/19 ℃光照14 h培养箱内培养;接种后分别于7、9、12、16 d调查发病症状，比较5个材料的田间自然抗病性与苗期接种黑腐病的抗病性，筛选病原菌接种后的最适保湿条件和发病调查时间。

1.2.4 病原菌接种最适浓度和温度确定利用血球计数板分别配置1×105、1×106、1×108、1×1010 CFU·mL-1等4种浓度的黑腐病病原菌悬浮液，用小型喷雾器于3叶1心期的甘蓝幼苗进行喷雾接种，采用1.2.3确定的最适保湿时间和发病调查时间，将接种后除去薄膜的甘蓝幼苗置于光照培养箱内培养（光14 h/暗10 h），温度分别设置26 ℃/19 ℃、28 ℃/19 ℃、
30 ℃/19 ℃等3个处理，湿度90%下培养;每个处理3次重复，每次重复16株。

比较5个材料的田间自然抗病性与苗期接种黑腐病的抗病性，筛选病原菌接种后的最适浓度和温度。

1.2.5 病原菌接种最适苗龄的确定采用1.2.3和1.2.4确定的保湿时间、发病调查时间、接种浓度和温度，设置1叶1心、2叶1心、3叶1心、4叶1心、5叶1心等5个接种苗龄处理。

接种后幼苗于光照培养箱培养，湿度90%，每个处理3次重复，每次重复16株。

比较5个材料的田间自然抗病性与苗期接种黑腐病的抗病性，筛选病原菌接種的最适苗龄。

1.2.6 甘蓝不同种质资源材料的抗病性鉴定采用本试验中建立的甘蓝黑腐病苗期抗性鉴定方法，对国内外引进的44份甘蓝种质资源进行苗期抗病性鉴定，以高抗材料QK2502和感病材料QG50作为对照，根据鉴定结果选择有代表性的10份材料进行重复鉴定与验证。

甘蓝黑腐病是由野油菜黄单胞菌（Xanthomonas Campestris pv. campestris，Xcc）引起的一种细菌性病害[1]，是亚洲、欧洲、北美洲十字花科蔬菜的主要病害[2-4]。

病斑从叶片边缘的褪绿斑点逐渐向叶片的主脉扩张，形成“V”形病斑，颜色从黄色逐渐变为褐色，最后变为黑色
灌溉用水、农场设备及工人进行农事活动等进行传播[6]。

病菌也能在十字花科杂草寄主和土壤中受感染的作物残茬中存活[7-8]。

亚热带许多蔬菜生产区典型的温暖潮湿气候有利于疾病的流行[9]。

近年来，甘蓝黑腐病在我国蔬菜主产区普遍发生，对甘蓝生产造成了很大危害，使甘蓝严重减产[10]。

尽管市场上有一些用于防治黑腐病的农药，但由于病原菌对杀菌剂的抗药性，黑腐病很难得到控制[11]，选育抗病品种是防治甘蓝黑腐病最经济有效的途径之一，因此依据甘蓝黑腐病发生条件、发病规律和作物的感病特性、发病特征，制定一套较为科学的苗期抗病性鉴定方法，对于抗源筛选和抗病品种选育非常重要。

有研究表明，甘蓝苗期和成株期抗病性基本一致[12-13]，苗期鉴定抗病性速度快，可在较短时间内得到鉴定结果，并且苗期鉴定可在室内进行，条件容易控制[14-16]。

因此，笔者在前人研究的基础上，从甘蓝幼苗接种黑腐病菌保湿时间、病原菌接种浓度及温度、甘蓝接种苗龄和调查时间等主因入手进行探究，旨在进一步完善并制定出甘蓝黑腐病苗期抗病性鉴定方法，以期为甘蓝抗病育种提供帮助。

1 材料与方法
1.1 材料与菌株
供试甘蓝材料为甘蓝田间黑腐病自然病圃经多年抗病性自然鉴定表现对黑腐病菌抗感差异显著的5个材料（表1），均由西北农林科技大学甘蓝研究室提供。

供试甘蓝黑腐病菌株为致病力较强的甘蓝黑腐病菌株YU[17]，该菌株由西北农林科技大学甘蓝研究室提供。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、酵母粉1 g、葡萄糖10 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L、pH 7.2;牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、酵母粉1 g、葡萄糖10 g、蒸馏水1 L、pH 7.2。

1.2 方法
1.2.1 幼苗培养试验于2019年3—10月在西北农林科技大学试验基地日光温室进行，将5个材料的种子先在75%酒精中处理1 min，再用灭菌蒸馏水冲洗2～3次后，于25 ℃培养箱内催芽2 d，选取发芽一致的种子播种于50孔穴盘（540 mm × 270 mm × 50 mm）基质中，所用基质提前进行灭菌处理，育苗盘置于日光温室中正常生长。

1.2.2 病原菌接种方法和抗性类型划分接种材料准备：供试甘蓝材料幼苗长至一定时期时，将幼苗浇透水并覆盖塑料薄膜保湿24 h（25 ℃/19 ℃）。

取活化的菌株于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在28 ℃、190 r·min-1条件下振荡培养18 h，用无菌水调节浓度用于接种。

接种：用小型喷雾器将配制好的菌液均匀喷洒到植株叶片上，每株幼苗平均喷施1 mL左右，以叶片无液滴滴落为宜，以喷施无菌水为空白对照，3次重复，每次重复16株。

接种后继续用薄膜保湿，之后除去薄膜将幼苗放置光照14 h、湿度90%下栽培生长。

整个试验采用完全随机设计，接种后数日开始调查发病情况（每株幼苗随机选2片真叶进行调查），统计发病级别，计算病情指数，进行抗性类型划分。

病情指数计算和抗性类型划分：病情指数（Disease Index，DI）=Σ（病级叶数×该病级值）/（调查总叶数×最高病级）×100。

抗性类型（Resistance Type，RT）划分：依据甘蓝材料的叶片病情级别，分别计算出DI平均值，进而确定其抗性类型。

1.2.3 病原菌接种后最适保湿和发病调查时间确定用小型喷雾器将浓度为1×108 CFU·mL-1的菌液均匀喷施到3叶1心期的供试甘蓝幼苗上，分别设置塑料薄膜保湿0、12、24、36、48 h等5个处理，每个处理3次重复，每次重复16株幼苗。

接种后的幼苗置于28 ℃/19 ℃光照14 h培养箱内培养;接种后分别于7、9、12、16 d调查发病症状，比较5个材料的田间自然抗病性与苗期接种黑腐病的抗病性，筛选病原菌接种后的最适保湿条件和发病调查时间。

1.2.4 病原菌接种最适浓度和温度确定利用血球计数板分别配置1×105、1×106、1×108、1×1010 CFU·mL-1等4种浓度的黑腐病病原菌悬浮液，用小型喷雾器于3叶1心期的甘蓝幼苗进行喷雾接种，采用1.2.3确定的最适保湿时间和发病调查时间，将接种后除去薄膜的甘蓝幼苗置于光照培养箱内培养（光14 h/暗10 h），温度分别设置26 ℃/19 ℃、28 ℃/19 ℃、
30 ℃/19 ℃等3个处理，湿度90%下培养;每个处理3次重复，每次重復16株。

比较5个材料的田间自然抗病性与苗期接种黑腐病的抗病性，筛选病原菌接种后的最适浓度和温度。

1.2.5 病原菌接种最适苗龄的确定采用1.2.3和1.2.4确定的保湿时间、发病调查时间、接种浓度和温度，设置1叶1心、2叶1心、3叶1心、4叶1心、5叶1心等5个接种苗龄处理。

接种后幼苗于光照培养箱培养，湿度90%，每个处理3次重复，每次重复16株。

比较5个材料的田间自然抗病性与苗期接种黑腐病的抗病性，筛选病原菌接种的最适苗龄。

1.2.6 甘蓝不同种质资源材料的抗病性鉴定采用本试验中建立的甘蓝黑腐病苗期抗性鉴定方法，对国内外引进的44份甘蓝种质资源进行苗期抗病性鉴定，以高抗材料QK2502和感病材料QG50作为对照，根据鉴定结果选择有代表性的10份材料进行重复鉴定与验证。

甘蓝黑腐病是由野油菜黄单胞菌（Xanthomonas Campestris pv. campestris，Xcc）引起的一种细菌性病害[1]，是亚洲、欧洲、北美洲十字花科蔬菜的主要病害[2-4]。

病斑从叶片边缘的褪绿斑点逐渐向叶片的主脉扩张，形成“V”形病斑，颜色从黄色逐渐变为褐色，最后变为黑色
灌溉用水、农场设备及工人进行农事活动等进行传播[6]。

病菌也能在十字花科杂草寄主和土壤中受感染的作物残茬中存活[7-8]。

亚热带许多蔬菜生产区典型的温暖潮湿气候有利于疾病的流行[9]。

近年来，甘蓝黑腐病在我国蔬菜主产区普遍发生，对甘蓝生产造成了很大危害，使甘蓝严重减产[10]。

尽管市场上有一些用于防治黑腐病的农药，但由于病原菌对杀菌剂的抗药性，黑腐病很难得到控制[11]，选育抗病品种是防治甘蓝黑腐病最经济有效的途径之一，因此依据甘蓝黑腐病发生条件、发病规律和作物的感病特性、发病特征，制定一套较为科学的苗期抗病性鉴定方法，对于抗源筛选和抗病品种选育非常重要。

有研究表明，甘蓝苗期和成株期抗病性基本一致[12-13]，苗期鉴定抗病性速度快，可在较短时间内得到鉴定结果，并且苗期鉴定可在室内进行，条件容易控制[14-16]。

因此，笔者在前人研究的基础上，从甘蓝幼苗接种黑腐病菌保湿时间、病原菌接种浓度及温度、甘蓝接种苗龄和调查时间等主因入手进行探究，旨在进一步完善并制定出甘蓝黑腐病苗期抗病性鉴定方法，以期为甘蓝抗病育种提供帮助。

1 材料与方法
1.1 材料与菌株
供试甘蓝材料为甘蓝田间黑腐病自然病圃经多年抗病性自然鉴定表现对黑腐病菌抗感差异显著的5个材料（表1），均由西北农林科技大学甘蓝研究室提供。

供试甘蓝黑腐病菌株为致病力较强的甘蓝黑腐病菌株YU[17]，该菌株由西北农林科技大学甘蓝研究室提供。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、酵母粉1 g、葡萄糖10 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L、pH 7.2;牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、酵母粉1 g、葡萄糖10 g、蒸馏水1 L、pH 7.2。

1.2 方法
1.2.1 幼苗培养试验于2019年3—10月在西北农林科技大学试验基地日光温室进行，将5个材料的种子先在75%酒精中处理1 min，再用灭菌蒸馏水冲洗2～3次后，于25 ℃培养箱内催芽2 d，选取发芽一致的种子播种于50孔穴盘（540 mm × 270 mm × 50 mm）基质中，所用基质提前进行灭菌处理，育苗盘置于日光温室中正常生长。

1.2.2 病原菌接种方法和抗性类型划分接种材料准备：供试甘蓝材料幼苗长至一定时期时，将幼苗浇透水并覆盖塑料薄膜保湿24 h（25 ℃/19 ℃）。

取活化的菌株于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在28 ℃、190 r·min-1条件下振荡培养18 h，用无菌水调节浓度用于接种。

接种：用小型喷雾器将配制好的菌液均匀喷洒到植株叶片上，每株幼苗平均喷施1 mL左右，以叶片无液滴滴落为宜，以喷施无菌水为空白对照，3次重复，每次重复16株。

接种后继续用薄膜保湿，之后除去薄膜将幼苗放置光照14 h、湿度90%下栽培生长。

整个试验采用完全随机设计，接种后数日开始调查发病情况（每株幼苗随机选2片真叶进行调查），统计發病级别，计算病情指数，进行抗性类型划分。

病情指数计算和抗性类型划分：病情指数（Disease Index，DI）=Σ（病级叶数×该病级值）/（调查总叶数×最高病级）×100。

抗性类型（Resistance Type，RT）划分：依据甘蓝材料的叶片病情级别，分别计算出DI平均值，进而确定其抗性类型。

1.2.3 病原菌接种后最适保湿和发病调查时间确定用小型喷雾器将浓度为1×108 CFU·mL-1的菌液均匀喷施到3叶1心期的供试甘蓝幼苗上，分别设置塑料薄膜保湿0、12、24、36、48 h等5个处理，每个处理3次重复，每次重复16株幼苗。

接种后的幼苗置于28 ℃/19 ℃光照14 h培养箱内培养;接种后分别于7、9、12、16 d调查发病症状，比较5个材料的田间自然抗病性与苗期接种黑腐病的抗病性，筛选病原菌接种后的最适保湿条件和发病调查时间。

1.2.4 病原菌接种最适浓度和温度确定利用血球计数板分别配置1×105、1×106、1×108、1×1010 CFU·mL-1等4种浓度的黑腐病病原菌悬浮液，用小型喷雾器于3叶1心期的甘蓝幼苗进行喷雾接种，采用1.2.3确定的最适保湿时间和发病调查时间，将接种后除去薄膜的甘蓝幼苗置于光照培养箱内培养（光14 h/暗10 h），温度分别设置26 ℃/19 ℃、28 ℃/19 ℃、
30 ℃/19 ℃等3个处理，湿度90%下培养;每个处理3次重复，每次重复16株。

比较5个材料的田间自然抗病性与苗期接种黑腐病的抗病性，筛选病原菌接种后的最适浓度和温度。

1.2.5 病原菌接种最适苗龄的确定采用1.2.3和1.2.4确定的保湿时间、发病调查时间、接种浓度和温度，设置1叶1心、2叶1心、3叶1心、4叶1心、5叶1心等5个接种苗龄处理。

接种后幼苗于光照培养箱培养，湿度90%，每个处理3次重复，每次重复16株。

比较5个材料的田间自然抗病性与苗期接种黑腐病的抗病性，筛选病原菌接种的最适苗龄。

1.2.6 甘蓝不同种质资源材料的抗病性鉴定采用本试验中建立的甘蓝黑腐病苗期抗性鉴定方法，对国内外引进的44份甘蓝种质资源进行苗期抗病性鉴定，以高抗材料QK2502和感病材料QG50作为对照，根据鉴定结果选择有代表性的10份材料进行重复鉴定与验证。