分子生物学实验常用工具酶总结

现代分子生物学实验手册工具酶基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。

核心：对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组DNA。

工具酶：在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。

一、限制性内切酶（restriction endonuclease）主要功能：对外源性的双链DNA进行切割、水解，不允许外源性DNA存在于细菌自身细胞内。

（这种酶能对在自身细胞内存在的DNA种类给予限制——限制性内切酶）限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的DNA不受酶的切割，这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA 原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。

保护自身遗传物质稳定的机制。

限制性内切酶：从原核生物中发现的，约600种，可识别108种不同的特定DNA顺序。

以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5’端为P，3’端为- OH。

命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母(小写)+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号）例：细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称Arthrobacter luteus Alu I Escherichia coli RY13Eco R IH Ham H IBacillus amyloliquefaciensHaemophilus influenzae Rd Hin d III（一）三种常用内切酶1. I型限制性内切酶同时兼有切割DNA的功能和修饰酶的修饰功能。

在酶的识别位点上，若DNA两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能，对DNA进行切割，同时转变成ATP酶。

若DNA双链中有一条链已发生甲基化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条DNA进行甲基化修饰，然后在行切割功能。

（实际上，有内切酶、修饰酶、ATP酶及解旋酶四种功能）I型限制性内切酶在DNA链上的识别位点和切割位点不一致，也不固定。

没有时间应用价值。

【DNA甲基化：DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现（外遗传机制）。

多发生于CpG二核苷序列上（在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸中的胞嘧啶被选择性添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶）。

甲基化位点可随DNA的复制而遗传（DNA复制后，甲基化酶可将新和成的未甲基化的位点进行甲基化）。

DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化，使DNA 失去限制性内切酶的切割位点，以及DNA 酶的敏感位点，使染色质高度螺旋化，凝缩成团，失去转录活性。

】2. III型限制性内切酶具有内切酶和甲基化修饰酶作用。

具有专一的识别顺序，其切割位点在识别顺序旁边的几个核苷酸对的固定位置上。

（可识别短的不对称序列，切割位点与识别序列约距24~26bp）3.II型限制性内切酶也具有限制-修饰系统，但由限制酶和修饰酶这两种不同的酶共同来执行这一系统的功能。

即II型限制性内切酶有在识别位点的切割功能，而不具备甲基化修饰活性，修饰作用由相应的修饰酶完成。

两种酶识别同一DNA特定序列，却发挥不同作用。

能识别双链DNA的特异顺序，并在该顺序内的固定位置上进行切割，产生特异的DNA片段。

II型限制性内切酶的识别位点和切割位点是专一和固定的，对相同的基因片段的切割，总是得到同样核苷酸顺序的小DNA片段。

这些切割后的不同大小的DNA片段，可以与统一内切酶切割后的来源不同的其他DNA片段实行连接，而构建重组DNA。

——基因工程技术的核心II型限制性内切酶识别的专一核苷酸顺序，最常见的是4~6个碱基对。

II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序（反转重复顺序），具有180°的旋转对称性。

识别顺序有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方面读序都是相同的。

这类酶切割DNA可有两种形式。

①交错切割方式：每种酶切割后个产生两个DNA片段，每一个片段个含有一个单链末端，单链末端是互补的，可以通过形成“氢键”而黏合。

不同来源的两条DNA片段经同一种酶切割后，产生互补的黏性末端，通过选择合适的DNA链接，可将两条异源性DNA片段组合在一起。

——重组DNA的最基本原理用选择专一性不同而产生相同黏性末端的两种酶切割两条不同的DNA片段，可使重组后的DNA片段不再被原来的酶所切割。

如：Sal I酶切割后产生的黏性末端，Xho I酶切割后产生的黏性末端，两者经连接酶连接产生的序列，既不被Sal I酶切割，也不被Xho I酶切割。

<在质粒改造上很有用>②在同一位置上切割DNA双链，产生平头末端。

如：（二）其他类型内切酶1.同工酶（Boschizomer）：来源不同的两种II型内切酶，它们识别核苷酸顺序及切割位点都相同，差别只在于当识别核苷酸序列中有甲基化的核苷酸时，一种内切酶可以切割，而另一种不能。

如：Hpa II和Msp I识别顺序都是5’···CCGG···3’，若其中有5-甲基胞嘧啶，则只有Msp酶可切割（GGmCC）。

2.Subset酶：识别顺序及切割位点相互有关的酶，互称Subset酶。

如：Sam I酶所识别的6个核苷酸顺序中含有Hpa II酶识别的4个核苷酸顺序。

所以这两个酶可以相互代替使用，它们所切割的DNA片段可以相互连接。

3.可变酶（特殊的）：识别核苷酸顺序一般都大于6个，但其中一个或几个核苷酸时可以变化的。

4.远距离切割酶：识别核苷酸顺序的位置与切割的位点不一致，一般切割位点与指标核苷酸顺序的位置之间有10个左右核苷酸的距离。

与I型内切酶相似，不过I型内切酶识别位点与切割位点的距离更远一些。

（三）甲基化酶（不属于内切酶）使识别顺序中的某个核苷酸发生甲基化，保护DNA不被限制性内切酶切开。

M5C（5-甲基胞嘧啶）大多数以M5CpG的形式存在，即CpG岛中的C最容易是甲基化的底物，而甲基化又与受之调控的基因的表达程度有关。

因此，研究CpG岛的甲基化是研究基因调控的一个重要方向。

当甲基化酶和限制性内切酶共同使用时，常常可以使有多个识别位点的内切酶只对其中一个识别位点有切割效果，其他位点因被甲基化酶修饰而不能被切割。

如：限制性内切酶AvaⅠ的识别顺序是Py可以是任何一种嘧啶，pu可以是任何一种嘌呤。

因此可以有4种识别顺序。

如果同时使用甲基化酶TaqⅠ和甲基化酶HpaⅡ，则AvaⅠ的识别顺序将只是5’……CCCGAG……3’。

如上图，一个基因片段被Ava I酶切割时，片段中有三个Ava I酶识别顺序，该片段被切割成4个片段。

但若先用Taq I甲基化酶和Hpa II甲基化酶作用该片段时，片段中某些核苷酸发生甲基化修饰而不能被切割，再用Ava I酶切割时，只能被切割成两个片段。

【一甲基化酶对DNA的某位点进行甲基化修饰，进而抵御内切酶的切割——构建重组质粒】（四）与内切酶相关的几个概念1.酶活性单位及标准反应体系酶活性单位：在一定温度、PH及离子强度下，1h内完全酶解（切割）特定底物DNA，所需限制内切酶的量。

（底物DNA：多用λ噬菌体DNA。

又是可以用某一种酶在λ噬菌体DNA上的切割位点，来推算用这种酶切割这种DNA时所需的活性单位。

）标准反应体系：在50μl反应体系及指定温度下，使用特定的缓冲体系，用1个活性单位的限制内切酶，酶解1μg底物DNA反应1个小时。

（若底物比1μg多或少，可参照标准体系比例增加或减少酶用量。

但增加酶用量时，需注意不可加量过多——内切酶中通常含有甘油防冻剂，加入酶量过多，其中的甘油会降低内切酶识别顺序的特异性。

也可通过延长反应时间来保证完全的酶切。

）2.星号活力限制性内切酶在非标准反应条件下，切割一些与特异性识别顺序相类似的顺序活性（该酶的第二活性）。

（产生许多不想得到的片段；内切酶的识别切割能力下降，识别特异性下降。

）引起星号活力的因素：①过高的甘油含量（>5%）；②低盐离子强度（<25mmol/L）；③高PH值（8.0）；④含有有机溶剂；⑤含有非Mg二价离子；⑥酶量过大（酶解1μg底物DNA用的内切酶大于100个活性单位）。

3.限制性内切酶底物位点优势效应限制性内切酶对同一DNA片段切割时，在对其可以识别的位点上表现出不同的切割速率的现象。

4.限制性内切酶质量①有良好的酶活性；②不存在任何其他核酸内切酶和外切酶的污染；③长时间的酶切反应不发生识别顺序特异性的降低；④被某一酶切割后的DNA经重新连接后，仍能被同一酶再次识别并再次切割。

内切酶质量的鉴定：50μl反应体系中以等量内切酶分别以1h和12h（过夜）时间来切割底物DNA，用凝胶电泳检查酶切结果。

若不出现条带数目的差别，则内切酶质量好。

在T4DNA连接酶作用下，重新连接被内切酶切割后的DNA片段，再用同一酶切割，若所产生的DNA片段的大小和数目和第一次切割的结果完全一样，则说明酶的质量好。

——可鉴定是否混有其他内切酶和磷酸脂酶（DNA被内切酶切割后，只有各个片段的3’OH和5’P基团完好才能再次连接，连接的DNA 仍能提供同一酶的相同切割位点，才会出现上面所说的两个完全相同的结果。

）二、DNA重组常用的其他酶类（一）DNA聚合酶（DNA polymerase）将一个脱氧三磷酸核苷酸加到引物（primer）的3’-OH上，再释放出一个焦磷酸分子（ppi）。

1.大肠杆菌DNA聚合酶（E coli DNApolymerase）聚合酶I、II、III聚合酶I、II主要参与DNA修复，III主要参与DNA复制。

三种都有沿模板按5’→3’方向合成互补DNA链的活性和按3’→5’向的外切酶活性。

聚合酶I还有5’→3’向的外切酶活性。

①5’→3’聚合酶活性：填补DNA链上的缺口，或参与修复DNA合成过程中切除RNA引物后留下的空缺部分。

②3’→5’外切酶活性：消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。

③5’→3’外切酶活性：切除受损的DNA 部分Klenow 酶：大肠杆菌DNA 聚合酶I （109000Da ）经舒替兰酶（枯草杆菌蛋白酶）水解获得的76000Da 片段。

具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。

可用于填补DNA 单链末端成为双链。

可用于合成cDNA 第二链。

<若将单核苷酸标记放射性核素，则可是合成的DNA 双链上带上放射性核素标记。

可用此酶通过切口平移来进行探针的放射性核素标记>【切口平移：切口产生3‘羟基和5’磷酸基团，DNA 延伸合成3‘端，5’端被小片段降解，缺口位点沿着双链向3‘端移动，是在体外向DNA 分子引入放射性标记核苷酸的技术。