健脾补肾解毒方对lewis肺癌小鼠脾脏cd4^+cd25^+调节t细胞含量的影响

宁夏医学杂志2019年12月第41卷第12期Ningxia Med J,Dec.2019,Vol41,No.12-1057-Doi：10.13621/j.1001-5949.2019.12.1057•论著.
健脾补肾解毒方对Lewis肺癌小鼠脾脏CD4+CD?；
调节T细胞含量的影响
周丽萍1，马艳2，杨锦亮1
［摘要］目的使用动物实验研究探索健脾补肾解毒方通过下调lewis肺癌小鼠脾脏中的CD4+CD2：调节性T 细胞的比例来达到抑制肿瘤的作用机制。

方法将40只C57BL/6J小鼠，随机分为正常组、荷瘤模型组、化疗组
（顺钳组）、中药组（健脾补肾解毒方）、联合组（健脾补肾解毒方+顺钳组），给药14d后处死小鼠，剥离脾脏，用流
式细胞仪检测小鼠脾脏CD4+CD2：的含量。

结果小鼠脾脏CD4+CD2：调节T细胞含量与正常组比较,中药组、荷瘤
模型组、化疗组比率明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）联合组比率虽高于正常组,但差异无统计学意义
（P>0.05）；与荷瘤模型组比较,化疗组、中药组、联合组比率明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）结论健脾补肾解毒方通过下调lewis肺癌小鼠脾脏中CD4+CD2：调节性T细胞的比例能达到抑制肿瘤的作用。

［关键词］Lewis肺癌；小鼠；健脾补肾解毒方;CD4+CD2^调节;T细胞
［中图分类号］R285［文献标识码］A
Effect of Jianpi Bushenjiedu Recipe on the expression of CD；CD£T cells in mice spleen with Lewis lung cancer ZHOU LIping1,MA Yan2,Y ANG Jinliang1. 1.The General Hospital of Ningxia Medical University,Y inchuan,750004,C hina；2.The Hospital O Yinchuan Traditional Chinese Medicine,Yinchuan750001,China
Corresponding author：MA Yan,Email：526648994@
[Abstract]Objective To explore the mechanism of Jianpi Bushen Jiedu recipe in inhibiting tumors by reducing the proportion of CD；CD』regulatory T cells(Treg)in the spleen of Lewis lung cancer mice through animal experiments.Methods A total of40 C57BL/6J mice were randomly divided into normal group,model group,chemotherapy group(cisplatin group),traditional Chinese medi­cine group(Jianpi Bushen Jiedu recipe),combined group(Jianpi Bushen Jiedu recipe+cisplatin group).After14days,the mice were executed and their spleens were stripped.The content of CD；CD£in mouse spleens were detected by flow cytometry. Results Compared with the normal group,the ratio of CD；CD=regulation T cells in traditional Chinese medicine group,model group, chemotherapy group was significantly higher(P<0.05),although the ratio in combined group was higher than that in the normal group, but the difference was not statistically significant(P>0.05).Compared with the model group,the chemotherapy group,the tradition Chinese medicine group,the combined group was significantly lower,the difference was statistically significant(P<0.05). Conclusion Jianpi Bushen Jiedu recipe can inhibit the tumor by decreasing the proportion of CD：CD£regulatory T cells in the spleen of Lewis lung cancer mice.
[Key words]Lewis lung cancer；Mice；Jianpi Bushenjiedu Recipe；C D；‘CD?；；cells
肺癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康［1］，发病率居各种恶性肿瘤首位，男性为第一，女性为第二。

据调查2012年全球新增癌症病例1410万人，肺癌占所有新增癌症的12.9%，死亡人数约为820万，肺癌占全部癌症死亡的19.5%［2］0临床上以非小细胞肺癌（NSCLC）患者最多见，大约占总肺癌患者的80.4%°免疫逃逸是恶性肿瘤的基
［基金项目］宁夏自然科学基金资助项目（2018AAC03166）；宁夏医科大学校级课题（XM201440）
［作者单位］1•宁夏医科大学总医院中医科庁夏银川750004
2•宁夏银川市中医医院，宁夏银川750001［作者简介］周丽萍（1970-），女,宁夏籍，副主任医师，主要从事中医药防治恶性肿瘤研究方向。

［通讯作者］马艳，Email：526648994@
［网络出版地址］http：///kcms/detail/64.1008.R.20191119.
1418.046.html 本生物学特性之一，免疫功能下降，能加快肿瘤转移、复发，而中医药能通过提高免疫功能来抑制肿瘤生长、转移，提高患者生存质量以及延长生存期，减少中晚期肺癌放化疗后的毒副反应。

本实验研究健脾补肾解毒方通过下调Lewis肺癌小鼠脾脏中的CDfCD-调节性T细胞的比例来达到抑制肿瘤的作用。

1资料与方法
1.1一般资料：C57BL/6J小鼠（20±2）g，雌性,6-8周龄,SPF级，由宁夏医科大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK（宁）2005-001°
1.2细胞株:Lewis细胞株购自南京凯基公司细胞库。

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1.3实验药5及制备:健脾补肾解毒方由生黄'、生白术、茯苓、生慧-仁、石上柏、石见穿、七叶一枝花、黄精、仙茅、淫羊；等12味药物组成，由宁夏医科大学中医门诊部提供。

药材按照传统法煎煮2次，合并药液，过滤，浓缩至含生药1.32g/mL,放4°C冰箱封存备用。

顺Z（DDP）：20mg/瓶，由宁夏医科大学总医院肿瘤医院药房提供（生产厂家:江苏豪森药业集团有限公司）
1.4主要试剂与仪器:Hyclone培养基（Hyclone,公司），10%胎牛血清（hyclone,公司）,PBS缓冲液（索莱宝），双抗（00R g/mL链霉素，100U/mL青霉素配制）,流式细胞仪（BD公司），FITC anti-mous-eCD4*抗体（BD,公司），PE anti-mouseCD25*抗体（BD公司），超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），离心机（上海力申科学仪器有限公司），显微镜（CKX31SF型，olympum corporation TokYo.Japan），37C恒温箱（北京长源试验设备厂），精密电子天平。

1.5造模:从液氮管中取出1支Lewis细胞株，在37C恒温水浴箱内于1min内融化，滴管吸出置于有完全DMEM培养基,10%胎牛血清及青霉素、链霉素配制的培养液的离心管中，1000r/min，5min，离心，吸尽液体，把沉淀的细胞加入培养液吹打均匀，置于培养瓶内，置37C、5%CO2培养箱中培养。

达到所需数量后，取对数生长期细胞经0.25%胰酶消化制成细胞悬液。

台盼蓝染色法测定活细胞数> 95%，调整细胞浓度至4~5x106，接种于C57BL/6J 小鼠右前肢腋窝皮下，除正常组小鼠外，其余每只
0.2mL,全程严格无菌操作,40min内完成。

1.6分组与给药：除正常组外，其余小鼠自接种瘤株细胞24h后称重、编号，随机分为4组，每组8只。

共5组分别为:正常组，荷瘤模型组，中药组（健脾补肾解毒方），化疗组（顺Z）,综合组（健脾补肾解毒方+顺钳组）。

正常组、荷瘤模型组:生理盐水灌胃0.4mL/d,连续灌胃14d,同时于第1、3、5天腹腔注射生理盐水0.2mL;中药组:予以健脾补肾解毒方药液灌胃0.4mL/d（1.32g/mL）,连续灌胃14d,同时于第1、、5天腹腔注射生理盐水0.2mL；化疗组:生理盐水灌胃0.4mL/d,连续灌胃14d,同时于第1、3、5天腹腔注射顺Z0.2mL（20mg/kg）；综合组:予以健脾补肾解毒方药液灌胃0.4mL/d（1.32g/ mL）,连续灌胃14d,同时于第1、3、5天腹腔注射顺Z0.2mL（20mg/kg）。

1.7实验指标
1.7.1一般情况的观察:观察各组小鼠饮食、精神
、为化等。

1.7.2小鼠脾脏CDfCD^调节T细胞含量:小鼠脾脏悬液制备，第15天早晨，把小鼠颈椎脱臼处死，用75%的酒精浸泡5min;切开腹部，找准脾脏的位置并完全剥离脾脏后，放置于盛有PBS液的培养皿中。

把200目钢网放在另一培养皿中，加入PBS缓冲液；脾脏在，用2mL的
沿着同一方向进行反复的研磨，并用PBS冲洗;把滤液加入15mL离心管中,1500r/min,5min,离心，吸掉上清液，加入红细胞裂解液，静止5min;加入PBS 冲洗液,1500r/min,5min,离心，反复3次,最后用PBS液重悬细胞。

调整细胞数1x106个/mL。

取100口细胞液，加入流式细胞仪测定管中，设置空白组不加任何抗体，其它分别加FITCanti-mous-eCD4*,PE anti-mouseCD25*,FITCanti-mouseCD4*和PE anti-mouseCD25*抗体，避光30mins,再加入500口PBS冲洗液重选细胞,上流式细胞仪检测。

1.8统计学方法:采用SPSS17.0统计软件,计量资料以X±S表示，多组间比较用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.1小鼠一般情况的观察:在整个实验过程中前4 d各组小鼠的活动、饮食与接种前无明显的差异，接种后第5天开始，除正常组小鼠外，其余各组小鼠右前肢腋下可触及黄豆大小的瘤块。

模型组瘤块增长速度较其他组快，并出现逐渐消瘦，皮毛无光泽、脱落，活动迟缓、喜扎堆，进食量减少现象，治疗结束,剥取的瘤体，称重，平均瘤重较其他各组高；中药组、化疗组、联合组随着时间的增加瘤体有所增长，但瘤体增长缓慢,尤其联合组瘤体最小，同时小鼠消瘦的速度慢，皮毛光泽、毛发脱落、活动度、进食情况较化疗组要好。

2.2各组小鼠脾脏CD4*CD2；Treg细胞含量表达的比较:用流式细胞仪检测CD；CD£细胞占CD4*细胞比率大小的比较,与正常组比较，中药组、模型组、化疗组比率明显偏高，差异有统计学意义（P<0.05）,联合组比率虽高于正常组,但差异无统计学意义（P>0.05）。

与模型组比较，化疗组、中药组、联合组比率明显偏低，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

宁夏医学杂志2019年12月第41卷第12期Ningxia Med J,Dec.2019,Vol41,No.12-1059-
表1各组小鼠脾脏CD**CD2；Treg细胞占
CD4+T细胞的比例(“=8,，士s)
组别n cd；cd2；/cd4*
正常组89.14±0.62
模型组818.1±1.46*
化疗组812.8±1.14*#
中药组815.58±0.37*#
联合组810.7±1.06*
F值38.82
P值<0.05
注：与正常组比较f<0.05；与模型组比较,F<0.05。

3讨论
肺癌是最为常见的恶性肿瘤[3],尽管早期诊断和手术技术的改进,还有先进的放射和化疗治疗，但仍然不能阻止这种疾病的进展。

40%的肺癌患者初步诊断时已发生淋巴结转移，确诊后5年生存率不足13%，这跟肺癌具有易发生侵袭、转移的特性有关⑷。

为寻找有效的治疗，还需要更多的研究与发现。

大量实验数据表明，肿瘤的发生与免疫功能低下有关。

CD：CD£调节性T细胞(Treg)是一类具有抑制免疫调节功能的细胞，按照其特性主要分为自然性和诱导性Treg细胞。

对机体的免疫具有负性调节的能力，由Sakaguchi等⑹首次发现并报道。

很多研究表明，CD：CD2：调节性T细胞在恶性肿瘤中通过抑制机体内的T免疫细胞、NK细胞、B细胞等功能从而使肿瘤患者发生免疫功能障碍，进而使肿瘤发生免疫逃逸。

它的数量相对增加能使恶性肿瘤患者的免疫受到抑制及肿瘤进展增快。

针对肺癌患者CD；CD2：调节性T细胞，是通过分泌抑制性细胞因子来抑制效应细胞的功能、分泌颗粒酶和穿孔素杀伤效应细胞以及干扰效应细胞的代谢功能等多种机制抑制免疫效应细胞的功能，是肿瘤免疫逃逸的关键因素之一'O
通过很多研究已经证实，多种肿瘤包括肺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、淋巴瘤等均发现CD；CD2：Treg细胞。

Cheng等⑷研究发现，晚期肺癌患者外周血中Treg细胞的表达显著高于健康对照组，但随着肿瘤的切除、体内肿瘤负荷的降低,Treg细胞在体内的表达呈下降趋势。

Wei等°〕研究发现,与癌旁组织和外周血中的Treg相比,NSCLC患者肿瘤组织内Treg 表达的共抑制分子水平最高，同时进一步验证Treg 在NSCLC患者肿瘤微环境中的作用,这都说明了机体内Treg细胞的水平与肺癌的发生、发展存在着密切联系。

Erfani等[8]的一项研究显示,Treg细胞在机体内的数量与非小细胞肺癌的病理分期存在一定的相关性，表现的分高，周血中Treg 细胞水平也就越高，同时转移者高于未转移者。

因此，下调CD；CD2：调节性T细胞将有助于提高患者机体抗肿瘤免疫效应，抑制肿瘤细胞增殖。

故针对肺癌CD：CD£调节性T细胞的研究,可为制订有效的肺癌治疗方案提供帮助。

中医药疗法在肿瘤的防治中起到一定作用，癌症的发生发展与人体的正虚邪实有关，肺癌多属于中医学的咳嗽、咯血、胸痛、肺积、痞癖等范畴。

其病机主要是正气不足，脏腑功能失调,而痰凝、湿热、瘀毒搏结为患。

而正气不足、脏腑功能失调主要是与脾肾关系密切，如《医宗必读》谓“故善为医者，必责其本，而本有先天后天之辨。

先天之本在肾……水为天之源。

后天之本在脾……土为万物之母”因此，在治疗上应健脾补肾以扶助正气，同时在此基础上加以祛邪。

以此为原则配伍组成健脾补肾解毒方治疗肺癌的复方制剂，方中生黄'、生白术、慧-仁、茯苓健脾益气，同时利湿排毒;仙茅、淫羊；、黄精等以温阳补肾益精;七叶一枝花、石上柏、石见穿清热解毒并散结以祛邪。

诸药共用，组成治疗肺癌的成方，以健脾补肾、解毒散结而抗癌。

前期的临床研究表明⑼，患者治疗后主要症状明显改善(P<0.05)，瘤灶缓解率为17.14%,Kamofsky评分提高稳定率为91.42%，1年生存率为74.29%，1.5年生存率为57.14%，年生存率为42.86%。

本研究显示，健脾补肾解毒方组与模型荷瘤组比较CD；CD=调节性T细胞比例下降，与荷瘤模型组比较，中药组、化疗组、联合组CD；CD=调节性T 细胞占CDJ的比例下降明显，因此推测健脾补肾解毒方通过下调Lewis肺癌小鼠脾脏中的CDfCD^调节性T细胞的比例来达到抑制肿瘤的作用，与化疗结合能够达到增敏作用。

因此，本研究结果显示，健脾补肾解毒方通过下调Lewis肺癌小鼠脾脏中的CD；CD£调节性T细胞的比例能达到抑制肿瘤的作用，明显改善小鼠的一般状况，提高免疫力，与前期临床实验一致，为以后临床治疗提供了依据。

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-1060-宁夏医学杂志2019年12月第41卷第12期Ningxia Med J,Dec.2019,Vol41,No.12
Doi：10.13621/j.1001-5949.2019.12.1060•论著.三维斑点追踪超声心动图定量评价成人肥厚型心肌病
早期左室心肌收缩力学变化
纳丽莎1，贾梅1，朱睿1，李晴2，周丽1，黄璇1，潘璐1
[摘要]目的应用三维斑点追踪超声心动图(3D-STE)技术定量评价成人肥厚型心肌病(HCM)患者早期左室心肌收缩应变、扭转运动功能及其同步性。

方法选取30例宁夏地区成人HCM患者为HCM组，另选性别、
年龄相匹配的30例正常人为对照组。

常规经胸超声测量室间隔舒张末期厚度(IVSD)及左室后壁舒张末期厚度
(LVPWD)、左室射血分数(LVEF)等参数;利用X5-1矩阵探头获取左室三维全容积动态图像,运用脱机软件TomTec4D LV-Analysis3.0获得左心室整体圆周应变(GCS)、左心室整体纵向应变(GLS)、左心室整体径向应变
(GRS)、左心室基底段旋转角度(Rotation-basal)、左心室心尖段旋转角度(Rotation-apical)、左心室扭转角度
(Twist)、左心室扭力(Torsion)、基底段旋转达峰时间(Pti-basal)心尖段旋转达峰时间(Pti-apical)以及整体扭
转达峰时间(Pti-twist),比较2组上述各参数之间的差异。

结果HCM组LAD、IVSD、LVPWD、EDV、ESV以及
SV值明显高于对照组(P<0.05),而LVEF值较对照组减低(P<0.05),E/A差异无统计学意义(P>0.05)；D-
GLS、3D-GCS和3D-GRS相比对照组明显减低(P<0.05)；Rotation-basal、Rotation-apical/Twist和Torsion与对
照组相比明显增加(P<0.05);Pti-basal、Pti-apical与Pti-twist较对照组减低但差异无统计学意义(P>
0.05)结论3D-STE技术可以定量、准确评价成人HCM患者早期左室心肌收缩应变、扭转运动功能及其同步
性，为临床早期诊断与及时干预治疗提供重要参考依据。

[关键词]肥厚型3肌病;3室3肌;应变；扭转；同步性；三维斑点追踪成像;超声3动图
[中图分类号]R540.4[文献标识码]A
Evaluation of the left ventricular myocardial mechanics and synchronicity by three-dimensional speckle tracking echocardiography in the adult patients with early-stage hypertrophic cardiomyopathy NA Lisha,JIA Mei,ZHU Rui,LI Qing2,Z HOU Li,H UANG Xuan,PAN Lu.1.The General Hospital of Ningxia Medical Univer­sity,Yinchuan750004,China；2.Ningxia Medical University,Yinchuan750004,China
[Abstract]Objective To evaluate the left ventricular(LV)strain,torsion functions and synchronicity by three-dimensional speckle tracking echocardiography(3D-STE)in adult patients with early-stage hypertrophic cardiomyopathy(HCM).Methods A total of30patients with early-stage HCM were enrolled.In addition,30healthy subjects were recruited as a control group.Interventric­ular septal thickness(IVSD)and left ventricular posterior wall thickness(LVPWD)left ventricular ejection fraction(LVEF)and other parameters were measured by conventional transthoracic echocardiography.Full-volume three-dimensional dynamic images were per­formed by using matrix transducer X5-1.Left ventricular basal segment rotation angle(Rotation-basal),left ventricular apical segment
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［基金项目］国家自然科学基金资助项目（1760318）
［作者单位］1•宁夏医科大学总医院心脏中心功能检查部超声心动图室，宁夏银川750004
2•宁夏医科大学，宁夏银川750004
［作者简介］纳丽莎（1966-），女,宁夏籍，主任医师，硕士研究生，从事心脏超声工作。

［网络出版地址］http：///kcms/detail/64.1008.R.20191119.
1418.040.html
(3)/78-381.
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[收稿日期]2019-08-12[责任编辑]王凯荣。