第二章 基因工程载体和工具酶
工具酶和基因载体
的DNA自我/同步复制
(2)具有标记基因
(3) 具有若干限制酶的单一识别位点
(4) 具有较高的外源DNA的载装能力
常见的基因工程载体
包括质粒载体、 噬菌体类载体等。
(1)质粒载体
质粒的一般生物学特性
质粒DNA
质粒DNA的复制类型
质粒载体的构建及重要的质粒载体
(2)DNA连接酶
• DNA连接酶的定义
能将两段DNA拼接起来的酶称为DNA连接酶。该 酶催化DNA相邻的5‘磷酸基团和3’羟基末端之间形成 磷酸二酯键，将DNA单链缺口封合起来。
OH PBiblioteka 5‘…G-C-T- C-T-G-C-A G-G-A-G…3’ 3‘…C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C…5’
弛型）。
2.质粒载体的构建及重要的质粒载体
(1)重组体分子的转化存在三种可能性
(1)没有转化进宿主细胞
(2)质粒发生自身环化，没有重组成功（空载质粒） (3)重组成功（重组质粒）
无抗性 质粒的克隆位点 位于抗菌素标记之外
无抗性
有抗性 有抗性
质粒的克隆位点 位于抗菌素标记之内
有抗性
无抗性
克隆位点
克隆位点
碱性磷酸酶的脱磷酸作用阻止线性的质粒DNA分子再环化
• 平末端DNA片段的连接
基因克隆实验中，常用的平末端DNA片段的连接法，主要有同聚物加尾法、接头连 接法等。
(1)同聚物加尾法
同聚物加尾法是利用互补的同聚物序列之间的退火作用完成的连接。其核心部分是， 利用末端脱氧核苷酸转移酶（能够在无模板链的情况下，将核苷酸加到DNA分子单链延 伸末端的3‘-OH基团上）转移核苷酸的特殊功能。
《工具酶和基因载体》课件
04
工具酶与基因载体的未来发展
工具酶的未来发展方向
高效化
随着基因编辑技术的不断发展， 对工具酶的效率和特异性要求越 来越高，未来的工具酶将更加高
效、精准。
多样化
目前工具酶主要集中在限制性核酸 酶、逆转录酶和DNA聚合酶等方 面，未来将会有更多种类的工具酶 被发现和应用。
定向进化
定向进化技术可以通过对酶的基因 进行突变和筛选，获得具有更高活 性和稳定性的新酶，为工具酶的发 展提供新的途径。
02
基因载体的概述
基因载体的定义与分类
基因载体定义
基因载体是一种能够携带外源DNA进入细胞，并实现外源DNA在细胞内稳定表 达的分子工具。
基因载体分类
根据性质和应用，基因载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体主要 包括质粒、噬菌体、反转录病毒等，非病毒载体包括纳米颗粒、脂质体、基因枪 等。
感谢观看
工具酶的应用领域
总结词
工具酶在基因工程、生物制药、遗传学研究等领域具有广泛的应用价值。
详细描述
工具酶在多个领域具有广泛的应用价值。在基因工程领域，工具酶可用于构建基因表达载体、基因克隆和基因敲 除等实验。在生物制药领域，工具酶可用于药物筛选和蛋白质表达纯化等过程。在遗传学研究领域，工具酶可用 于基因组测序和基因功能研究等实验。
T4 DNA连接酶
用于切割DNA，产生特定的粘性末端 或平末端，以便将外源DNA片段插入 到载体中。
连接两个DNA片段，产生重组DNA分 子。
DNA聚合酶
在DNA复制过程中，将单个脱氧核苷 酸添加到已存在的DNA链的末端，同 时需要引物。
基因载体在工具酶中的应用
质粒载体
作为复制子，在宿主细胞内大量 复制，为限制性核酸内切酶和 DNA聚合酶提供作用场所。
HXY-第二章-基因工程的载体和工具酶1
44
（5）pBR322的优点 ① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择：
没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
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外源基因BamH I Amp中存活
但在Tet中死亡
外源基因Pst I Tet中存活
但在Amp中死亡
温度低（低于37 oC），拷贝数很少； 温度增加（>40 oC）时，拷贝数会很快增 加到1000个以上。
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（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
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（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
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iii）卡那霉素（kanamycin，Kan） a）杀菌原理 通过与70S核糖体结合，导致mRNA发 生错读。杀死细菌。
b）细菌抗性原理 Kanr 编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对 卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结 合作用。
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iv）链霉素（Streptomycin，Str） a）杀菌原理 通过与30S核糖体亚基结合，导致 mRNA错译。杀死细菌。
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① 表达载体的结构
1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS
2）大肠杆菌操纵子元件
阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。
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重要的质粒载体 pBR322 pUC18/19
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基因工程载体及工具酶
基因工程载体及其工具酶前言随着基因工程在生物医药等领域的快速发展，基因工程载体和工具酶的研究显得越发重要，下面将对基因工程载体和工具酶进行概述关键字：基因工程载体工具酶一：基因工程载体载体是指运载外源DNA有效的进入受体细胞内的工具。
载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独立进行自我复制的遗传因子。
作为载体必须满足的条件：①有多种限制性内切酶的切点，但每一种酶最好只有一个切点；②外源DNA插入以后载体在受体细胞中自我复制；③有便于选择的标记基因；④具有促进外源DNA表达的调控区。
质粒载体质粒是在许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子。
它是闭合环状双链DNA 分子，大小1kb到200kb不等。
能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同一组酶系。
有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长是有利的。
质粒的复制分松弛型和严谨型两种。
松弛型质粒是指质粒的复制跟细菌染色体的复制不同步，一般在一个菌体内能复制10-200拷贝；严谨型质粒是指质粒复制跟细菌染色体同步，一般含有1-10拷贝。
一、质粒的基本特性1．质粒的复制通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。
在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和θ复制。
在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1质粒或 ColE1质粒的复制起始位点。
2．质粒的拷贝数质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。
严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。
3．质粒的不相容性两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA限制系统时出现的现象。
不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。
两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。
《基因工程的工具——酶与载体》 教学设计
《基因工程的工具——酶与载体》教学设计一、教学目标1、知识目标（1）简述基因工程中常用的工具酶的种类和作用。
（2）理解载体的作用和必备条件。
（3）掌握基因工程中常用载体的种类和特点。
2、能力目标（1）通过对酶和载体相关知识的学习，培养学生的分析和归纳能力。
（2）通过对载体构建过程的探讨，培养学生的逻辑思维和创新能力。
3、情感目标（1）感受基因工程技术的神奇，激发学生对生物科学的兴趣。
（2）培养学生的科学态度和合作精神。
二、教学重难点1、教学重点（1）基因工程中常用工具酶的作用。
（2）载体的作用和必备条件。
2、教学难点（1）限制酶的作用特点和切割结果。
（2）载体的构建和选择。
三、教学方法讲授法、讨论法、直观演示法四、教学过程1、导入新课通过展示一些基因工程应用的实例，如转基因作物、基因治疗等，引发学生对基因工程的兴趣，从而引出基因工程的工具这一主题。
2、讲授新课（1）工具酶①限制酶介绍限制酶的来源和作用，通过图片和动画展示限制酶切割 DNA 的过程，强调限制酶的识别序列和切割位点的特点。
举例说明不同的限制酶切割产生的黏性末端或平末端。
组织学生讨论限制酶在基因工程中的重要性。
② DNA 连接酶讲解 DNA 连接酶的作用，即连接被限制酶切割后产生的黏性末端或平末端，形成重组 DNA 分子。
比较 DNA 连接酶和 DNA 聚合酶的异同，帮助学生加深理解。
（2）载体①载体的作用阐述载体在基因工程中的作用，如携带目的基因进入受体细胞、在受体细胞中稳定存在并表达等。
②载体的必备条件引导学生思考并总结载体需要具备的条件，如能够自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因等。
③常用载体的种类和特点介绍基因工程中常用的载体，如质粒、噬菌体衍生物、动植物病毒等，分别讲解它们的特点和应用。
3、课堂练习通过一些相关的练习题，巩固学生对工具酶和载体的理解和掌握。
4、小组讨论组织学生分组讨论以下问题：如何选择合适的工具酶和载体进行基因工程操作？5、课堂总结回顾本节课的主要内容，包括工具酶的种类和作用、载体的作用和必备条件以及常用载体的种类和特点。
基因工程-第二章--基因克隆所需的工具酶
常用限 制性内 切酶种 类及特 性
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
6、限制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下，限制酶识别顺序的 特异性可能发生变化，结果一种限制酶 酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位点， 得到不同的酶切片断，这就是限制酶的 星号活性（ activity） 星号活性（star activity） EcoR 1 GAATTC---- AATT
第二章 基因克隆所需的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 限制性内切酶 DNA甲基化酶 甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 DNA甲基化酶 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸酶 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸聚合酶 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸连接酶 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 核酸末端修饰酶 其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等 其它酶类
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 识别４ １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN； NGATCN；AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC； GGATCC；PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC N’ N N N CCGG N N’N’N’N’ CCGG Fok I 5 -ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 5’-ＧＧＡＴＧ( )93’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 -ＣＣＴＡＣ( )13- 外侧，产生５ 起 富含ＧＣ ２）富含ＧＣ
2.2 基因工程的载体和工具酶
● 质粒的基本特征
■ 质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制， 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系， 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为 两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝
■ 质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能 同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相 容性。
5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’
3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’
5’NNNNNG 3’NNNNNCTTAAp
pAATTCNNNNNN3' GNNNNNN5’
EcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）
5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘
3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘
自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增
大肠杆菌的 l 噬菌体DNA
λ噬菌体载体相对于质粒载体来 -DNA载体的构建：缩短长度
野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当
插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌 体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野
属名-种名-株名-发现次序
限制性核酸内切酶的命名
属名 种名 株名
嗜血流感杆菌d株
Haemophilus influenzae d
H i n d III
EcoRⅠ的识别序列
5’- GAATTC-3’ 3’- CTTAAG -5’
HaeⅠ的识别序列
5’- GTTAAC-3’
3’- CAATTG -5’
基因工程知识点全
第一章基因工程概述1.什么是基因工程,基因工程的基本流程基因工程Genetic engineering原称遗传工程;从狭义上讲,基因工程是指将一种或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体受体内,使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状;因此,供体、受体和载体称为基因工程的三大要素;1.分离目的基因2.限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养5.选择、筛选含目的基因的克隆6.培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件➢具有对受体细胞的可转移性或亲和性;➢具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点;➢具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点;➢具有合适的筛选标记;➢分子量小,拷贝数多;➢具有安全性;2. 质粒载体有什么特征,有哪些主要类型1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3. 质粒的构建1删除不必要的 DNA 区域,尽量缩小质粒的分子量,以提高外源 DNA 片段的装载量;一般来说,大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定;2灭活某些质粒的编码基因,如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因,杜绝重组质粒扩散污染环境,保证 DNA 重组实验的安全,同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因,提高质粒的拷贝数3加入易于识别的选择标记基因,最好是双重或多重标记,便于检测含有重组质粒的受体细胞;4在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列,即多克隆接头Polylinker,便于多种外源基因的重组,同时删除重复的酶切位点,使其单一化,以便环状质粒分子经酶处理后,只在一处断裂,保证外源基因的准确插入;5根据外源基因克隆的不同要求,分别加装特殊的基因表达调控元件;4. 什么是人工染色体载体将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起,即可构成染色体载体5. 什么是穿梭载体人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体;6.入-噬菌体载体及构建-DNA为线状双链DNA分子,长度为,在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端;➢1缩短长度提高外源 DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点➢引入单一的多酶切位点接头序列,增加外源DNA片段克隆的可操作性➢灭活某些与裂解周期有关基因;➢使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌,以避免可能出现的污染现象的发生;➢加装选择标记,便于重组体的检测单链噬菌体DNA载体➢过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口;➢引入合适的选择性标记基因,如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列lacZ’的乳糖操纵子片段lac、组氨酸操纵子片段his以及抗生素抗性基因等;➢将人工合成的多克隆位点接头片段插在 lacZ’标记基因内部,使得含有重组子的噬菌斑呈白色,而只含有载体 DNA 的混浊噬菌斑呈蓝色;➢4在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的 DNA 测序引物序列,使得重组 DNA 分子的单链形式经分离纯化后,可直接进行测序反应;8. II类限制性内切核酸酶的特点限制性核酸内切酶 Restriction endonucleases是一类能在特异位点上催化双链DNA 分子的断裂,产生相应的限制性片段的核酸水解酶;➢识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点,通常是由4、5或6核苷酸组成的特定序列靶序列;➢识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构,即双链的核苷酸顺序呈回文结构;➢切割位点的规范性：双链DNA被酶切后,分布在两条链上的切割位点旋转对称可形成粘性末端或平末端的DNA分子;同位酶：一部分酶识别相同的序列,但切点不同,这些酶称为同位酶;同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶同尾酶Isocandamers：识别位点不同,但切出的 DNA 片段具有相同的末端序列,这些酶称为同尾酶;9.甲基化酶Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴,甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同,并在识别序列内使某位碱基甲基化,从而封闭该酶切口;甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时,却产生出另一种酶的切口➢甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列,从而使DNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割;➢甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点;连接酶连接作用的特点:①DNA连接酶需要一条DNA链的3’末端有一个游离的羟基-OH,另一条DNA链的5’末端有一个磷酸基-P的情况下,只有在这种情况下,才能发挥连接DNA分子的作用;②只有当3’－OH和5’－P彼此相邻,并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时,DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键;③DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子,被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分;④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口nick,而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口gap;⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应,因此,DNA连接酶在进行连接反应时,还需要提供一种能源分子NAD＋或ATP11.大肠杆菌 DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用DNA聚合酶作用的特点：➢要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA;➢接受模板指导;➢需要有引物3’羟基的存在;➢不能起始合成新的DNA链;➢催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端;➢催化DNA的合成方向是5’→3’;Klenow酶的基本性质：➢大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶;分子量为76kDa;➢Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和5’→3’的核酸外切酶活性,但失去了5’→3’的核酸外切酶活性;Klenow酶的基本用途：➢修复由限制性核酸内切酶造成的 3’凹端,使之成为平头末端;➢以含有同位素的脱氧核苷酸为底物,对DNA片段进行标记;➢用于催化 cDNA 第二链的合成;➢用于双脱氧末端终止法测定 DNA 的序列;聚合酶T4-DNA聚合酶酶的基本特性：➢有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性;➢在无dNTP时,可以从任何3’-OH端外切;➢在只有一种dNTP时,外切至互补核苷酸;➢在四种dNTP均存在时,聚合活性占主导地位;T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端13. 影响连接效率的因素有：➢温度最主要的因素离子浓度➢ATP的浓度 10μM - 1μM➢连接酶浓度平末端较粘性末端要求高➢反应时间通常连接过夜➢插入片段和载体片段的摩尔比➢DNA末端性质➢DNA片段的大小14.如何将不同DNA分子末端进行连接1.相同粘性末端的连接如果外源DNA与载体DNA均用相同的限制性内切酶切割,则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解,两种DNA分子均含有相同的粘性末端,因此混合后能顺利的连接成一个重组DNA分子 2.平头末端的连接T4-DNA连接酶在ATP和高浓度酶的条件下,能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子,但平末端连接效率不高,基因操作不经常采用;3.不用粘性末端的连接3’端的粘性末端用T4-DNA聚合酶切平5’端的粘性末端用klenow酶补平,或者用S1核酸酶切平最后用T4-DNA连接酶进行平末端连接15. 碱性磷酸酶有什么作用1.该酶用于载体 DNA的5’末端除磷操作,以提高重组效率；2.用于外源DNA片段的5’端除磷,则可有效防止外源 DNA 片段之间的连接;16. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用➢给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾;➢DNA片段3’末端的同位素标记;17. 2、细菌转化的步骤：∙感受态的形成;感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类,负责转化因子的结合、切割及加工;感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子,其功能是与细胞表面受体结合,诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质如细菌溶素的合成,使细菌胞壁部分溶解,局部暴露出细胞膜上的 DNA 结合蛋白和核酸酶等;∙转化因子的结合;受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合,单链DNA或RNA双链RNA以及DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上;∙转化因子的吸收;双链 DNA 分子与结合蛋白作用后,激活邻近的核酸酶,一条链被降解,而另一条链则被吸收到受体菌中;∙整合复合物前体的形成;进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合,形成整合复合物前体结构,它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解,并将其引导至受体菌染色体DNA处;∙转化因子单链DNA的整合;供体单链DNA片段通过同源重组,置换受体染色体DNA的同源区域,形成异源杂合双链 DNA结构;+诱导转化原理：①在0℃的Cacl2低渗溶液中,细菌细胞发生膨胀,同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态;②Ca2+能与加入的DNA分子结合,形成抗DNA酶DNase的羟基-磷酸钙复合物,并黏附在细菌细胞膜的外表面上;当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时,细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,并随之出现许多间隙,为DNA分子提供了进入细胞的通道;③Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用,因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞,可以提高DNA的转化效率;∙但该法要求条件高,对外界污染物极为敏感,通常很少采用;介导细菌的原生质体转化∙PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构, 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合;20.电穿孔法是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲,在质膜上形成纳米大小的微孔,DNA直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中,这种方法称为电穿孔法;P52 接合转化,入噬菌体感染未归纳21.转化率的影响因素.载体及重组DNA方面载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞,其转化率不同;载体的空间构象：与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体; 插入片段大小：对质粒载体而言,插入片段越大,转化效率越低;重组DNA分子的浓度和纯度受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配转化操作的影响22.转化细胞的扩增转化细胞的扩增操作：指转化完成之后细胞的短时间培养;在实验时,扩增操作往往与转化操作偶联在一起,如：∙Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时∙原生质体转化后的再生过程∙λ噬菌体转染后的30℃培养等,均属扩增操作扩增操作的目的∙增殖转化细胞,使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序;∙扩增和表达载体分子上的标记基因,便于筛选;∙表达外源基因,便于筛选和鉴定;23.抗药性筛选法这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法;抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcs抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Tc的平板上在Ap平板上生长,但在Tc平板上不长的转化子即为重组子 P56抗药性标记插入失活选择法∙经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子,也含有不需要的非重组子;为了进一步筛选出重组子,可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选;如果外源基因插入在载体的抗药性基因中间使得该抗药性基因失活,这种抗药性标记就会消失,从而筛选出阳性重组子;24. 什么是蓝白斑筛选法这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体;主要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β—半乳糖苷酶的基因片段,携带有lac基因片段的λ载体转入lac的宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷X-gal平板上形成浅蓝色的噬菌斑;外源基因插人lac或lac基因部分被取代后,重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力,转入lac-宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷 X-gal平板上形成白色的噬菌斑,非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑;筛选法利用合适的引物,以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR,通过对PCR产物的电泳分析,确定目的基因是否插入到载体中;由于在载体DNA分子中,外源DNA插入位点的两侧序列多数是已知的,可以设计合成相应的PCR引物,以待鉴定的转化子或重组子的DNA为模板进行PCR反应,反应产物经琼脂糖凝胶电泳,若出现特异性扩增DNA带,并且其分子量同预期的一致,则可确定含此重组DNA分子的重组子是期待的重组子;第三章基因工程的常规技术1. 探针有哪些类型探针标记有哪些方法类型：同源或部分同源探针cDNA探针人工合成的寡核苷酸探针标记方法：①5’端标记法②反转录标记法③缺刻前移标记法④ABC标记法4.什么是ABC荧光显色酶标记法ABC 标记法;∙A为Avidin生物素抗性蛋白,每个Avidin分子可结合3 - 4个生物素分子；∙B为Biotin生物素,每个Biotin分子可结合2个Avidin分子；∙C为Complex,首先将Biotin共价结合在探针分子上,荧光胺标记在Avidin上,两者形成复合物,即可将荧光胺标记在探针上,发出的荧光也能使普通胶片感光;如果将某一生色酶接在Avidin上,并辅以合适底物,则杂交反应还可直接以颜色反应检测,这一技术称为酶标技术5.亚克隆法∙亚克隆：是将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆;∙一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后,将所得各片段分别重组到载体上再转化宿主细胞,然后通过转化细胞的表型鉴定或鉴定,获得含有目的基因的重组子;此时,该重组分子中的无关DNA区域以被大量删除;6. 菌落嗜菌斑原位杂交的基本原理、流程∙该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA 暴露出来并与滤膜原位结合再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列菌落;∙操作步骤：∙①菌落生长∙②转移到NC膜上∙③DNA释放和变性∙变成单链DNA：∙ 10％SDS NaOH∙④中和 Tris-HCl pH∙⑤固定 80 ℃ 120’∙⑥杂交包括预杂交,加探针DNA杂交∙⑦放射自显影∙⑧对照比较,选出重组克隆7.鸟枪法∙鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的 DNA 片段,分别连接到载体 DNA上,转化受体细胞,形成一套重组克隆,从中筛选出含有目的基因的期望重组子;鸟枪法制备目的基因的主要步骤∙①目的基因组DNA片段的制备超声波处理：片段长度均一,大小可控,平头末端;原核生物的基因长度大都在2Kb以内,真核生物的基因长度变化很大,最大的基因可达100Kb以上;全酶切：片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开,大小不可控;部分酶切：片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整;∙②DNA片段与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体;∙③重组DNA分子导入受体细胞如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达的受体细胞;∙④筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法筛选模型的建立;∙⑤目的基因的定位利用鸟枪法获得的期望重组子只是含有目的基因的 DNA 片段,必须通过次级克隆或插入灭活,在已克隆的 DNA 片段上准确定位目的基因,然后对目的基因进行序列分析,搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列;法酶促逆转录主要用于合成分子质量较大,转录产物mRNA易分离的目的基因;这种方法以目的基因的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下合成互补的DNA,即cDNA,然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段,与适当的载体重组后转入受体菌扩增,获得目的基因的cDNA克隆; 的分离纯化绝大多数的真核生物mRNA在其3’端都存在一个多聚腺苷酸的尾巴,利用它可以迅速的将mRNA从细胞总的混合物中分离出来,将寡聚脱氧胸腺嘧啶共价交联在纤维素分子上,制成亲和层析柱,然后将细胞总的RNA混合物上层析柱分离,mRNA会挂在层析住上,后洗脱即可分离10. 简述PCR技术的基本原理,PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物;过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火复性：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链;重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板;每完成一个循环需2～4分钟, 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍;11. 什么是基因组文库其构建方法是怎样的是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中,以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因,这种保存基因遗传信息的材料,就称为基因文库又称DNA文库;基因组文库构建的一般步骤①载体的选择和制备;②高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取;③基因组 DNA 的部分酶切与分级分离;④载体与DNA片段的连接;⑤转化或侵染宿主细胞;⑥筛选鉴定基因组及保存;12. 基因组DNA文库的质量标准除了尽可能高的完备性外,一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：∙重组克隆的总数不宜过大,以减轻筛选工作的压力∙载体的装载量最好大于基因的长度,避免基因被分隔克隆;∙克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域,以利于克隆排序;∙克隆片段易于从载体分子上完整卸下;∙重组克隆能稳定保存、扩增、筛选;基因文库的构建通常采用鸟枪法和cDNA法13.外源DNA片段的切割原则片段之间要有一定的重叠序列片段大小要均一文库构建的步骤∙细胞总RNA的提取和mRNA的分离∙第一链cDNA合成∙第二链cDNA合成∙双链cDNA的分级分离∙双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖∙重组体的筛选与鉴定第四章基因在大肠杆菌、酵母的高效表达1. 启动子∙启动子：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始转录的序列,其大小在20～300个碱基,是控制基因转录的重要调控元件;在一定条件下mRNA的合成速率与启动子的强弱密切相关,而转录又在很大程度上影响基因的表达;∙启动子的特征：①序列特异性②方向性③位置特性④种属特异性2.启动子类型∙组成型启动子：是指在该类启动子控制下,结构基因的表达大体恒定在一定水平上,在不同组织、部位表达水平没有明显差异;∙组织特异启动子：又称器官特异性启动子;在这类启动子调控下,基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达,并表现出发育调节的特性;∙诱导型启动子：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下,该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平;目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等;3.终止子终止子：是位于结构基因下游的一段DNA序列,基因转录时,该序列被转录为mRNA的一部分,并形成特殊的二级结构,由此终止基因的转录;序列SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序,它可以与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补,形成氢键结合,有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始5.密码子不同生物对密码子的偏爱性1.生物体基因组中的碱基含量2.密码子与反密码子的相互作用的自由能3.细胞内tRNA的含量6. 密码子偏爱性对外源基因表达的影响∙由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性,因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择;一般而言,有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：∙外源基因全合成∙同步表达相关tRNA编码基因7. 包涵体及其性质在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体8. 包涵体的形成机理∙①折叠状态的蛋白质集聚作用;∙②非折叠状态的蛋白质集聚作用∙③蛋白折叠中间体的集聚作用;9. 包涵体的分离检测∙包涵体的分离主要包括菌体破碎、离心收集以及清洗三大操作步骤;10. 分泌型目的蛋白表达系统的构建∙包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外,但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白细菌素分泌到培养基中,这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白,它激活定位于内膜上的磷酸酯酶A,导致细菌内外膜的通透性增大∙因此,只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞;此时,用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞,并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录,则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌;11融合蛋白表达质粒的构建原则：∙受体细胞的结构基因能高效表达,且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化;。
第二章基因工程的载体和工具酶
第二章基因工程的载体和工具酶第一节载体引言基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于“载体〞及其“寄主细胞〞来实现。
作为基因克隆的载体必须具备以下特性：⑴载体必须是复制子。
⑵具有适宜的筛选标记，便于重组子的筛选。
⑶具备多克隆位点〔MCS〕，便于外源基因插入。
⑷自身分子量较小，拷贝数高。
⑸在宿主细胞内稳定性高。
一、质粒载体〔一〕质粒的生物学特性〔1〕质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状(少数为线形和RNA〕DNA 分子。
广泛从在于细菌细胞中，比病毒更简单。
在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。
大肠杆菌的质粒主要有F质粒〔F因子〕、R质粒〔抗药性因子〕和Col质粒〔大肠杆菌素因子〕三种。
〔2〕质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的到达200kb。
〔3〕质粒的生存在寄主细胞中“友好〞地“借居〞，离开了寄主它本身无法复制；同时质粒往往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。
〔4〕质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。
据拷贝数将质粒分为两种复制型：“严紧型〞质粒〔stigent plasmid〕,拷贝数为1-3；“松弛型〞质粒〔relaxed plasmid〕,拷贝数为10-60。
不过即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变化。
〔5〕质粒的不亲和性两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。
载体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。
⑹质粒的转移转移性质粒，含有tra基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。
非转移性质粒，不含tra基因；可以为转移性质粒所带动转移。
〔7〕质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种，〔二〕质粒DNA的制备有多种别离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。
工具酶和基因载体PPT课件
P-C-T-G-G-A-G … 3’ OH-G-A-C-C-T-C … 5’
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
DNA连接酶的基本性质
连接酶连接缺口DNA的最佳反应温度是37℃。但 在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不 稳定的。
P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
OH-G-C-T-C … 5’
Klenow
dATP dTTP
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
Klenow酶的基本用途：
补平由限制性内切酶切割DNA产生的3’凹端 用P32 dNTP补平3’凹端 对带3’突出端DNA进行末端标记 cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链 在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA 应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序
1.补平由核酸内切酶产生的3’凹端
5‘ … G-C-T-G-OH
② 5’末端标记
凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行 32P标记。
凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多 聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘 性末端。
③ 补平成平齐末端
粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。
PvuII等产生的平头末端
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
5’-GGATCT-3’ Bgl Ⅱ 3’-CCTAGA-5’
《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单
《基因工程的工具——酶与载体》知识清单基因工程作为现代生物技术的核心领域之一，为人类带来了前所未有的机遇和挑战。
而在基因工程中，酶和载体是至关重要的工具，它们就像是工匠手中的精巧工具，帮助我们实现对基因的精确操作和转移。
一、基因工程中的酶1、限制性内切酶限制性内切酶，也被称为“分子剪刀”，是基因工程中最重要的工具酶之一。
它能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点将 DNA 分子切断。
这种特性使得我们能够从复杂的 DNA 分子中切取特定的基因片段。
不同的限制性内切酶识别的序列不同，这为基因工程的操作提供了丰富的选择。
限制性内切酶的作用就像是一把精准的剪刀，能够在 DNA 这个长长的“绳子”上剪出我们需要的特定片段。
比如，EcoRI 能识别GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切断 DNA 双链。
2、 DNA 连接酶当我们用限制性内切酶切下所需的基因片段后，需要将它们与其他DNA 片段连接起来，这时候就轮到 DNA 连接酶发挥作用了。
DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起，形成一个完整的 DNA 分子。
想象一下，DNA 连接酶就像是一个“胶水”，把被剪开的 DNA 片段重新粘在一起，使它们成为一个连续的整体。
3、 DNA 聚合酶在基因工程中，DNA 聚合酶常用于 DNA 的复制和扩增。
例如，PCR（聚合酶链式反应）技术就依赖于耐高温的 Taq DNA 聚合酶。
通过 PCR 技术，我们可以在体外大量扩增特定的 DNA 片段，为后续的实验和应用提供足够的材料。
4、反转录酶反转录酶能够以 RNA 为模板合成互补的 DNA（cDNA）。
这在获取真核生物的基因时非常有用，因为真核生物的基因中含有内含子，而通过反转录得到的 cDNA 不含内含子，更便于在原核生物中表达。
二、基因工程中的载体1、质粒质粒是一种存在于细菌细胞质中的小型环状 DNA 分子。
它具有自主复制能力，可以在细菌细胞内独立存在和复制。
第二章基因工程中常用的工具酶
第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA 分子的特异切割分子的特异切割DNA 甲基化酶—用于DNA 分子的甲基化分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA 和RNA 的连接的连接核酸聚合酶—用于DNA 和RNA 的合成的合成核酸酶—用于DNA 和RNA 的非特异性切割的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA 和RNA 的末端修饰的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
§2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
双链结构的核酸内切酶。
到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。
种以上不同的核酸内切限制酶。
核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一 、限制修饰系统的种类（图）限制修饰系统的种类（图）二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II 型限制酶。
型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
例如：Hin d Ⅲ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae ，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
表示分离到的第三个限制酶。
Eco RI RI——Escherichia coli RI RI Hin d Ⅲ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA 分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp 的地方可以随机地切割DNA 分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。
第二章基因工程操作的工具酶10315-精品文档83页
CGCATCG-OH E.coli DNA pol I
GCG
Mg2+ dNTP
CGC GCG
ATCG
校正作用。
c、5’ ---3’外切酶活性 CGCATTAG E.coli DNA pol I
CATTAG
GCGTAATC Mg2+
GCGTAATC
(2).Klenow酶：也称DNA聚合酶I大片段， Klenow片段或K1enow聚合酶。只是从 DNA聚合酶I全酶中去除了5’ --3’外切酶活 性。
• -GAGCTTCGA- -ACAAG- - CCGTTCGA- - ATGA-
•
混合退火
• -G G C A A G C T T G T T C-
• -C C G T T C G A A C A A G-
• 切口
b、不匹配末端连接
• -AAGCTT-
-TCTAGA-
• -TTCGAA- -
AGATCT
•
HindIII
Xba I
• -A
CTAGA-
• -TTCGA
T
•
Klenow酶填补
• -AAG
CTAGA-
• -TTCGA
TCT-
•
-AAGCTAGA-
•
-TTCGATCT-
C.平末端连接
• -AAGCCCGGGTCG- - GGAGGTTAACCT-
• -TTCGGGCCCAGC持续合成能力最强的酶。 • 具有很强的对单链和双链DNA的3’—5’外切
•
SmaI酶切
AAGCCC-OH P-GGGTCG- - GGAGGTT-OH P-AACCT
TTCGGG-P OH-CCCAGC- - CCTCCAA-P OH-TTGGA-
《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单
《基因工程的工具——酶与载体》知识清单一、基因工程简介基因工程，又称为重组 DNA 技术，是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
它是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，而实现这一技术的关键就在于一系列特殊的工具，其中酶和载体起着至关重要的作用。
二、基因工程中的酶1、限制性核酸内切酶（限制酶）限制酶是能够识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开的酶。
限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割 DNA 分子。
例如，EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切断磷酸二酯键。
限制酶切割DNA 分子产生的末端有两种类型：黏性末端和平末端。
黏性末端是指被限制酶切开的 DNA 双链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对；平末端则是指切口平整，不带有伸出的核苷酸。
2、 DNA 连接酶DNA 连接酶的作用是将两个具有相同末端（如黏性末端或平末端）的 DNA 片段连接起来，形成一个完整的 DNA 分子。
DNA 连接酶与限制酶的作用相反，它通过催化磷酸二酯键的形成，将断开的 DNA 片段重新连接起来。
3、 DNA 聚合酶在基因工程中，DNA 聚合酶常用于 DNA 片段的扩增，如 PCR 技术（聚合酶链式反应）。
PCR 技术中使用的热稳定 DNA 聚合酶（Taq 酶）能够在高温环境下保持活性，不断地将脱氧核苷酸加到引物的 3'端，使 DNA 链得以延伸。
4、反转录酶反转录酶能够以 RNA 为模板合成互补的 DNA 链，即 cDNA。
这在获取目的基因时非常有用，例如从真核生物细胞中提取出mRNA，然后通过反转录酶合成 cDNA，再进行后续的基因操作。
三、基因工程中的载体1、载体的作用载体在基因工程中主要起到运输目的基因的作用，它能够将目的基因导入到受体细胞中，并使其在受体细胞中稳定存在和表达。
《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单
《基因工程的工具——酶与载体》知识清单一、基因工程简介基因工程，又称基因拼接技术或 DNA 重组技术，是指按照人们的意愿，将一种生物的基因在体外进行改造和重新组合，然后导入另一种生物的细胞内，使其能够表达并产生新的性状或产物的技术。
这项技术的出现，为人类解决许多问题提供了新的途径和方法。
二、酶在基因工程中的作用1、限制性核酸内切酶（简称限制酶）限制酶是基因工程中最重要的工具酶之一。
它能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割 DNA 分子。
例如，EcoRⅠ限制酶能够识别 GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切断磷酸二酯键。
限制酶的作用就像是一把“分子剪刀”，能够将 DNA 剪成不同的片段，为后续的基因重组提供材料。
不同的限制酶识别的核苷酸序列不同，切割位点也不同。
这使得我们可以根据需要选择合适的限制酶来切割 DNA。
2、 DNA 连接酶在基因工程中，将切割后的 DNA 片段连接起来需要用到 DNA 连接酶。
DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起，形成一个完整的 DNA 分子。
DNA 连接酶的作用就像是“胶水”，将断开的 DNA 链条重新连接起来，保证基因的完整性和稳定性。
3、反转录酶反转录酶在基因工程中也有着重要的作用。
它能够以 RNA 为模板合成 DNA，这一过程被称为反转录。
例如，在获取目的基因时，如果我们只有相应的 mRNA，就可以利用反转录酶合成与之互补的 DNA 链，即 cDNA。
4、聚合酶聚合酶在基因工程中的应用也非常广泛。
例如，在 PCR 技术（聚合酶链式反应）中，DNA 聚合酶能够在体外快速大量地扩增特定的DNA 片段。
三、载体在基因工程中的作用载体是基因工程中用于携带目的基因进入受体细胞的工具。
常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等。
1、质粒质粒是一种存在于细菌等微生物细胞中的小型环状 DNA 分子。
它具有自主复制能力，能够在细胞内独立地进行复制和遗传。
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l - DNA
尾部合成基因
CCCGCCGCTGGA 5’ 3’ COS
λ-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点
野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点， 不利于重组操作，必须删除至1 - 2个 同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增 加一些单一的酶切位点 除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增 加酶位点
Apr
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI
lacZ’
pUC18
2.7 kb
ori
质粒DNA提取的策略
质粒DNA的提取
细菌细胞破碎----碱使染色体DNA变性-----离心分离------收集质粒DNA----纯化------保存
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI
重组子：
lacZ’
2.7 kb + 4.0 kb
pUC18
2.7 kb
Apr ori
非重组子： 2.7 kb
DNA片段大小检测
1.0 kb 0.8 kb
全酶解图谱法：
4.0 kb
P
B
用EcoRI酶切转化子质粒DNA 目的重组子： 3.0 kb + 3.7 kb 或者： 1.0 kb + 5.7 kb 用PstI酶切转化子质粒DNA 目的重组子： 3.2 kb + 3.5 kb 或者： 0.8 kb + 5.9 kb
第二章
基因工程载体和工具酶
第一节 载体
载体的功能及特征
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
克隆载体应具备的条件
具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 具有与特定受体细胞相适应的复制位点整合位点 具有较高的外源DNA的装载能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有合适的筛选标记
质粒DNA沉淀
二倍体积的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的终含量占
67%左右。室温静置30分钟。
乙醇沉淀时，加NaAc or NaCl至终浓度为0· 1-0· 25M，是
为了中和DNA分子在碱性条件下所带的负电荷，减少DNA
分子同性电荷的相斥力。
0· 6倍体积的异丙醇沉淀，-20°C半小时。
DNA分离
YAC的构建
酵 母 人 工 染 色 体 的 应 用
克隆载体的发展历史：
第一代：环状质粒，装载几个到十几个kb片段; 第二代：经过改建的病毒，装载能力２０kb左右; 第三代：cosmid,装载能力30-40kb; 第四代: YAC, 装载能力1-2 Mb; 第 五代: 新型载体: BAC, PAC, MAC, Fosmid 等,装载能力 80-200kb
EB与DNA
DNA大小测量
凝胶上与标准分子量比较 λHindIII 100bp ladder 自己的marker
在紫外透射仪下看DNA时，DNA亮度与哪些因素有 关？
DNA浓度 DNA大小 波长 纯度 EB量等有关
DNA电泳结果分析
2. λ噬菌体
λ 噬菌体DNA 是线性双链DNA分子，48.5kb 噬菌体λ粒子，DNA线性双链，带有12bp的粘性末端，称为cos位点。 噬菌体感染细菌以后，双链DNA分子通过COS位点成环状
酵母人工染色体（YAC）
YAC载体应含有下列元件：
酵母染色体的端粒序列
TRP1
ARS1
CEN4
EcoRI
酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记
ori TEL BamHI TEL Apr pYAC4 URA3
YAC载体的装载量为350 - 400 kb
在pBR322基础上改建，增加了一个多接头 （polylinker），即增加了多克隆位点。 全长 3.8 kb
Plasmid plink 322
pUC 质粒(University of California)
pUC 质粒 是由大肠杆菌 pBR322 质粒 而成的双链DNA质粒载体
与M13 噬菌体改建
第二章
基因工程载体和工 具酶
湖南师范大学生命科学学院 袁婺洲
本章目录
2.1 载体 2.1.1 质粒载体 2.1.2 噬菌体载体 2.1.3 其他载体 2.2 工具酶 2.2.1 限制性核酸内切酶 2.2.2 DNA聚合酶和Klenow大片段 2.2.3 DNA连接酶 2.2.4 碱性磷酸酶 2.2.5 末端脱氧核苷酸转移酶
(一)插入型载体
在Charon4 载体中克隆 外源DNA
3. M13单链噬菌体
M13噬菌体的生物学特性： 生物结构
M13噬菌体的外型呈丝状 M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成 M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 M13 DNA全长6407个核苷酸 M13 DNA上至少有10个基因
1978年由Collins和 Hohn改建 正常的质粒与噬菌体的cos位点构成 有Amp，Tet 抗性基因 Cos位点可识别噬菌体的外壳蛋白，可被包装
柯斯质粒（cosmid）的结构
BamHI Tcr
SalI
Apr
PstI
1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段 装载范围为31 - 45 kb
5.人工微小染色体
YAC, yeast artificial chromosome BAC, bacteria artificial chromosome PAC, P1 artificial chromosome MAC,mammal cell artificial chromosome Fosmid, F因子 改建 而来
空转化子是蓝色。
Plasmid pUC 18/pUC 19 结构
改建质粒的要求：
尽可能使质粒缩小，以便插入更大的外源DNA片段； 增加多种酶切位点； 增加标记基因； 提高外源DNA的表达水平； 增加质粒在受体细胞中的拷贝数
转化子的筛选方法
遗传标记筛选（载体与目的基因本身） DNA片段大小检测
真核细胞DNA的提取
研磨使细胞破碎-----蛋白酶K去核蛋白----分离蛋白质与DNA------纯化----沉淀------纯度检测
质粒DNA的纯化
RNA酶去RNA SDS-蛋白复合物 蛋白酶K去蛋白质 酚-氯仿抽提 纯化试剂盒 紫外分光光度计测A260与A280值：1· 8 或2· 0
核酸分子杂交
目的基因表达产物检测
pBR322 质 粒 克 隆 外 源 基 因 的 过 程
载体遗传标记检测
抗药性筛选法
将外源DNA片段插在EcoRI位点：
EcoR I Cla I Hind III Pst I BamH I Apr
非重组子呈 重组子呈
Apr、Tcr Apr、Tcr
Pvu I Pst I
2700个外壳蛋白分子
大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA
M13 DNA载体的构建：
III
VI
I
IV
II
X
V
VII
IX
野生型M13RF-DNA
VIII
III VI I IV II X V VII IX
M13mp系列载体
VIII
polylinker lacZ‘
DNA测序 片段的 扩增
4. 柯斯质粒cosmid
Tcr
pBR322
4363 bp
Sal I
将外源DNA片段插在BamHI位点：
ROI ROP
Bal I
非重组子呈 重组子呈
Apr、Tcr Apr、Tcs
ori
Hind II
载体遗传标记检测
显色筛选法
lacZ'
将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标 记基因内部，使之灭活，此时重组
ori
Cl Br
O N N Cl Br
LacZ基因表 达的蓝白斑 菌落
基因工程质粒：Plasmid pBR322
松驰型质粒 Ampr， Tetr 多种限制性酶切位点 全长 4362 bp
Plasmid pBR322结构图
4363bp
pBR322质粒结构来源
Plasmid plink 322
Λ基因组三个区域：
左侧：包括外壳蛋白基因，20kb
中间区：18kb
右侧：复制及裂解基因，12kb
λDNA+外源DNA之和必须在39-53kb之间，所以可插入7-21kb的外源片段
λ噬菌体的基因组结构
溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因
cos
头部合成基因
早期控制基因
阻遏基因 重组基因 删除与整合基因 COS 3’ 5’ TCCAGCGGCGGGG
pUC 18/pUC 19 全长 2674 bp ，有 Amp 抗性基因，一个
复制起点ori。带有lac Z的N端 标记序列；因在复制起点
ori区域内缺失 rop 基因（改进的pMB1复制子），细胞即使
生长在无氯霉素环境中也可形成高拷贝数（500-700）。