e钙粘蛋白、血管内皮生长因子表达与胆囊癌生物学特性的相关性研究

浙江大学
硕士学位论文
E钙粘蛋白、血管内皮生长因子表达与胆囊癌生物学特性的相关
性研究
姓名：***
申请学位级别：硕士
专业：外科学
指导教师：***
2001.5.1
Ｅ钙粘蛋白、血管内皮生长因子表达
与胆囊癌生物学特性的相关性研究
浙江大学医学院
９９级在职研究生陈秋强
专业外科学
导师彭淑牖教授
摘要
近年来胆囊癌发病率有明显的上升趋势，因其出现临床症状多属晚期，故疗效差，预后不佳。

国内文献报告腮囊癌总的５年生存率＜５％。

所以，如何早期发现（诊断）、治疗胆囊癌仍是一个值得深入研究的课题。

一，＾７浸润、转移是恶性肿瘤的一个重要生物学特征。

具有浸润、转移潜能的＼
肿瘤细胞通过粘附、破坏基底膜细胞外基质，才能开始浸润和转移。

因此对其肿瘤的生长、浸润、转移进行研究和评估，无疑具有深远的意义。

近年来开展的一些细胞分子生物学研究方法，已非常有效地应用于肿瘤浸润、转移及复发与机制的研究，使少数具有转移、漫润潜能的肿瘤患者能得到及时的筛选。

Ｅ钙粘蛋白（Ｅ．ｃａｄｈｅｒｉｎ，Ｅ－ｃａｄ，ＣＤＨｌ）是依赖细胞外钙的跨膜糖蛋白，具有调节细胞间的识别、粘附和组织形成，以及促使上皮细胞相互粘附的作用。

而血管内皮生长因子（Ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）是由两个亚基以二硫键相联而成的二聚体糖蛋白，是诱导肿瘤血管生成最强、最特异的生长因子，在许多肿瘤组织中有较高水平表达。

有关Ｅ．ｃａｄ和ＶＥＧＦ在腰囊癌中的表达的研究。

关论文，后者也只有两篇
甚少，检索近十年文献，前者仅有一篇相本研究收集胆囊癌、胆囊腺瘤和对照组慢性胆囊炎组织标本，应用免疫囊；，蛰臻。

蒜；，撼基
道报外／国了
甜ｌ织化学染色澎：，比较研究不同ＪｉＩ！ｉ囊疾病·Ｉ－Ｅ．ｃａｄ和ＶＥＧＦ的表达和分布的
差异，探索Ｅ．ｃａｄ和ＶＥＧＦ表达与胆囊癌的相关性。

／
、——，材料与方法
Ｌ
１、材料选择
收集浙江湖州市第…医院和浙江大学医学院附属第二医院病理科保存自１９８９年１月至２０００年１２月胆囊癌石蜡标本４１例，年龄３０岁至８５岁，平均年龄６１．８８±１２．４０岁。

胆囊腺瘤标本１４例，平均年龄５９．８６±１２．５４岁，慢性胆囊炎１０例作为对照组。

以上各病例均经苏木素。

伊红（Ｈ．Ｅ）染色切片证实。

２、试剂及免疫组织染色
本课题应用免疫组织化学染色法（ＳＰ法），选用Ｅ．ｃａｄ及ＶＥＧＦ单克隆抗体检测胆囊肿瘤组织中的表达。

操作步骤按说明书中执行。

３、统计学方法
所有统计数据均应ＳＰＳＳ１０．０ＦＯＲＷＩＮＤＯＷＳ软件包在计算机上完成，Ｅ．ｃａｄ、ＶＥＧＦ的表达与各因素之间的关系，用ｘ２检验，ｔ检验，秩和检验。

结果与讨论
１．本组慢性胆囊炎１０例标本Ｅ．ｃａｄ表达均属阳性，１４例胆囊腺瘤只有１例表达减弱。

而在胆囊癌Ｅ—ｅａｄ表达减弱或不表达者６８．２９％（２８，４１）。

胆囊腺瘤与胆囊癌二组Ｅ．ｃａｄ表达的比较有显著性差异（Ｐ＜０．０１）。

２．本组慢性胆囊炎１０例标本ＶＥＧＦ表达均属阴性，１４例胆囊腺瘤中有６例表达阳性，占４２．８６％。

而在胆囊瘸ＶＥＧＦ表达阳性者为８０．４９％（３３／４１）。

胆囊腺瘸与艟囊癌二组ＶＥＧＦ表达的比较有显著性差异（Ｐ．，ｏ．０５）。

３．胆囊腺瘤、恶性肿瘤时，性别对Ｅ－ｃａｄ、ＶＥＧＦ表达的影响，无显著性差异。

＝组年龄段的比较亦无显著性差异。

２
～．塑坚奎兰塑主兰垡丝壅４．肌囊腺瘤、肼囊癌尢淋巴转移Ｊ｝ｊ有淋巴转移嗍ｌＥ－ｃａｄ表达的比较有显兽ｔｌ：薹爿＝（Ｐ＜０、０１）。

５．胆囊腺瘸、胆囊癌无淋巴转移与有淋巴转移三组ＶＥＧＦ表达的比较有盟著性莠异（Ｐ＜０．０５）。

结论
１、Ｅ—ｃａｄ、ＶＥＧＦ表达在胆囊腺瘤与胆囊癌之ｌ、日Ｊ均有盟著性差异，有统计学意义，二者均可作为评估胆囊良、恶性肿瘤的参考指标。

２、Ｅ—ｃａｄ在胆囊腺瘤、胆囊癌无淋巴结转移及有淋巴结转移中的表达，三组比较有明显统计学意义，说明随着胆囊肿瘤恶性程度的增加，Ｅ。

ｃａｄ表达与胆囊癌呈负相关。

提示Ｅ．ｃａｄ可能是胆囊癌有、无淋巴结转移的观察指标之‘ｏ
３、ＶＥＧＦ在胆囊腺瘤、胆囊癌无淋巴结转移及有淋巴结转移中的表达，三组比较有明显统计学意义，说明ＶＥＧＦ与胆囊肿瘤的进程密切相关，它与胆囊癌呈正相关，可作为判断肿瘤预后的４、性别对Ｅ－ｅａｄ、ＶＥＧＦ表达无明显影响标。

关键词２仁＞／／
胆囊癌Ｅ钙粘蛋白娆＝ｃｊ硼面丽厂一
血管内皮生长因子免疫组织化学
指黟。

ＴｈｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎａｎｄＶａｓｃｕｌａｒＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｔｉｎＧａｌｌｂｌａｄｄｅｒＣａｒｃｉｎｏｍａＣｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈＣＩｉｎｉｃａｌＯｕｔｃｏｍｅ
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ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ．ＢｅｃａｕｓｅｔｈｅｅｌｉｎｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅｏｆｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒｃａｒｃｉｎｏｍａＯｃｃｕｒｓｉｎｔｈｅｌａｔｅｓｔａｇｅ．ｔｈｅｅ街ｃｉｅｎｃｙｏｆｔｒｅａｌｍｅｎｔｉｓＷＯｒＳｅａｎｄＳＯｄｏｅｓｔｈｅｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．ＩｔｊＳ
ｒｅｐｏｒｔｅｄｔｈａｔｔｏｔａｌｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆ５ｙｅａｒｓｏｎｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒｃａｒｃｉｎｏｍａｉｓｌｅｓｓｔｈａｎ５％．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｈｏｗｔＯｅａｒｌＹｄｉｓｃｏｖｅｒｆｄｉａｇｎｏｓｉｓ）ａｎｄｔｒｅａｔｉｔｉＳｓｔｉｌｌａｓｕｂｊｅｃｔｗｈｉｃｈｎｅｅｄｓｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙ．
ＴｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎｖａｓｉｏｎａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓａｒｅａｌｌｉｍｐｏｒｔａｎｔｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｏｆｍａｌｉｇｎａｎｔｃｅｌＩｓ．Ｉｔｈａｓｂｅｅｎｏｂｓｅｒｒｅｄｔｈａｔｉｎｉｄａｌｌｙａｆｅｗｔｕｕｌｏｒｃｅｌｌｓｉｎｐｒｉｍａｒｙｍａｌｉｇｎａｎｔｔｕｎｌｏｒａｄｈｅｒｅｄｔｏａｎｄｄｅｓｔｒｏｙｅｄｔｈｅｂａｓｅｍｅｎｔｍｅｍｂｒａｎｅ．ａｎｄｔｈｅｎｉｎｖａｄｅｄｔｈｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ．ＴｈｅｒｅｉＳｕｎｄｏｕｂｔｅｄｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒｃａｒｃｉｎｏｍａｔｏｍｅｔａｓｔａｓｉｚｅａｎｄｉｎｖａｄｅ，ａｎｄｔｏｊｕｄｇｅｔｈｅｐｒｏｇｎｏｓｉｓｏｆｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｒｅｅ地Ｂｔｌｙ，ｗｉｔｌＩｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｅｅｌｌａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｋｉｌｌ，ｓｏｍｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｓｈａｖｅｂｅｅｎｕｓｅｄｉｎｓｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｉｎｖａｓｉｏｎ，ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｏｆｍａｌｉｇｎａｎｔｔｕｍｏｒｓ．Ｉｔｉｓｏｆｇｒｅａｔｃｌｉｎｉｃａｌｖａｌｕｅｔｏｐｒｅｄｉｃｔｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｐｏｔｅｎｔｉａｌｈｉｇｈｅｒｒｉｓｋｏｆｉｎｖａｓｉｏｎｏｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．
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氯巍，矗．：囊。

，㈡。

４
ＭａｔｅｒｉａｌｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ
１．Ｓａｍｐｌｅｓ
４１ｓａｍｐｌｅｓｏｆｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒｃａｒｃｉｎｏｍａｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆｐａｔｈｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＨｕＺｈｏｕ，ａｎｄｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄ
Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．ｎ坨ａｇｅｗｆｉｓｆｒｏｍ３０ｔｏ
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ａｄｅｎｏｍａ。

ｔｈｅａｖｅｒａｇｅａｇｅｗａｓ５８．６０土１２．５４，ａｎｄ１０ｃａｓｅｓｏｆｃｈｒｏｎｉｃ
ｃｈｏｌｃｃｙｓｔｉｔｉｓｉｓａｓａｃｏｎｔｒａｓｔ．Ａｌｌｃａ鸵ｓｗｅｒｅｃｈｏｌｅｃｙｓｔｅｃｔｏｍｉｅｄａｎｄｄｉａｇｎｏｓｅｄ
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２．Ｒｅａｇｅｎｔｓ
Ａｎｔｉ－Ｅ．ｃａｄｈｅｒｉｎＭｅＡｂ，Ａｎｔｉ－ＶＥＧＦＭｃＡｂ：ＳａｎｔａｃｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｃ．
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３．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｈｅａｔｉｎｇｒｅｔｒｉｅｖｉｎｇａｎｔｉｇｅｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．
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１№ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｃａｄａｎｄＶＥ（认ｗｉｔｈｃｌｉｎｉｃ
ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃｆａｃｔｏｒｓｉｎｔｈｏｓｅｐａｔｉｅｎｔｓｗａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅＣｈｉ－ｓｑｕａｒｅｔｅｓｔ．
Ｔ－ｔｅｓｔａｎｄＫｒｕｓｋａｌ－Ｗ砒ｌｉｓｔｅｓｔ．
ＲｅｓｕｌｔｓａｎｄＤｉｓｃｕｓｓｉｏｎ
１．ｎ坨ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥ．ｃａｄｉｎ１０ｃａｓｅｓｏｆｃｈｒｏｎｉｃｃｈｏｌｅｃｙｓｔｉｔｉｓｉｓｐｏｓｉｔｉｖｅ．ＴｈｅｒｅｉｓｏｎｌｙｏｎｅｃａｓｅｔｈａｔｈａｓｒｅｄｕｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦ－ｃａｄｉｎｔｈｅ
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２．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶＥＧＦｉｎ１０ｃａｓｅｓｏｆｃｈｒｏｎｉｃｃｈｏｌｅｃｙｓｔｉｔｉｓｉｓｎｅｇａｔｉｖｅ．ＰｏｓｉｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒａｔｅｏｆｖＥＧＦｉｓ４２．８６％（６／１４）如ｂｅｎｉｇｎａｄｅｎｏｍａｔｉｓｓｕｅ
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３．１１埒ｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＥ·ｃａｄＯｒｖＥａＦａｎｄｓｅｘｓｈｏｗｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａＰ＞Ｏ．０ｓ）．Ｉｔａｌｓｏｓｈｏｗｅｄｎｏｓｉｇｎｉｆｌ＝ｍｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｉｎ
ｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅａｇｅｓｏｆｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒａｄｅｎｏｍ８ａｎｄｃａｔ＇ｃｉｎｏｍａ．
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ｃｍｃｃｉｎｏｍａｗｉｔｈｏｕｔａｎｄｗｉｔｈｌｙｍｐｈｎｏｄｅｍｅｔａｓｔａｓｉｓ田＜Ｏ．０Ｄ．
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５
ａｄｅｎｏｍａ，ｃａｒｃｉｎｏｍａｗｉｔｈｏｕｔａｎｄｗｉｔｈｌｙｍｐｈｎｏｄｅｍｅｔａｓｔａｓｉｓ（Ｐ＜０．０５）
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
１．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥ—ｃａｄａｎｄＶＥＧＦｂｅｔｈａｌｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
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２．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥ·ｃａｄｈａｓｔｈｅｓｔａｔｉｓｔｉｃｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅａｍｏｎｇｂｅｎｉｇｎ
ｔｕｍｏｒ，ｃａｒｃｉｎｏｍａｗｉｔｈｏｕｔａｎｄｗｉｔｈｌｙｍｐｈｎｏｄｅｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．ｎ地ｓｅｒｅｓｕｌｔｓ
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ｏｎｅｏｆｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓｔｏｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｃａｒｃｉｎｏｍａｗｉｔｈｏｕｔａｎｄ谢ｔｌｌｌｙｍｐｈｎｏｄｅｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．
３．１１１ｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶＥＧＦｈａｓｔｈｅｓｔａｔｉｓｔｉｃｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅａｍｏｎｇｂｅｎｉｇｎ
ｔｕｍｏｒ，ｃａｒｃｉｎｏｍａｗｉｔｈｏｕｔａｎｄｗｉｔｈｌｙｍｐｈｎｏｄｅｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．ＩｔｉｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔＶＥＧＦｉｓｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｎｎｌｏｒｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｍａｙｂｅｕｓｅｄ鹪ａ
ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｉｎｄｉｃａｔｏｒ．
４．Ｎｏｎｏｔａｂｌｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｈａｓｂｅｅｎｏｂｓｅｒｖｅｄｂｅｔｗｅｅｎｓｅｘａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆＥ－ｃａｄｏｒＶＥＯＦ．
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Ｅ—ｅａｄｈｅｒｉｎＶａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒＯ砸ＧＤ
６
浙江大学硕士学位论文Ｅ钙粘蛋白、血管内皮生长因子表达与胆囊癌生物学特性
的相关性研究
浙江大学医学院
９９级在职研究生陈秋强
专业外科学
导师彭淑牖教授
前言
胆囊癌是一种较常见的恶性肿瘤。

根据邹声泉等【１１对我国２８个省的调查，胆囊癌占胆道手术的１．３５％（３９２２／２５５２０５）。

因其早期诊断困难，手术
切除率低，预后差，故多年来～赢受到国内外学者的关注。

早期诊断和手术
切除是改善预后的关键，胆囊癌穿过胆囊粘膜肌层后，很早便可发生淋巴结
转移．所以临床上应该进一步重视研究其转移和复发的机制，以便更合理地
选择治疗方案。

转移是～个涉及肿瘤细胞一一宿主细胞一一细胞外基质之阋相互作用的多步骤的分子生物化学变化过程。

细胞粘附分子，尤其是Ｅ钙粘蛋白
（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃａｄｈｅｒｉｎ，Ｅ．ｃａｄ）在此过程中发挥着重要作用。

Ｅ—ｃａｄ是依赖细胞
外钙的跨膜蛋白，分子量为Ｉ．２４×１０５，基因定位于１６ｑ２２．１，ｅＤＮＡ全长４．８ｋｂ．
于１９９３年被克隆；人类Ｅ．ｃａｄ基因ＤＮＡ全长１００ｋｂ，含１６个外显予，于
１９９５年由Ｂｅｒｘ首先克隆翻。

Ｅ钙粘蛋白包括细胞外区，踌膜区和胞浆区三
部分，细胞外区的功能最主要，它能与钙特异结合而发挥粘附功能。

在胚胎
发育时期，Ｅ－ｃａｄ调节着细胞阃的识别、粘附和组织的形成；丽在成人组织
中，它促进上皮细胞间的相互粘附ｐ１，维持组织结构的完整性和极性。

它不１
仅是一种肿痛细胞侵袭转移抑制剂。

也是主要的正常细胞生长接触抑制
卉Ｕ。

＋Ｉ【细胞外区所含的等位龋㈧缺失或突变，即可使整个Ｅ．ｃａｄ嵌失粘附功能１４１。

近年来的研究发现，Ｅ—ｃａｄ表达和分布状况与恶性肿瘤分化程度，Ｊ腧床分期、转移发生及其预后等有密切关系【５６】。

Ｅ．ｃａｄ在肿瘤细胞中表达一般低于限常细胞，有的甚至缺失。

实体肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤间质中血管的新生，许多血管生成因子在肿瘤中均有表达，介导血管新生。

有关研究表明【７】，血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒＶＥＧＦ）是诱导肿瘤血管生成最强。

最特异的生长因子，在许多肿瘤组织中有较高水平表达。

ＶＥＧＦ相对分子量为３．４Ｘ１０４～４．５Ｘ１０４，它是由睡个相同亚基以二硫键连接的糖蛋自二聚体。

有五种不同异构体，基因位于染色体６Ｐ２１３。

ＶＥＧＦ在正常人组织和血浆渗出中呈低水平、稳定的表达，可直接或间接地参与血管新生的每一个过程，可诱导内皮细胞短暂的钙浓度升高，动态改变细胞分裂及细胞运动，影响内皮细胞的基因表达，降解基底膜，促进血管生成；它还可增加血管的通透性。

在外伤愈合，胚胎发育等ｍ供需求量增加，血管生成数增多的情况下，呈较高水平表达，而在肿瘤细胞常有过量表达。

近年来发现人类许多肿瘤中均有ＶＥＧＦ过重表达的报道嘲。

研究表明，ＶＥＧＦ与肿瘤的血管新生紧密相关，与肿瘤复发和预后紧密相关。

因此，对Ｅ－ｃａｄ，ＶＥＧＦ在胆囊癌中表达的研究，将有助于我们深入了解胆囊癌的浸润、转移的机制，指导临床诊治。

本研究应用免疫组织化学染色方法和热沸抗原修复技术检测胆囊癌和胆囊腺瘤中Ｅ．ｃａｄ、ＶＥＧＦ的表达和分布。

分析Ｅ．ｃａｄ和ＶＥＧＦ表达与胆囊癌的浸润、转移等各方面的关系，探讨Ｅ－ｃａｄ、ＶＥＧＦ的表达在胆囊癌浸润和转移过程中所起的作用，旨在从这一角度推测胆囊癌病人转移或复发的危险度，预测其预后，为正确、合理综合治疗胆囊癌提供理论依据。

Ｂ●
～■，ｒ；
材料与方法
临床和病理资料
收集浙¨湖州ｌＨ第医院和浙｝ｌ：人学医学院附属第二医院病理科保存自１９８９／ｌｉ１月垒２０００ｑ－１２月胆囊癌石蜡标本４１例，年龄３０岁至８５岁，平均年龄６１．８８±１２．４０岁，男性１１例，殳性３０例，男女之比为】：２．７．其中１１例订淋巴结转移。

胆囊腺瘤标本】４例，男性７例，女性７例，勇女之比为ｌ：１．平均年龄５９．８６±１２．５４岁，慢性胆囊炎ｌＯ例作为对照组。

以上各病例均经苏术素．伊红（Ｈ．Ｅ）染色切片证实。

实验试剂
鼠抗Ｅ．ｃａｄ及ＶＥＧＦ单克隆抗体为美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ生产技术有限公司生产。

链霉素抗￡ｌｉ物素蛋白一过氧化物酶免疫组化染色试剂盒、抗原修复液（ＥＤＴＡ）、缓冲液（ＰＢＳ液）购于北京中山生物技术有限公司。

实验仪器
１．石蜡切片机：德国Ｌｅｉｔｚ２１３５型。

２．医用电炉、冰箱、烤箱、常规试剂、Ｏｌｙｍｐｕｓ显微镜由浙医二院病理科提供。

所有照片均摄于浙江大学传染病研究所。

实■方法
免疫组织化学染色法（ＳＰ法）
１．样本：４ｌ例胆囊癌（其中１１例有淋巴结转移），１４例胆羹腺瘤，１０例慢性胆囊炎。

以．ｔ－．标本均再次经Ｈ、Ｅ染色证实。

２．方法：
（１）常规石腊切片，组织厚度为４ｉ１ｍ裱贴到涂胶后的载玻片上。

（２）将有组织的载玻片置于６００Ｃ恒温箱过夜。

（３）组织脱蜡、水化。

二甲苯Ｉ２０分钟一＞二甲苯ＩＩ】５分钟一＞无水酒精ｌＯ分钟
９
一＞９５％洒精５分钟＞７５％洒精５分钟一＞蒸馏水冲洗。

Ｌ４）饥原修复：将脱蜡后的常规组织切片置于ＥＤ７Ｉ＇Ａ液（ＰＨ值为８．０）ｔｈ｝乜炉加热令１０００ｎ热沸１０分钟石：右，关闭电源，室潺下冷却１５分钟，ＰＢＳ液（ＰＨ值为７．４０±０．２）洗５分钏，×３次。

Ｌ５）每张切片朋５０ｕ１的过氧化物酶阻断溶液（试剂Ａ），以阻断内源性过氧化物酶活性，室溢ｌ、孵育１０分钟。

ＰＢＳ液沈５分钟×３次。

擦二ＦＩ，置湿盒内。

（６）每张切片加５０ｕｌ的羊血清（试剂Ｂ），室温下孵育１０分钟，不冲洗，吸去多余的液体。

（７）加第～抗体：Ｅ—ｃａｄ、ＶＥＧＦ单抗工作液稀释滴度为ｌ：１００，分别取５０ｕ１＿一抗加于组织上，置室温下９０分钟。

阴性对照片一抗选取ＰＢＳ液５０“ｌ，余同前。

ＰＢＳ液沈５分钟×３次。

擦干，置混盒内。

（８）加第二抗体：每次切片加５０ｕｌ生物素标记的第二抗体（试剂ｃ）室温下孵育１０分钟。

ＰＢＳ液洗５分钟×３次。

擦干，置湿盒内。

（９）每张切片加５０ｐｌ链霉素一过氧化物酶溶液（试剂Ｄ），室温下孵育１０分钟。

ＰＢＳ液洗５分钟×３次。

擦干，置湿盒内。

（１０）ＤＡＢ（３，３’～二氨基联苯胺）染色：取新鲜配制的ＤＡＢ溶液，每张切片加１００ｕｌ，显微镜下观察５－－ｇ分钟，出现一定程度棕黄色后终止染色，流水冲洗１０分钟。

（１１）苏木素复染２．３分钟，盐酸酒精分化液中分化５分钟，温水孵育２分钟。

（１２）常规脱水，“．呵Ｊ苯透明、吹千。

（１３）中性树胶封片。

诊断标准：
１．阳性定位
ｌＯ
ｏ１）ｌｉ—ｃａｄ表达ｌｉ喽；ｔ１讧ｊｊ自Ｕ胞暾Ｉ？。

（２）ＶＥＧＩ＂农丛｛：要定位ｆ』细胞浆。

２．【５ｌＩ。

阵分级
（１）Ｅ．ｃａｄ表达分纵
ａ．阴’ＰＩ：（一）：所有肿瘤细胞均不表达。

ｂ．阳＋？ｔ－（＋）：Ｊ｜Ｉｌｌ瘸细胞阳性染色的强度与正常～样。

Ｃ．可疑（±）：肿瘤细胞阳性染色的强度ｔＺＪ－Ｅ常低。

ｌ卜常表达为细胞膜｝：呈棕黄色颗粒状或线状，染色强度基本一致为均质性表达，染色强度不’致为异质性表达。

Ｅ．ｃａｄ表达再根据ｓｈｉｏｚａｋｉ等‘９１介绍的方法对肿瘤细胞进行定性或半定量分类：
保留表达（ｐｒｅｓｅｒｖｅｄＥ－ｃａｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）：所有肿瘤细胞均系Ｅ－ｃａｄ（＋）。

减弱表达（ｒｅｄｕｃｅｄＥ－ｃａｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）：
异质性减弱表达（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）：肿瘤细胞染色强度不～致，呈（一）（±）或（＋）。

均质性减弱表达（Ｗｅａｋａｎｄｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）：肿瘤细胞Ｅ—ｃａｄ均呈（±）。

消失表达（１０ｓｔ）：肿瘤细胞Ｅ－ｃａｄ呈（～）。

（２）ＶＥＧＦ表达分级
参照许良中等【加】报道。

先将染色强度打分，０分为无色，１分为淡黄色，２分为棕黄色，３分为棕褐色。

再将阳性细胞所占的百分比打分：０分为阴性，１分为阳性细胞＜１０％，２分为１１％－－５０％，３分为５１％－－７５％，４分为＞７５％。

染色强度与阳性细胞百分分值的乘积＞３分为免疫组化结果（＋）。

统计学方法
各统计数据均应用ＳＰＳＳ１０．０ｆｏｒＷｉｎｄｏｗｓ软件包在计算机上完成，Ｅ—ｃａｄ、ＶＥＧＦ的表达与各因素之间的关系用ｘ２检验，ｔ检验，秩和检验。

９０８０
７０
６０
５０
４０
３０
２０
１００－＿…ｌ———－Ｖ；ｓｒ
图ＶＥＧＦ在胆囊不同疾病中的表达率
注：１慢性胆囊炎组２胆囊腺瘤组
３胆囊癌无淋巴结转移组４胆囊有淋巴结转移组
Ｅ．ｃａｄ、ＶＥＧＦ在胆囊腺瘤、胆囊癌时的表达用图表示
注：Ｘ轴左侧为胆囊腺瘤，右侧为胆囊癌
１６
７ｌ
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讨论
原发性胆囊癌居胃肠道癌的第五位㈣，手术切除是胆囊癌唯一有效的治疗。

因其没有典型的、特异的临床症状，早期确诊率低，据统计，手术时７５％的病人发现肿瘤超出了可能切除的范围，２０％的病人肿瘤已转移至邻近肝组织或肝十二指肠的淋巴结，只有１０％的病人肿瘤尚局限于胆囊。

故手术后极少获长期长存。

Ｔｏｄｏｒｏｋｉ等【１２】回顾１９７６～１９９８年１３５例行胆囊癌切除，平均随访８７０天，５年生存率为３６％。

而Ｂｅｎｏｉｓｔ等【１３ｌ从法国２５家医院收集８６例经病理确定的施行治愈性胆囊癌切除术的资料，５年生存率为２７％，而国内有的文献报告胆囊癌总的５年生存率＜５％ｆｌ“。

因此，如何从中筛选那些具有较高发生浸润、转移概率的胆囊癌病例，在临床工作中具有重要的意义。

本研究是回顾性分析胆囊腺瘤、胆囊癌中Ｅ．ｃａｄ及ＶＥＧＦ表达情况，分析二者表达与胆囊腺瘤、胆囊癌临床病理的关系，以达到上述目的。

钙粘蛋白即钙依赖性细胞粘附蛋白（ｃａｄｈｅｒｉｎ），是一组钙依赖性糖蛋白，主要介导同种细胞间的粘附反应，并起细胞骨架作用。

其粘附作用具有高度亲同源性，即表达同源性钙粘蛋白的细胞将发生粘附作用。

钙粘蛋白有三大类型【１５】：１）上皮型钙粘蛋［刍＜ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃａｄｈｃｒｉｎ，Ｅ．ＣＤ，Ｅ．ｃａｄ，ＣＤＨＩ＞：主要存在于人和动物的上皮细胞，在人局限于源自外胚层、中胚层和内胚层的上皮，是维护上皮细胞形态和结构的完整性和极性的重要分子。

２）神经型钙粘蛋白＜ｎｅｕｒａｌｃａｄｈｅｒｉｎ＞：存在予肌肉和神经细胞。

３）胎盘型钙粘蛋白＜ｐｌａｃｅｎｔａｌｃａｄｈｃｒｉｎ＞：最初发现于鼠的胎盘中，后发现同时存在于人类极少数上皮细胞中。

最近又发现一些类型的钙粘蛋白，如Ｍ．、ｖ．、Ｂ．、Ｒ－、Ｔ．ｅａｄｈｅｒｉｎ等等。

Ｅ－ｃａｄ是最重要的，也是研究最深入的一类钙粘蛋白，这是由于它与肿瘤侵袭、转移密切相关．目前对Ｅ－ｃａｄ的研究逐渐深入，已发现Ｅ－ｃａｄ表达与多种肿瘤恶性表型有很强的负相关．而ＶＥＯＦ是由两个亚基以二硫键相联而成的二聚体糖蛋白，它以特异的方式作用于血管内皮细胞，
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促使内皮细胞增殖、迁移，诱导新生血管的生成，并可显著增加微血管的通透性。

而新生血管结构薄弱、形态变异，为恶性肿瘤的侵入提供了条件Ｉ”ｌ。

肿瘤生长依赖于血管形成，大量微血管的生成是肿瘤发生和发展的基础。

研究发现ＶＥＧＦ的表达与肿瘤的侵袭、转移程度呈正相关。

本组资料显示Ｅ－ｃａｄ、ＶＥＧＦ表达在胆囊腺瘤与胆囊癌之间有显著性差异。

Ｅ—ｃａｄ在慢性胆囊炎时均表达，胆囊腺瘤时表达略有减弱（１／１４），而胆囊癌时Ｅ．ｃａｄ表达减弱或不表达占６８．２９％（２８／４１）。

胆囊腺瘤、胆囊癌无淋巴结转移与有淋巴结转移三组Ｅ．ｃａｄ表达的比较有显著性差异，说明Ｅ．ｃａｄ表达随肿瘤病人病程、恶性程度和淋巴结转移的增加而减弱，它的表达与胆囊癌呈负相关，当胆囊癌患者Ｅ．ｃａｄ表达为阴性时要特别警惕是否已有淋巴结转移。

所以，Ｅ．ｃａｄ在临床可作为胆囊癌免疫组织化学检测的一个指标。

同时，根据本研究可以推论：Ｅ－ｃａｄ表达与胆囊癌的进展密切相关，它可以作为判断胆囊癌患者预后的一个较好的指标。

Ｂｅｉｒｔｒｅｎｓ研究已发现了Ｅ．ｃａｄ的粘附功能丧失是细胞获得去分化和高侵袭性的关键所在ｆｌ７Ｊ。

１９９４年Ｋａｔａｙａｍａ等【Ｉ卅应用ＥＬＩＳＡ法成功地在肿瘤患者的外周血清中检测到可溶性Ｅ－ｃａｄ片段，血清Ｅ’ｃａｄ升高的原因，可能是肿瘸部位的蛋白酶活性高，将肿瘤细胞表面的Ｅ－ｃａｄ降解而释放血中。

由此，使Ｅ－ｏａｄ从离体标本检测到患者的外周血清中动态监测成为可能，为判断胆囊癌病人是否痊愈、转移、复发提供一条新的途径。

本组资料显示慢性胆囊炎标本ＶＥＧＦ表达均属正常，１４例胆囊腺瘤中有６例表达增强，占４２．９６％。

面在胆囊癌ＶＥＧＦ表达增强者为８０．４９％（３３／４１），它在胆囊良性肿瘤、胆囊癌中均有较高的表达，说明ＶＥ（３Ｆ表达是一项检测胆囊肿瘤较敏感的指标。

胆囊腺瘸、胆囊癌无淋巴结转移与有淋巴结转移三组ＶＥＧＦ表达的秩和检验有显著性差异，说明ｖＥＧＦ表达
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与胆囊癌呈正相关。

而胆囊癌无淋巴结转移与有淋巴结转移二组比较无统计学意义（Ｐ＞０．０５＞，可能是它在胆囊癌阶段已到高表达状态有关。

ＶＥＧＦ主要以旁分泌的方式或以肿瘤细胞自分泌方式对胆囊癌的生物学特性发挥作用。

这种自分泌方式刺激肿瘤增殖已在ＡＩＤＳ．ＫＳ细胞和黑色素细胞等被发现ｌｌ…。

ＶＥＧＦ通过选择地作用于内皮细胞上的受体产生生物学效应。

ＶＥＧＦ的受体有二种受体型酪氨酸激酶（ｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ，ＲＴＫ），分别是ＶＥＧＦＲ－１（ＦＬＴ—１）和ＶＥＧＦＲ一２【激酶嵌入结构域受体（ＫＤＲ）／ｆｍｓ．样酪氨酸激酶．１（ＦＬＫ．１）１。

二种受体均在血管内皮细胞中发现，它们传递着不同的信号，ＫＤＲ／ＦＬＫ．１主要传递细胞增殖信号。

ＶＥＧＦ表达水平反映了肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移和血管构建的水平，可作为反映胆囊癌生物学行为的一个参考指标。

同时，在未来胆囊癌的治疗中，通过阻断ＶＥＧＦ的产生或拮抗其功能，从而抑制肿瘤血管生成，达到限制肿瘤生长和转移的目的，有可能成为胆囊癌治疗最理想的途径【州。

性别在胆囊腺瘤、恶性肿瘤时对Ｅ．ｃａｄ、ＶＥＧＦ表达的影响，无显著性差异。

说明上述的各项检测项目不受性别的影响。

结论
ｌ、Ｅ．ｃａｄ、ＶＥＧＦ表达在胆囊腺瘤与胆囊癌之间均有显著性差异，有统计学意义，二者均可作为评估胆囊良、恶性肿瘤的参考指标。

２、Ｅ－ｃａｄ在胆囊腺瘸、胆囊癌无淋巴结转移及有淋巴结转移中的表达，三组比较有明显统计学意义，说明随着胆囊肿瘤恶性程度的增加，Ｅ－ｃａｄ表达与胆囊癌呈负相关。

提示Ｅ．ｃａｄ可能是胆囊癌有、无淋巴结转移的观察指标之一。

３、ＶＥＧＦ在胆囊腺瘤、胆囊癌无淋巴结转移及有淋巴结转移中的表达，三组比较有明显统计学意义，浇明ＶＥＧＦ与胆囊肿瘤的进程密切相关，它与胆囊癌呈正相关，可作为判断肿瘤预后的间接指标。

４、性别对Ｅ．ｃａｄ、ＶＥＧＦ表达无明显影响。

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血管内皮生长因子与胆囊癌
陈秋强综述彭淑牖教授审校
摘要：血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）作为一种重要的血管因子，在生物体内有广泛的生理和病理意义。

本文就ＶＥＧＦ的生物特性，在血管发生中的作用以及与胆囊癌的关系进行初步探讨。

关键词：血管内皮生长因子（Ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）胆囊癌
肿瘤血管在胆囊癌的发生、浸润、转移中有重要影响。

在已发现的许多肿瘤血管形成因子中，血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）是作用强，特异性高的血管生长因子之一。

研究ＶＥＧＦ在胆囊癌中的作用对提高胆囊癌的诊治有重要意义。

一、ＶＥＧＦ的生物特性、表达及生物学功能
血管内皮生长因子＜Ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｅｔｏｒ，ＶＥＧＦ＞是１９８９年Ｆｅｒｒａｒａ等在牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先纯化出来的蛋白质，随后在其它细胞也纯化出了ＶＥＧＦ。

它是内皮细胞的特异性有丝分裂原，也是一种有效的血管形成和血管通透性诱导因子【¨。

ＶＥＧＦ相对分子量为３．４Ｘ１０４～４．ｓｘ１０＇，是由两对链间二硫键＜Ｃｙｓ５１－５１’，Ｃｙｓ６０．６０．＞共价连接的反平行同型二聚体【２】。

该二聚体由同一Ｎ端而其他区域有某些差异的两条多肽链组成。

ＶＥＧＦ是胱氨酸结生长因子＜ｃｙｓｔｉｎｅｋｎｏｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ＞超家族一员。

该超家族的所有成员均是二聚体生长因子，根据序列的同源性可再分成４个独立的家族，即血小板源性生长因子＜ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＰＤＧＦ＞家族、转化生长因子＜ｔ伽＇ａｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｔ，ＴＯＦ＞家族、神经生长因子＜ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｅｔｏｒ，ＮＧＦ＞家族和人绒毛膜促性腺激素＜ｈｕｍａｎ
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ｃｈｏｒｉｏｎｉｃｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ，ＨＣＧ＞家族．。

ＶＥＧＦ与血小板源性生长因子的Ａ、Ｂ链分别有１５％和１８％同源性。

目前发现ＶＥＧＦ基因位于染色体６Ｐ２１３，单一基因，１４ｋｂ，该基因经过转录水平的剪切，可产生５种不同的转录子，分别编码ＶＥＧＦ）２）、ＶＥＧＦ）４５、ＶＥＧＦⅢ、ＶＥＧＦｍ和ＶＥＧＦ２０，。

五种异构体之间的重要生物特性区别在于他们与细胞表面和细胞外基质中肝素的亲和力不同，ＶＥＧＦｌ２ｌ为可溶性分泌蛋白，与肝素、细胞外基质无亲和力。

ＶＥＧＦｌ４５、ＶＥＧＦｌ６５对肝素有亲和力，５０％以可溶性形式分泌到细胞外，余下的部分和细胞膜或基膜上含有肝素及硫酸乙酰肝素的蛋白多糖紧密结合。

ＶＥＧＦＩ静、ＶＥＧＦ２０６对肝素亲和力强，为不溶性蛋白，几乎完全与细胞和细胞外基质结合，它们的体内活性比ＶＥＧＦｌ２ｌ、ＶＥＧＦｌ６５要弱。

ＶＥＧＦ２嘶基因目前仅在人胎肝ｅＤＮＡ文库中发现。

ＶＥＧＦ作为内皮细胞的特异性有丝分裂原在血管发生和形成过程中起着主要的调控作用。

血管的产生有两种不同的机制，血管发生＜ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ＞和血管形成＜ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ＞。

前者出现在胚胎发育中；后者指由己存在的血管内皮细胞通过出芽方式形成新的毛细血管，这个过程不仅出现在胚胎发育中，而且出现在出生后创伤愈合、组织器官的生长以及子宫内膜周期性血管生长中。

ＶＥＧＦ在正常人组织和血浆渗出中里低水平，稳定的表达１３１。

在外伤愈合、胚胎发育和增殖期子宫内膜，这些啦供需求量增加，血管生成数增多的情况下，ＶＥＯＦ呈较高水平表达。

而在肿瘤细胞，ＶＥＧＦｍＲＮＡ及其蛋白均有过量表达。

ＶＥＦＯ的表达以ＶＥＧＦｌ２ｌ、ＶＥＧＦｔ６５为主，多集中在肿瘤血管周围。

ＶＥＧＦｌ４ｓ只限于生殖器来源的细胞１４１。

ＶＥＧＦ２０６在血管化组织中高表达。

ＶＥＧＦ通过选择地作用于内皮细胞上的受体产生生物学效应。

ＶＥＧＦ的受体有二种受体型酪氨酸激酶（他ｃｅｐ时ｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ，ＲＴＫ），分别是ＶＥＧＦＲ－１（ＦＬＴ－１＞和ＶＥＧＦＲ－２【激酶嵌入结构域受体＜ＫＤＲ）／ｆｉｎｓ．样酪氨
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酸激酶一】（ＦＬＫ一】）１ｏ二种受体均在血管内皮细胞中发现，它们传递着不同的信号，ＶＥＧＦＲ一２主要传递细胞增殖信号。

ＶＥＧＦＲ一１仅存在于淋巴管内皮细胞中。

ＶＥＧＦ表达调节较复杂。

缺氧是上调ＶＥＧＦ表达的主要原因，缺氧是诱导ＶＥＧＦ及其受体产生的最有效因素。

缺氧对ＶＥＧＦ影响因不同器官细胞而异１５１。

近年发现一些细胞因子上调ＶＥＧＦ表达，而ＩＬ．１０，ＩＬ．１３抑制ＶＥＧＦ的释放。

ＰＫＣ信号传导系统对ＶＥＧＦ的表达起重要作用。

缺氧使ＶＥＧＦ受体转录增强，缺氧增强ＦＬＴ．１，Ｉ（】）阱ＬＫ一】的作用被认为是间接作用，也许是因为缺氧使ＶＥＧＦ表达上调，而ＶＥＧＦ能使ＦＬＴ．１，ＦＬＫ．１表达上调【６ｌ。

出现Ｋ．ｒａ￥和Ｈ．ｒａｓ突变的肿瘤细胞可以上调ＶＥＧＦ转录，而肿瘤抑制基因ＶＨＬ的蛋白产物却能下调ＶＥＧＦ的合成【７】。

ＶＥＧＦ最先发现有促进血管通透作用是组胺的５万倍，后发现ｖＥＧＦ能诱导血管形成“小窗”ｔｓ］和内皮小囊泡（ＶｅｓｉｃｕｌｏＶａｃｕｏｌａｒＯｒｇａｎｄｉｅｓＶＶＯ）１９］。

ＶＥＧＦ通过“ＶＶＯ”和“小窗”的形成，为肿瘤细胞提供营养物质。

ＶＥＧＦ特异性地亲和于内皮细胞受体，为一种选择性的内皮细胞致分裂原，诱导细胞分裂、增殖、迁移。

同时改变内皮细胞的基因表达，增加组织因子，一些蛋白酶如间质胶原蛋白酶和基质降解蛋白等，最后形成肿瘤血管，使肿瘤病灶的氧供由弥散改为灌注，为肿瘤细胞的生长提供氧、营养并排泄分解代谢产物。

肿瘤血管形成使肿瘤细胞可通过血管开启的胶原裂隙侵袭，血管形成为恶性肿瘤细胞进入血道转移发生远处转移创造条件。

二、ＶＥＧＦ与肿瘤
新生血管形成是肿瘤生长必须，也是肿瘤转移的基础之一。

而．Ⅵ’ＧＦ在肿瘤新生血管形成中超重要作用。

其发展会刺激Ⅵ粥Ｆ过量表达，而ＶＥＧＦ表达又促进肿瘤的发展。

通过研究发现ＶＥＧＦ在肝脏肿瘤、肺癌、喉癌、鼻咽癌、直肠癌等均有高表达。

在淋巴漫润、远处转移的肿瘤中，其生存率比较有显著的意义。

已有相当直接的证据表明癌的增殖和转移是血管新生依。