TCB7-1+低温生物学技术

低温生物学技术Cryopreservation TechniquesThe healthy baby boy, from 21-year-old sperm, is thought to be the world’s first instance of long-term freezing ending in a live birth.Dr. Elizabeth Pease, a consultant in reproductive medicine at the Manchester hospital, said the development is "important because we believe this is the longest period of sperm cryopreservation resulting in a live birth so far reported in thescientific literature".Stem cell cryopreservation第一节低温生物学⏹低温生物学（Cryobiology）是探索在低温条件下生命现象特征、规律以及生物体保存的一门科学，是随着生物学、物理学和工程技术的深入发展和其间的相互渗透而产生的一门新兴的边缘学科。

⏹目前，这门学科的主要研究对象是生命的低温保存与延续。

⏹低温指的是冰点以下，低温生命冻存是指在-80 ºC （干冰温度）～-196 ºC（液氮温度）下保存生命的结构。

⏹低温生物学的发展，大约可追溯到1949年Polge成功地用低温保存了精子。

⏹六十年代初Mazar建立了低温生物研究模型和低温生物学会。

⏹七十年代以来物理学和工程专业人员开始进入低温生物学领域，大大加速了这门学科的发展。

⏹低温生物学在医学、生物学、优生学、农林牧渔业、商业、国防、空间利用、极地开发、高山考察以及稀有动物、植物良种的保存和繁衍等领域中，均有重要而广泛的意义。

低温生物学研究的主要内容1. 低温医学中冷损伤，冷冻治癌，移植器官，骨髓、组织和细胞的低温保存，低温优生和计划生育技术以及低温技术在医学其它方面的应用。

2. 低温在良种家畜，珍稀动、植物，种子繁衍和优生、优选方面的研究和应用。

3. 食品保鲜和冷藏。

4. 冬眠和整体生命的低温保存与延续。

5. 低温在军事、空间和南、北极地开发方面的研究。

6. 低温生物工程和仪器的研制与创新。

Major areas of study in cryobiology At least 6 major areas of study in cryobiology can be identified:⏹Study of cold-adaptation of microorganisms, plants(= cold hardiness耐寒力), invertebrates, and animals(= hibernation冬眠).⏹Cryopreservation of cells, tissues, gametes, and embryos of animal andhuman origin for (medical) purposes of long-term storage. This usually requires the addition of substances which protect the cells during freezing and thawing (cryoprotectants冷冻保护剂).⏹Preservation of organs under hypothermic conditions for transplantation.⏹Lyophilization (freeze-drying) of pharmaceuticals.⏹Cryosurgery, a (minimally) invasive approach for the destruction ofunhealthy tissue using cryogenic gases/fluids.⏹Physics of supercooling, ice nucleation/growth and mechanical engineeringaspects of heat transfer during cooling and warming.概括起来，低温生物学技术主要是生物样品的低温保存，低温下细胞生物特性的基础研究，以及低温生物工程技术和仪器的开发研制。

第二节低温生物学技术一、低温生物学技术中的几个关键问题（一）低温损伤的机制多年来人们一直注意和利用低温生物学中的两个对立现象。

在某些条件下低温可产生严重损伤、杀死生物，而在另一些条件下低温又可长期保存生物，不致于死亡。

前者发展成为低温外科以杀灭癌细胞等，后者则发展成为一系列低温冻存技术。

无论发展低温生物学技术的哪一方面，都首先面对着低温如何损伤、杀死细胞这一问题。

对低温损伤机制的研究工作不少，但难度大、涉及面广，目前尚无一致见解。

低温损伤不仅取决于温度，而且还取决于降温和复温的速度与条件以及生物样品的种类。

在冰点以下降温和复温过程中总会发生结冰、融冰，胞内外溶液浓缩或稀释，水通过胞膜向胞内或胞外渗透等现象，在某些情况下还会出现冰的再结晶，这些都和细胞直接损伤相关。

最新实验表明，快速急冻过程中胞内冰晶虽然有害，若复温适当细胞尚能存活，但是复温中胞内的重结晶却是致命的。

此外尚有许多种损伤机制的学说：如冷冻使电解质和溶质的浓度升高，形成“溶质损伤”而损伤细胞器和线粒体膜；冷冻使细胞的所有结构和大分子失去结构水而致死；以及“双重因素”即胞内冰晶的形成和溶质损伤共同决定冻存细胞的存活等假说。

a b c细胞外冰晶形成: a 正常细胞；b 细胞外冰晶形成；c 细胞外呈高渗，细胞脱水细胞内冰晶形成: a 正常细a b c胞；b 细胞内冰晶形成；c 细胞内结冰，细胞死亡（二）影响低温冻存的主要因素⏹影响冻存效果的因素很多，诸如抗冻剂、储存温度、生物样品的性质、培养液体积以及降温和升温的方法、速度等等。

⏹其中最主要的是抗冻剂的使用、储存温度、降温和复温的程序和速度。

1．抗冻剂：抗冻剂是生物低温冻存时必须添加的保护剂，能保护生物细胞抵抗冷冻损伤。

目前低温保存的所有生物材料，几乎都用了抗冻剂。

关于抗冻剂的保护机制，学说颇多，尚无定论。

抗冻剂可大致分为：渗透性和非渗透性两类⏹渗透性抗冻剂有甘油、二甲基亚砜（DMSO）、甲醇、乙二醇、乙酰胺等⏹非渗透性抗冻剂有聚乙烯吡咯烷酮、聚L-醇和羟淀粉等抗冻剂往往添加在细胞培养液中，不同的细胞要使用不同的抗冻剂。

保存精子常用4～9％甘油，而保存胚胎却需要1.5 M DMSO。

同一种组织、细胞以不同程序冷冻，往往需要不同浓度的抗冻剂。

如快速冻存红细胞需用10～20％甘油，而慢速冻存则需要40～80％甘油作保护剂。

⏹许多抗冻剂在低温下能保护细胞，但在常温下却对细胞和机体有害，因此在细胞复苏后，要及时妥善地洗除抗冻剂。

⏹要取得最佳低温冻存效果，必须首先通过实验，找出保存该生物样品的最佳抗冻剂和最适浓度。

2. 储存温度：虽然曾有人成功地将红细胞储存在接近绝对零度的-272ºC，但是从实际和效果来看-196ºC即液氮温度是大多数生物样品的最佳储存温度。

人红细胞在液氮中储存12年未发生明显的生化、生理改变。

如果操作程序适当，一般生物样品在-196ºC均可储存数十年。

用-70ºC～-80ºC即干冰温度冻存活标本，短时间保存还可以，但是效果不及液氮。

应用冰点至-40ºC保存标本的效果不好，细胞存活率低、保存时间短。

3．降温程序和速度：由于降温的快慢直接关系到细胞内外结冰的先后、溶液渗透的方向、细胞内外的溶液浓度、细胞形态以及复温过程，因而降温程序和速度直接影响着低温冻存效果。

目前多采用“分段降温法”和“连续程序控制降温法”。

分段降温是利用不同温级的冰箱或液氮储存罐，将活细胞、活组织在不同温度段分段降温冷却。

例如：从室温降至4℃再降至-40℃，-80℃，-96℃；也可从室温降至0℃，再经-80℃，直至-196℃液氮温度保存。

各温度段所经时间视细胞和组织的类型而定。

连续程序控制降温法是用计算机程序控制降温装置或其它各种人控降温装置将液氮的气、液按一定的降温速度从室温连续降至-196 ℃，前者简易、经济、效果较好，后者降温精细、可控、宜于研究和筛选出最佳条件。

降温可大致分为快速冷却和慢速冷却。

前者每分钟约降温100～1000℃，后者每分钟降0.1～1℃，但这只是人为的划分。

确切地说，每种细胞所需冷却的速度与其胞内外的热平衡时间、细胞的性质、特别是胞膜的渗透率有关，因此每种细胞组织都有其最佳冷却速度。

例如：冻存红细胞的最佳冷却速度约为-100℃/分，而造血干细胞则是-1℃/分。

若以-10℃/分的速度降温，对红细胞为慢速，对造血干细胞则是快速。

快速冷却过程中，胞内溶液快速降温结冰，浓度增高，细胞体积不变。

⏹目前认为，快速冷冻所造成的细胞损伤不是由于胞内结冰，而是由于复温过程中胞内冰的再结晶。

再结晶主要是在冰点至-40℃温度段形成的。

在冻存实践中要特别注意该温度段。

⏹慢速冷冻过程常使胞外溶液先结冰，溶液浓度升高，胞内自由水及时经胞膜外渗，细胞收缩。

此时的损伤主要是由于胞外高浓度溶液对细胞较长时间的损害，称为“溶质损伤”。

因此，选择和使用该生物样品的最适冷却速度是十分重要的。

4．冷冻标本的复温：七十年代以前，人们特别重视细胞、组织的冷却降温速度与存活的关系。

七十年代中期以后才逐渐意识到冻存后的复温过程对存活率也有很大影响。

一般来说，复温是生物降温冷却的逆过程，复温快慢也会影响到细胞内外的热平衡、溶液渗透方向和溶液浓度。

若细胞外复温快，胞外冰融化，溶液浓度降低，水分从胞外经胞膜渗入细胞，使细胞膨胀。

复温的程序和速度取决于细胞和组织的类型、原冷却时的速度、储存温度、储存时间和抗冻培养液等条件。

实验表明，缓慢复温至-50℃左右再保存1～2天或者继续迅速复温，对细胞的存活率没有明显的影响。

若缓慢复温至-35℃以上，再保存或迅速复温，则效果很差，会有较大冰晶的再形成，细胞存活率降低。

就目前冷冻保存的细胞来说，最佳复温速度普遍较冷却速度快，多在每分钟复温25℃和50℃以上，但因细胞种类而异。

快速复温中的困难在于冻存物内外复温的不平衡。

为此，有人探索用微波使冻存物内部升温。

5．加强低温生物工程的研究和应用：低温生物学这一边缘学科若没有先进的低温仪器、设备和技术手段是很难普及和深入发展的。