绿色荧光蛋白腺病毒表达载体在大鼠肌源性干细胞标记中的应用

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绿色荧光蛋白在细胞成像中的应用

绿色荧光蛋白在细胞成像中的应用生物医学研究中，细胞成像的应用非常广泛。

而绿色荧光蛋白(GFP)因为可溶性、稳定性、表达方便等优点，已成为生物荧光成像研究中较为常见的标记基因。

下面我们从GFP的来源、结构、特点以及在细胞成像中的应用等几个方面来分析这一常用工具。

GFP的来源及结构GFP最初被从荧光海葵(Aequorea victoria)中发现，并被用于标记蛋白质的表达。

GFP经过多年的研究，现在已经应用于生物医学研究中的细胞成像、NGS等领域。

GFP分子由238个氨基酸组成，可以折叠成11个β转角和一个层状的环形。

其中β转角通过大量蛋白质交联形成β桶结构，环形结构中则存在一个由三个氨基酸组成的柔性环（5-8咪单元环），它能够在荧光染色分子进入柔性环的情况下，自发地形成苯环，同时改变自己的电子排布，从而发出强烈的绿色荧光信号。

GFP的特点与其他荧光染色物相比，GFP有以下几个特点：1. 可重复性：GFP的表达是稳定的，可以在不同的实验中使用。

2. 可控性：GFP标记可以通过表达载体进行控制，允许调整GFP的表达水平和特定部位的表达。

3. 可视性：GFP标记可直接被观察到，无需显微镜观察或临床检查，对于生物诊断和治疗研究具有很大的价值。

4. 可变化性：GFP有多种突变的形式，因此可以用于定量研究。

5. 无毒性：GFP标记物不会对健康产生影响。

GFP在细胞成像中的应用由于GFP的绿色荧光强度和GFP蛋白质的表达量之间的相对线性关系，因此GFP被广泛用于细胞成像的研究。

GFP也可以同时标记多个蛋白质，以便研究他们之间的交互作用。

在细胞成像中，GFP可以用来确定细胞形态、位置、运动和信号传导等特定事件。

例如，GFP透过标记膜蛋白的方法，可以标记出特定结构如细胞膜、线粒体、内质网、细胞核、胞板等等。

此外，GFP可以标记蛋白质酶、膜转运蛋白、核酸酶、激酶等多种细胞分子，具有非常丰富的变化形式，如分子翻译、效果、降解等等。

绿色荧光蛋白——结构及应用

绿色荧光蛋白——结构及应用孙艺佩【摘要】绿色荧光蛋白(GFP)有稳定、灵敏度高、无毒害、载体便于构建等优点,因此在各个领域已经有了广泛的应用,在细胞生物学与分子生物学领域中,基因常被用作一个报导基因作为生物探针,拿来映证某些假设的实验方法;在医学领域,常用利用绿色荧光蛋白观测肿瘤发生、生长和转移等过程.本文就绿色荧光蛋白的发现与应用背景、结构、生色机理、相对于其他荧光分子的优点和在各领域的应用进行了综述.【期刊名称】《化工中间体》【年(卷),期】2017(000)008【总页数】2页(P124-125)【关键词】绿色荧光蛋白(GFP);荧光生色机理;生色团;技术应用【作者】孙艺佩【作者单位】山东省实验中学山东 250000【正文语种】中文【中图分类】Q绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是一类能被蓝紫光激发而发出绿色荧光的蛋白，1962年，下村修等人于维多利亚管状水母中第一次发现并提取出了绿色荧光蛋白。

1994年，马丁·查尔菲首次在实验中成功表达GFP基因，向人们展示了绿色荧光蛋白作为遗传标签的价值。

同年，钱永健与其同事提出GFP生色团发光机理并改造GFP，使其更易作为标记物应用于各类试验。

2008年，诺贝尔化学奖授予钱永健、马丁·查尔菲和下修村，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白。

这一发现成果为生命科学的进步提供了更便捷的渠道。

从维多利亚多管水母中分离出来的野生型GFP由238个氨基酸残基组成，分子量约27kDa。

它具有β-桶的结构，几乎是个直径2.4nm，长4.2nm的完美圆柱。

11个β-折叠链形成β-筒的外周，筒两端分别被一些分子量较小的短α-螺旋覆盖，组成生色团的三个残基（Ser65-Tyr66-Gly67）与α-螺旋共价相连，位于圆筒中央螺旋中部。

β-圆筒与短α-螺旋形成致密的结构域，使配体不能扩散进入,生色团被严格保护在筒内，因此其性质稳定，不易被淬灭。

常用神经示踪剂及其示踪特点

常用神经示踪剂及其示踪特点作者：朱贺李丽赵磊马克涛司军强【摘要】丰富的神经示踪技术极大的促进了神经解剖学的发展，为神经生物学的各种研究提供了良好基础，在此，我们概述了常用神经示踪剂及其示踪特点，重点介绍了各种荧光染料和植物凝集素IB4的示踪特点。

【关键词】神经示踪剂;辣根过氧化物酶;荧光染料;植物凝集素IB4;病毒自20世纪70年代初Kristenson首次将辣根过氧化物酶(HRP)应用于追踪神经纤维联系以来，该方面的研究取得了前所未有的迅猛发展。

此后，许多用途广泛、敏感性强并能选择性地进行顺行、逆行标记或同时具有顺、逆行标记的追踪物质被应用到神经纤维联系的研究，对神经解剖学的发展起到了积极的推动作用。

现就常用的神经示踪剂及其示踪特点综述如下：1辣根过氧化物酶1.1辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP) HRP 是一种含血红素基的植物糖蛋白。

HRP法是20世纪70年代发展并被广泛应用的一种神经追踪方法，但由于HRP显影需要许多复杂的免疫组织化学技术，而且HRP参与细胞代谢，不能在细胞内长期存留，易扩散到邻近组织造成神经元的误染，其反应产物较不稳定，易丢失，另外还存在“再摄取”现象[1]，使得HRP在神经逆行示踪方面的应用大大减少。

1.2 霍乱毒素亚单位B结合的辣根过氧化物酶(CB HRP)R. N.Ranson等[2] 对传统的辣根过氧化物酶的染色方法进行了改进，采用结合了霍乱毒素亚单位B的辣根过氧化物酶(CB HRP)作为示踪剂，清晰显示了神经元的胞体和轴突结构。

近来也有采用四甲基联苯胺(TMB)为底物替代传统的二氨基联苯胺(DAB)来示踪豚鼠的面神经[3]的报道。

TMB与DAB相比有不致癌和HRP反应灵敏度高，操作简便，步骤少，用时短及成本低等诸多优点。

HRP法标记的神经元经组织化学法处理后,细胞失去了活性,无法进行膜片箝等神经电生理的研究,限制了HRP法在这一领域内的应用。

绿色荧光蛋白GFP多克隆抗体的制备及在多种细胞中的特异性鉴定

绿色荧光蛋白GFP多克隆抗体的制备及在多种细胞中的特异性鉴定董彬;胡贺贺;王晶;孟德梅;樊振川【摘要】绿色荧光蛋白是当前在生物及生物医学研究当中应用最为广泛的一种荧光标记蛋白.为开发一种高灵敏度、高特异性以及简单经济的GFP多克隆抗体,并使之适用于在跨物种细胞里表达的GFP蛋白进行检测,本文利用gfp基因cDNA全序列分别构建了带有6×His和GST标签的原核表达载体pET28A-gfp和pGEX-2T-gfp,并将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)细胞进行诱导表达,而后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表达鉴定,分别获得了相对分子质量为2.6×104和5.2×104的重组6×His/GST-GFP融合蛋白.将亲和纯化的6×His-GFP融合蛋白免疫新西兰大白兔,采集第5次免疫后血清用ELISA测定效价为1﹕32,000.抗血清依次经Protein A亲和纯化和GST-GFP抗原抗体纯化后,用免疫印迹实验(Western blot)方法检测抗体特异性,结果表明制备的多克隆抗体能很好地识别在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、HEK293细胞和大肠杆菌中表达的GFP,对继续开展GFP相关研究具有重要意义.%GFP is one of the most popular fluorescent proteins used to detect and quantify targeted proteins in living organ-isms.To develop a high sensitive antibody for its detection or signal capture in di fferent kind of organisms,6×His-tagged and GST-tagged prokaryotic expression plasmids,pET28A-gfp and pGEX-2T-gfp,were constructed,by insertinggfpinto the pGEX-2T and pET28A vectors respectively and then were transformed intoEscherichia coli BL21(DE3)for protein expres-sion. 12% SDS-PAGE analysis results showed that the molecular weights of the fusion protein 6×His-GFP and GST-GFP were2.6×104 and 5.2×104,respectively.The 6×His-GFP fusion protein was purified by affinity adsorption purification to immunize New Zealand white rabbits.The 5th immune serum was collected and the antibody titer was determined to be 1﹕32,000 by ELISA.The antiserum was purified by Protein A affinity adsorption purification and immobilized GST-GFP puri-fication,and the specificity of polyclonal antibodies was evaluated by Western blot in three kind of organisms including chlamydomonas,HEK293 cells and bacteria.Results show that the polyclonal antibody prepared can specifically and pre-cisely bind GFP in all kind of organisms,which can be used for more GFP and GFP related research.【期刊名称】《天津科技大学学报》【年(卷),期】2017(032)002【总页数】6页(P7-12)【关键词】原核表达;蛋白纯化;多克隆抗体;免疫印迹【作者】董彬;胡贺贺;王晶;孟德梅;樊振川【作者单位】食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;天津科技大学新农村发展研究院,天津300457;食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;天津科技大学新农村发展研究院,天津 300457【正文语种】中文【中图分类】Q786绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)于1974年由 Morise等[1]在水母中发现并分离出来．该蛋白包含238个氨基酸，第 65～67位残基(Ser-Tyr-Gly)自发形成荧光发色基团为对羟基本咪唑啉酮[2].直到 1994年，Chalfie[3]首次将绿色荧光蛋白应用在活体当中，在原核细胞大肠杆菌(Escherichia coli)和真核细胞秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)中表达成功，可以通过观察绿色荧光的方法对该蛋白在活体内进行定位．随后通过对GFP的DNA序列进行分析，并对其中一些氨基酸进行替换和突变，证实突变可以导致产生红色荧光的蛋白(red fluorescent protein，RFP)[4]和黄色荧光的蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)[5]．突变蛋白如红色荧光蛋白和黄色荧光蛋白等已经被广泛应用于活体细胞定位、内源蛋白检测以及单分子成像[6]等方面．GFP相对分子质量约为2.6×104，易于与其他蛋白融合表达，对受体细胞无毒副作用，且对其检测方式多样，如可以直接在荧光显微镜中观察其在活体中的定位和定量[7]，亦可进行免疫印迹实验(Western blot)对其进行检测和定量．然而，利用 GFP对相应内源蛋白进行活体定量时，由于活体细胞本身的一些自荧光物质的存在，会对实验结果产生较大影响[8–9]，因而不能对荧光信号进行准确定量．此外，组织或细胞在各种理化处理过程中，GFP易被猝灭，不利于对组织中 GFP标记蛋白进行细胞内定位及所在组织的结构和功能的原位分析[10]．因此，如果有一种对 GFP高灵敏度和高特异性的抗体存在，就可以通过利用免疫印迹方法对 GFP 及其标记蛋白进行定量．目前，抗 GFP蛋白抗体的研究已有很多，存在的问题是大多数多克隆抗体或单克隆抗体仅能对在一种或少数几种细胞内表达的 GFP蛋白进行特异性识别，而对于其他种属细胞内表达的 GFP并不能进行很好的专一性识别，主要原因是细胞背景干扰过高．对于如今科学研究的需要，如果一种抗体可以广泛地应用于检测多种种属细胞，可以显著提高效率，降低成本．目前，能针对多种种属细胞的 GFP多克隆抗体还未见报道，而多克隆抗体成本低廉，生产快速的特点引人注目．因此，制备能针对多种种属细胞的 GFP多克隆抗体势在必行，本实验室采用简单和经济的原核表达方法制备了高特异性的 GFP抗体，并运用多种方法对抗体纯化以提高抗体特异性．此外，利用 Western blot在多种属细胞中检测了抗体的特异性，从而为 GFP 作为一种标记蛋白使用提供了一种更为经济有效的检测抗体．1.1 菌株、质粒及实验动物大肠杆菌(Escherichia coli)XL1-blue、BL21 (DE3)感受态细胞、HEK293细胞、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC-125野生藻株和质粒pBSK-gfp、pGEX2T、pET28A均为本实验室保存．新西兰雄性大白兔 2只，1.5～2.0,kg，由天津欧阳实验种兔场提供．1.2 主要试剂蛋白Marker、限制性核酸内切酶、DNA连接酶，美国Thermo公司；DNA marker，北京全式金生物技术有限公司；蛋白纯化用填料 Ni SepharoseTM6,Fast Flow和Glutathione SepharoseTM4B以及抗体纯化介质Protein A SepharoseTMCL-4B，美国GE Healthcare公司；免疫动物用弗式完全佐剂和不完全佐剂，美国Sigma公司；NC膜，美国PALL公司；HRP标记的羊抗兔抗体，美国Jackson Immuno Research公司；ECL显色液，美国Millipore公司；脱脂奶粉，美国 BD公司；曝光底片，美国柯达公司；其他试剂均为国产分析纯．1.3 pGEX-2T-gfp 和 pET28-gfp 原核表达载体的构建以 pBSK-gfp质粒为模板，用上游引物5′-GCGGATCCATGGCCAAGGGCGAGGA-3′(加BamHⅠ酶切位点)、下游引物5′-CTAAGCTTTTACTT GTACAGCTCGTCCA-3′(加HindⅢ酶切位点)进行gfp基因扩增，反应条件为：95,℃ 1,min；95,℃ 30,s、55,℃ 30,s、72,℃ 2,min，30个循环；72,℃ 10,min．取2,μL PCR产物进行0.8%,的琼脂糖凝胶电泳分析．然后再用BamHⅠ和HindⅢ回收的目的基因、pGEX-2T和pET28A载体进行双酶切，然后将带有黏性末端的目的基因和载体用 T4 DNA连接酶连接后，转化入E．coliXL1-blue感受态细胞，挑取阳性菌落过夜培养，提取质粒，酶切和测序验证．1.4 融合蛋白的表达与纯化1.4.1 6×His-GFP和 GST-GFP融合蛋白的诱导表达及鉴定将正确的重组质粒pET28-gfp和pGEX2T-gfp转化至大肠杆菌 BL21(DE3)，分别挑取单菌落于含有100,µg/mL卡那霉素的 LB液体培养基中和含有120,µg/mL氨苄青霉素 LB液体培养基中过夜培养，再以1﹕20的比例放大培养至吸光度为0.6～0.8时，加入0.2,mmol/L IPTG于23,℃诱导6,h使蛋白大量表达，同时设置对照组即不加 IPTG诱导组．离心收集菌体并超声裂解获得全蛋白，全蛋白经4,℃、12,000,r/min离心 15,min后，收集上清液和沉淀．取全蛋白、上清液和沉淀分别与2×蛋白上样缓冲液混合后进行12%, SDS-PAGE电泳检测．1.4.2 6×His-GFP融合蛋白的纯化将诱导表达后的菌体进行超声波破碎后，4,℃、12,000,r/min离心 15,min，取上清液用0.45,μm滤膜过滤后，加入到预先平衡好的 Ni Sepharose 6,Fast Flow纯化柱中，室温结合1,h后使样品流经纯化柱，用洗涤缓冲液(50,mmol/L Tris-HCl，500,mmol/L NaCl，5,mmol/L咪唑，pH 7.4)洗去杂蛋白，再用洗脱缓冲液(50,mmol/L Tris-HCl，500,mmol/L NaCl，500,mmol/L 咪唑，pH 7.4)洗脱并收集目的蛋白，使用核酸微量测定仪对其进行蛋白浓度测定．将洗脱出的目的蛋白进行12%,的SDS-PAGE分析[11]．1.4.3 GST-GFP融合蛋白的纯化将诱导表达后的菌体进行超声波破碎后，4,℃、12,000,r/min离心 15,min，取上清液用0.45,μm滤膜过滤后加入到预先平衡好的Glutathione SepharoseTM4B纯化柱中，室温结合1,h后使样品流经纯化柱，用洗涤缓冲液(50,mmol/L Tris-HCl，300,mmol/L NaCl，2,mmol/L MgCl2，pH 7.4)洗去杂蛋白，再用洗脱缓冲液(50,mmol/L Tris-HCl，300,mmol/L NaCl，2,mmol/L MgCl2，10,mmol/L还原型谷胱甘肽，pH 7.4)洗脱并收集目的蛋白．将目的蛋白进一步通过分子筛(SuperdexTM-200,pg)进行分离纯化，流量 1,mL/min，将洗脱出的目的蛋白进行12%, SDS-PAGE分析．1.5 多克隆抗体的制备及效价的测定1.5.1 多克隆抗体的制备取2,mg纯化后的6×His-GFP融合蛋白与2,mL弗氏佐剂混合后乳化完全，免疫新西兰大白兔，采用颈背部多点注射法，初次免疫使用弗氏完全佐剂且免疫前耳动脉采血作为阴性对照血清．之后每 10,d进行加强免疫，使用弗氏不完全佐剂，一共加强免疫 4次，最后 1次加强免疫后耳动脉采血，利用间接ELISA法测定抗血清的效价，效价合格后，股动脉采血，4,℃静置过夜后收集血清，分装冻存．1.5.2 多克隆抗体效价的测定本实验采用间接 ELISA法测定抗血清的效价，以 GST-GFP融合蛋白作为包被抗原，用 5%,的脱脂乳粉封闭后，以所得的抗血清为一抗，辣根过氧化物酶(HPR)标记的羊抗兔抗体为二抗，然后经过 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)显色，利用酶标仪测定A450处的吸光度，并计算出抗血清的效价．以实验组血清A450与阴性对照血清A450的比值大于等于 2.0为阳性，其最高稀释度即为抗血清的效价[12–13]．1.6 多克隆抗体的纯化及特异性分析1.6.1 多克隆抗体的纯化分离完的抗血清首先使用Protein A SepharoseTMCL-4B亲和纯化专一性吸附IgG，去除IgG之外的其他抗体分子，纯化条件为：结合缓冲液(12,mmol/LNa2HPO4，8,mmol/L NaH2PO4，pH 7.0)，洗脱缓冲液(0.1,mol/L甘氨酸，pH 2.7)，流量 0.5,mL/min．收集吸收峰对应的洗脱液，用1,mol/L Tris-HCl(pH 9.0)将洗脱液pH调至中性．然后将Protein A SepharoseTM纯化完的抗体采用GST-GFP免疫亲和纯化法进一步纯化：将 GST-GFP融合蛋白固定在硝酸纤维素膜亲和纯化法进一步纯化[14]，随后经Western blot检测多克隆抗体的特异性．1.6.2 抗体特异性检测免疫印迹：取20,μg处理后的含有GFP表达的莱茵衣藻裂解上清液[15]、HEK293细胞裂解上清液[16]和E．coli细胞裂解上清液[17]加入1.5,μL 5×上样缓冲液混匀，进行SDS-PAGE和电转印后，蛋白转移到NC膜上，5%,的脱脂奶粉封闭；多克隆抗体稀释度 1﹕1,000，二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG，稀释度为1﹕5,000，然后曝光压片显影(ECL法)[18]．2.1 pET28A-gfp 和pGEX-2T-gfp 原核表达载体的构建PCR扩增获得723,bp的片段，与GFP预期大小一致．将构建的 pGEX-2T-gfp 和pET28A-gfp重组表达载体进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切验证，均获得条带大小为 723,bp的目的片段，并经测序验证序列完全正确，说明表达载体构建成功(图1)．2.2 融合蛋白的表达与纯化2.2.1 6×His-GFP和GST-GFP融合蛋白的诱导表达在IPTG的诱导下，含有pET28A-gfp和pGEX-2T-gfp质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株会大量表达目的蛋白，菌体经超声破碎后获得全蛋白，所得全蛋白经低温高速离心分离上清液和沉淀，然后经电泳、染色、脱色后分别在约2.6×104和5.2×104处可以看到目的蛋白大量表达，且蛋白的表达主要在上清液中，其表达结果如图2所示．2.2.2 6×His-GFP和GST-GFP融合蛋白的纯化6×His-GFP融合蛋白的表达主要为可溶性表达，因此将诱导表达后的菌体经超声破碎以及高速离心后取上清液，于含有Ni SepharoseTM6 Fast Flow填料的重力柱中进行亲和纯化，由于融合蛋白所含有的6×His标签能够特异性与上述填料结合，因此经过洗涤、洗脱等步骤即得到目的蛋白(图3 (a))，可作为免疫动物所用抗原．同时，GST-GFP融合蛋白经亲和纯化后，还有两条杂带(图3 (b))，经分子筛(SuperdexTM-200,pg)进行分离纯化如图4 (a)所示，可以得到较纯的目的蛋白如图4 (b)所示，可作为后续抗体纯化用抗原．2.3 多克隆抗体的制备2.3.1 抗血清效价的检测用纯化得到的6×His-GFP融合蛋白免疫新西兰大白兔，经耳缘静脉少量采血，室温静置 2,h或4,℃过夜后获得析出血清，以间接 ELISA法测定抗血清的效价，利用酶标仪测定A450处的吸光度后计算出抗血清的效价，结果如图5 所示．由图5 可知，1号兔抗血清的效价大于 16,000，2号兔抗血清效价大于32,000，满足实验要求．2.3.2 抗血清灵敏度和特异性检测最终纯化的多克隆抗体能够正确地与莱茵衣藻、HEK293细胞和大肠杆菌中表达的2.6×104大小的GFP蛋白特异结合，证明所制备的多克隆抗体具有很好的特异性，可专一性识别不同种属细胞中表达的GFP蛋白(图6)．GFP现在已经广泛应用在各个物种中作为标记蛋白进行细胞定位以及蛋白分析，因而开发适用于多种属细胞的 GFP抗体是非常有必要的．由于单克隆抗体的生产成本高、生产周期较长，所以开发具有成本优势的 GFP多克隆抗体就显得尤为迫切．本研究使用具有表达时间短、表达量高、蛋白较易纯化等优势[19]的大肠杆菌作为抗原制备的宿主．选择6× His(组氨酸)标签[20–21]纯化免疫原蛋白，由于其标签相对分子质量小，对免疫动物产生的免疫反应也比其他如GST、MBP标签小，产生的抗体特异性和灵敏性也会更高，有研究使用 GST-GFP 融合表达后使用凝血酶对融合蛋白进行酶切得到的[10]GFP蛋白作为免疫原，相比这种方法，本研究所采用的小相对分子质量标签亲和纯化后直接免疫动物具有更高效和经济的优势．对于抗血清的纯化，先采用亲和纯化，得到相应的 IgG，随后采用抗原抗体纯化，使用高纯度的GST-GFP融合蛋白作为抗原与亲和纯化后的抗血清进行2次亲和纯化，这种方法能有效地提高抗体的特异性和灵敏度，使最终得到的抗体具有非常高的特异性，而且可以对不同种属来源的 GFP蛋白进行特异性结合．由于 GFP广泛应用在原核和真核细胞中，本研究利用本实验室具有的莱茵衣藻、HEK293细胞以及大肠杆菌这3种来源的表达GFP的宿主对抗体特异性进行测试，结果表明该多克隆抗体特异结合人源、植物源和细菌中来源的表达 GFP蛋白．综上所述，本研究成功制备了 GFP多克隆抗体，并通过免疫印迹实验证实其具有很好的特异性，为 GFP的相关研究提供了实验基础．【相关文献】[1]Morise H，Shimomura O，Johnson F H，et al. 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绿色荧光蛋白(GFP)技术在细胞生物学研究中的应用

7 用于细胞示踪实验研究
利用GFP的荧光可以清楚地对肿瘤细胞的生长和转移进行追踪。体内肿瘤侵袭的研究要求在周围正常细胞背景下，能识别少量甚至是单个的瘤细胞。以往用抗肿瘤细胞特异性抗原、抗体进行免疫组化分析，操作较为复杂,且对抗原性有较高要求。利用β半乳糖昔酶(Lac Z)作为标记基因转染肿瘤细胞，操作较为复杂，且需底物分子。而用GFP就可以准确而简便地对肿瘤细胞进行示踪。
2 荧光稳定
GFP无光漂白现象，在很大的pH 范围内(pH7～ 12)都可以正常发出荧光，受温度的影响也很小，只有在超过65℃时才会变性，荧光消失。荧光显微镜强光照射下，GFP抗光漂白 (Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein) 强[9]。特别在450～490 nm蓝光波长下更稳定, 但在340～390 nm或395～440 nm范围内，仍会发生光漂白现象。对于长时间光照，GFP也有很好的耐受性，根据Sheen 等的研究，GFP在受体内表达时可以持续得到不低于10分钟的荧光。
5 计算细胞生长速度
在高水平组合型表达GFP 的细胞品系中, 在细胞生长的对数期, 绿色荧光蛋白所发出的荧光信号与细胞的数量密切相关。测量到的任何荧光强度都可以相应地转变成细胞浓度。尽管在细胞生长的后期, 用荧光信号计算得到的细胞数目略低于培养物中的实际数目。但在常用的台盼蓝计数方法中, 这个误差是允许的。利用这一技术, 可以测定某些细胞的分布和生长状况, 尤其是一些透明的动物和植物组织内特定细胞、化合物的生长、分布情况。也有人用此项技术进行病毒在植物体内的生长、扩散情况的研究, 取得了不错的效果。
图1 绿色荧光蛋白
1962年Shimomura和Johnson等人[1]首先从一种水母类动物Aequorea Victoria中分离纯化出了GFP, 1992年 Prasher[2]等克隆了GFP基因的cDNA并分析了GFP的一级结构,1994年M.Chalfie[3]等最早用重组野生GFP型基因做报告基因, 成功地在原核和真核生物中得到表达。90 年代后, 人们对GFP的性质和应用进行了不断深入的研究, 有关GFP 及其利用的研究进展较快，现在它已经发展成了现代生物学研究的一个精确工具。目前在细胞生物学、植物学、动物学、微生物学等学科研究中都有着相当广泛的应用。随着人们对GFP发光机制研究的深入, 通过对其发光团区域和其它区域进行随机诱变, 已经得到了许多 GFP突变型, 有的发蓝光或黄光而不是绿光[4]；有的发出的荧光比野生型的强很多, 激发后很容易用肉眼观察到；有的则是温度突变型, 其表达不受温度的限制[5]；有的突变体则可以特异地在某些物种中高效表达。这些突变体极大地拓宽了GFP的应用范围, 使GFP在细胞生物学和分子生物学领域的应用显示出更为广阔和诱人的前景。

绿色荧光蛋白腺病毒表达载体在肌源性干细胞移植修复脊髓损伤实验中的应用

７６７
陕西医学杂志２１００年７月第３卷第７９期
绿色荧光蛋白腺病毒表达载体在肌源性干细胞移植
修复脊髓损伤实验中的应用△
西安医学院附属医院骨科（安７０７）杨彪杜成林梅晰凡西１０７摘袁亚江
，ｎｐｎｌｃｒｅｓｃｉｎｗａｅｆｒｄｉｌｒｔ．ｎａｓｐｓ—ｎｕｙ，ＭＤＳｔＰｇｎｒａｄｓｉａｏｄｈｍｉｅｔｓｐｒｏｍｅｎａｌａｓＮｉｅｄｙｏｔｉｊｒｏＣｓｗｉｈＧＦｅｅｗｅｅ
ｌｂｌｇｅｆｃｏｍｕｃｅｄｒｖｄｓｅｃｌ ’ｔａｓｌｎａｉｇｏｐｎｌＣｏｄＩｊｒｆＲａｓＭｅｈｄａｅｉｆｅｔｔｓｌ— ｅｉｅｔｍｅｌｒｎｐａｔｔｎＳｉａｒｎｕｙｏｔ．ｎｓｎｔｏｓ：Ｆｏｔｒｙ
ａｕｔＳｒｇｅＤａｅａｓｗｅｅｒｎｏｙｄｖｄｄｉｔｒｎｐａｔｔｎｇｏｐ（ｄｌｐａｕ～ｗｌｙｒｔｒａｄｍｌｉｉｅｎｏｔａｓｌｎａｉｒｕ一２）ａｄｃｎｒｌｇｏｐ（ｏ０ｎｏｔｏｒｕ＝２）０
ＰＳ，移植后１２３４周用ＢＢ评分方法测大鼠的运动功能，同时进快
冻切片进行荧光显微镜观察。结果：移植后１周两组动物运动功能恢复无明显差异；移植后２３、、４周与对照组比较，移植组显著提高运动功能；荧光显微镜观察经绿色荧光蛋白基因标记的肌源性干细胞在损伤脊髓组织局部生长良好，并且有沿着脊髓神经束向头尾两侧迁移的趋势。结

绿色荧光蛋白在微生物根际定殖研究中的应用

生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2009年第2期·综述与专论·收稿日期：2008-07-18基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（2007年度），国家科技基础条件平台建设项目（2005DKA21201）作者简介：李世贵（1978-），男，湖南省湘阴人，博士研究生，助理研究员，主要研究方向：微生物分子生物学荧火虫、深海鱼类和腔肠动物甚至一些真菌及古细菌都具有自身发光的能力，发光生物的这种能力是它们自身所具有的一类统称为“荧光蛋白”的物质所赋予的。

绿色荧光蛋白（green fluorescent pr -otein ，GFP ）最早是从维多利亚发光多管水母中发现并纯化得到的一种天然荧光蛋白[1]。

1绿色荧光蛋白（GFP ）的特性作为荧光标记分子和报告基因，GFP 具有许多其他荧光蛋白所不具备的优良特性。

GFP 是目前惟一能在活细胞中表达的发光蛋白，它不需要任何底物和辅助因子就能够在多种活体生物体内进行异源表达，因此不会像其它的报告基因如分泌型胎盘磷酸酯酶（SEAP ）、β-半乳糖苷酶（LacZ ）、β-葡糖苷酸酶（GUS ）和萤火虫荧光素酶（LUC ）等由于需要昂贵的底物和辅助因子而在应用中受到限制。

GFP 表达灵敏度高，单细胞水平的表达也可识别到，且表达产物稳定。

GFP 它与目的基因融合后，对目的基因的结构和功能没有影响，不消耗生物体的能量，大量表达对细胞也无毒性作用，细胞仍可连续培养；是可广泛用作细胞内基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等的良好标记[2]。

GFP 的表达具有广谱性，迄今为止，GFP 已经在细菌、蓝细菌、酵母、植物、真菌、鱼类及哺乳动物中表达和应用；可进行活细胞定时定位观察，无论在真核细胞还是在原核细胞中表达后，它都能自发产生荧光蛋白，在蓝光或紫外光激发下产生绿色荧光，借助激光共聚焦显微镜（LSCM ），可进行活细胞实时定位绿色荧光蛋白在微生物根际定殖研究中的应用李世贵1吕天晓1，2顾金刚1姜瑞波1牛永春1（1中国农业科学院农业资源与农业区划研究所中国农业微生物菌种保藏管理中心，北京100081；2东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨150030）摘要：农业有益微生物根际定殖能力的强弱决定着其应用效果的好坏，而作为荧光标记分子的ＧＦＰ被认为是当前用于分子生态学研究中最理想的报告基因，成为近年来研究微生物根际定殖的热点方法。

腺病毒载体构建的基本原理与应用

腺病毒载体构建的基本原理与应用1. 简介腺病毒（Adenovirus）是一类非常常见的病毒，它可引起呼吸道、眼部和肠道感染等问题。

在基因工程领域，腺病毒被广泛应用作为基因传递载体。

通过对腺病毒进行适当的改造，可以将外源基因有效地传递到目标细胞中，并实现基因的高表达。

本文将介绍腺病毒载体构建的基本原理以及其在实际应用中的主要用途。

2. 腺病毒载体构建的基本原理腺病毒载体构建的基本原理主要包括以下几个步骤：2.1 选择适当的腺病毒亚型腺病毒有多个亚型，其中最常用的是腺病毒2（Ad2）和腺病毒5（Ad5）。

选择适当的腺病毒亚型取决于目标细胞的特点以及需要传递的基因。

2.2 构建质粒载体构建质粒载体是腺病毒载体构建的第一步。

质粒载体通常由多个部分组成，包括腺病毒的核心序列、外源基因表达的启动子和终止子等。

通过合成或PCR扩增等方法，可以将这些部分组装到一起构建质粒载体。

2.3 建立包装细胞系在构建过程中，需要建立一个能够产生包装腺病毒的细胞系。

这些细胞系通常包括两种类型的细胞：一种是质粒携带者，将质粒转染进细胞内；另一种是包装细胞，它们能够提供所需的腺病毒包装蛋白和其他辅助蛋白。

2.4 转染质粒载体将质粒载体转染到包装细胞系中，使其进入细胞内。

转染的方法可以采用常规的化学方法，如钙磷共沉淀法或使用商业化学试剂。

2.5 腺病毒产生与包装质粒载体进入到包装细胞中后，通过转染和转座等过程，腺病毒基因组会产生复制和转录。

最终，腺病毒包装蛋白和基因组会组装成腺病毒颗粒，从而完成腺病毒载体的构建。

3. 腺病毒载体的应用腺病毒载体在基因治疗、疫苗开发、基因功能研究等方面具有广泛的应用。

以下是腺病毒载体的主要应用领域的列点介绍：•基因治疗：腺病毒载体可以用于治疗多种遗传性疾病，如囊性纤维化、遗传性视网膜疾病等。

通过将治疗基因成功地传递到患者细胞中，可以恢复或增强正常基因的功能，从而治疗相关疾病。

•疫苗开发：腺病毒载体在疫苗开发中具有重要的作用。

腺病毒载体介导EGFP转染大鼠骨髓间质干细胞研究

ＭＳｓ的生物学特性。方法：髓贴壁法分离培养大鼠骨髓ＭＳｓ采用流式细胞术进行鉴定。利用脂质体法通过Ｃ）骨Ｃ并
腺病毒转染获得ＥＦＧＰ修饰的大鼠骨髓ＭＣ。结果：Ｓｓ成功分离得到大鼠ＭＣ，Ｓｓ腺病毒转染后大鼠骨髓ＭＣ过表达Ｓｓ绿色荧光蛋白（ＧＰ报告基因，ＥＦ）且转染后ＭＳｓＣ具有成骨分化潜能。结论：通过腺病毒转染能获得ＥＦＧＰ标记的大鼠ＭＣ，ＭＣ组织工程和基因治疗研究提供了依据。Ｓｓ为Ｓｓ［关键词］问质干细胞；腺病毒载体；因治疗；基转染
［图分类号］Ｒ４Ｑ８中３；７［献标志码］Ａ文［章编号］１７ — ７３２１）４— ３Ｏ一５文６１７８（００００１０
Ａｔｙｏｒｎｓｅｔｎｇｇｅｎｆｕｒｓｅｔｐｒｔｉｅｅｂｄｎｏｉｕｓｕｄｎｔａｆｃｉｒｅｏｅｃｎｏｅｎｇｎｙａｅｖｒｓｌｖｃｏｏｒｔｂｎａｒｗｅｉｅｅｅｃｙａｔｍｅｌｅｔｒｔａｏｅｍｒｏｄｒｖｄｍｓｎｈｍｌｓｅｃｌｓ
ｄｎｉｅｌｉｈｗｅｅｔａｓｅｔｄｂｅｏｉａｔａｅｏｉｕ．ｅｔｙｃｌｗｈｃｒｒｎｆｃｅｙｒｃｍｂｎｎｄｎｖｒｓＥＧＦｕｓｎｌ０ｅｔｍｉｅＯ０．Ｒｅｕｌｓ：ｆｓＰｉｇｉｆｃａｎ２０ｐｓｔＲａｏｅｍａｏ－ｅｖｄＭＳＣｓｗｅｅｓｃｅｓｕｌｓｌｔｄａｄｅｆｉｎｌｘｒｓｔｂｎｒｗ・ｒｅｄｉｒｕｃｓｆｌｉｏａｅｎｆｉｅｔｙｅｐｅｓＥＧＦｒｐｒｅｅｂｄ－ｙｃＰｅｏｔｇｎｙａｅ－ｎｖｒｓｖｃｏｓｔａｓｅｔｏｏｉｕｅｔｒｒｎｆｃｉｎ．Ｃｏｃｕｉｎ：Ｒａｏｅｍａｒｗ－ｅｖｄＭＳａｅｔａｓｅｔｄｂｅｏｂ－ｎｌｓｏｔｂｎｒｏｄｒｅｉＣｓｃｎｂｒｎｆｃｅｙｒｃｍｉ

本期专题：干细胞与转基因技术

果阐述
借床＿＿触砉：文章有助于人们对间充质干细胞进一步认识，可以人为的对间充质干细胞分化进行调控。应用，
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本期专题：干细胞与转基因技术
干细胞
５胶质细胞源性神经营养因子基因修饰神经干细胞移植短暂性脑缺血再灌注损伤大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶３的表达６胶质细胞源性营养因子及内皮素Ｂ受体
基因共转染小鼠神经干细胞
增殖刺激剂，能为骨髓间充质干细胞生长提供充足的血供和营养。利用基因治疗的方法表达绿色荧光蛋白、胶质细胞源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子等基因已成为可能本期专题介绍的１篇文章，０分别采用携带上述３因子的基因对种千细胞进行转染，并就示踪情况、转染效率、转染细胞的生物学特性、转染后神经功能恢复予以客观细致地分析，不失为干细胞移植联合基因治疗的有益尝试１绿色荧光蛋白基因腺病毒栽体转染兔骨髓间充质干细胞的实验黄锐（吉林医药学院附属医院骨科，吉林省
华艳龙．等．阃充磺于细咆分化的调控极翻及其话响因素
【５Ｒ￣ｎＳ，ｅｎｎｅＡ，ｅｒｖｃＤｅｌＨａｔｓｎ１】ａａＩＦｒａｄｓＲＤｍｉｉ．ｔ，ｅｔｒｓｄｏａｓｅａ
ｈｒｔ — ｄｕｅｏｍｅｉｕｏｍｅｉｉｎｎｃｄｈｒｓｓｉｈｍａｎｃｌ：ｆ￣ｓｏｇｉｇ．ｎｅｌｅｅｎａｎｓｗｏｕｄｈａｌｇａｇｉｇｅｉａｉｅｅｎｉｔ．ｓｎｅｉ，ｎｏｅｎｓｓ，ｎｄｄｆｒｔｉｎａｏｎＤｏｅＲｅｓｏｎｅｐｓ

不同转染方式对腺病毒介导的基因转染效率的影响

不同转染方式对腺病毒介导的基因转染效率的影响孔霞;郭凌郧;张蕾;郑飞;杨建业;黄永章;唐俊明;王家宁【期刊名称】《郧阳医学院学报》【年(卷),期】2010(29)1【摘要】目的:研究携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因的重组腺病毒在大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达。

方法:将纯化的GFP重组腺病毒分别用单次转染和多次转染两种不同方法转染MSC,观察其感染效率和GFP表达水平。

结果:培养的MSC呈CD90和CD105强阳性,且具有成骨、成脂肪等多向分化能力;携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒单次转染和多次转染P3代MSC都呈现出浓度依赖性;单次转染在80MOI时转染效率最高,而多次转染在20MOI时转染效率即已达90%。

结论:建立稳定、高效表达Ad-GFP的骨髓间充质干细胞实验体系,为MSC的标记及示踪奠定基础。

【总页数】5页(P1-4)【关键词】腺病毒;绿色荧光蛋白;转染;骨髓间充质干细胞【作者】孔霞;郭凌郧;张蕾;郑飞;杨建业;黄永章;唐俊明;王家宁【作者单位】郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所;郧阳医学院附属人民医院心内科【正文语种】中文【中图分类】Q784【相关文献】1.不同转染方式介导基因转染效果的评价 [J], 丁尚伟;张艳容;吴文谦;任萍萍;黄晓宇;张培歌;武彧;于艾嘉;谢明星2.重组腺病毒对Hela、MCF-7的转染效率及其介导的hTRAIL基因体外抑瘤作用[J], 朴春姬;孙晓玲;王彬;付鑫;刘晓丽3.腺病毒介导的hNT-3基因转染对兔前交叉韧带重建术后本体感觉恢复的影响[J], 蔡东高;傅永慧;吕游;曾辉;孙旭4.腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞的效率及毒性 [J], 武成聪;荣树;任静;吴铮;刘涛;刘克廷;朱博;黄合飞;王芳5.腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞的效率及毒性 [J], 武成聪;荣树;任静;吴铮;刘涛;刘克廷;朱博;黄合飞;王芳;;;;;;;;;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

腺病毒介导的人内皮型---氧化氮合酶基因和增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

ＭＳｓＣ中高表达ｈＮＳ和ＥＦ。结论：ｅＯＧＰ采用腺病毒载体可以将外源性的ｈＮＳ基因转染至ＭＳｓ中，ｅＯＣ并得到有效
表达，且携带的ＥＦＧＰ标记可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况，将为勃起功能障碍的细胞治疗提这供一条新的途径。
ｌｒｅｔｏｅＥＦ）ｉａｍｓｎｈｍｔｅｓｃｌｅｉｉｏＭｅｈｄｓｎｈｍｌｔｅｓ（Ｃ）ｆｏｅｃｎｒｔｎ（ＧＰｎｒｔｅｅｃｙａｓｍｃｌｕｔｒｎｖｒ．ｔｏｓＭｅｅｃｙａｓｍｃｌＭＳｓｕｓｐｉｌｅｕｄｔｅ
王一平谭，艳，王家宁张少峰郭凌郧孔霞罗超，，，，
４２０）４００
（阳医学院附属人民医院临床医学研究所；郧附属人民医院泌尿外科研究所；
基础医学研究所；药理学教研室，北十堰湖
［摘
要］目的：研究腺病毒载体介导人内皮型一氧化氮合酶（ｕｎｅｄｔｅａｎｔｃｏｉｅｓｎｈｓ，ｅＯ）ｈｍａｎｏｈｌｌｉｉｘｄｙｔａ（ｎａｃｄｇｅｎｆｏｅｃｎｐｏｉ，ＧＰ在体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞（ｅｅｃｙａｅｈｎｅｒｅｕｒｓｅｔｒｅＥＦ）ｌｔｎｍｓｎｈｍｌ
ｓｅｃｌｓ，ＭＳｓ的表达。方法：ｔｍｅｌＣ）体外培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞，对培养的细胞进行成骨、并成脂肪诱导分
ＡｓａｔＯｂｃｉｏｉｖｓｇｔｔｅｅｐｅｓｎｏｕａｎｏｈｌｉｉｏｉｙｔａｅｈＮＳｎｎａｃｄｇｅｎｂｔｃ：ｊｔｅＴｅｔａｅｈｘｒｉｆｍｎｅｄｔｅａｎｒｘｄｓｎｈ（ｅＯ）ａｄｅｈｎｅｒｅｒｅｖｎｉｓｏｈｉｔｃｌｅｓ

腺病毒载体在基因治疗中的应用

腺病毒载体在基因治疗中的应用随着生物技术和基因工程的进步，基因治疗已成为医学界的一项研究热点。

基因治疗是通过将基因载体导入到患者体内，使其表达所需的治疗基因来治疗疾病。

目前，常用的基因载体主要有病毒载体和非病毒载体两种。

而腺病毒载体作为一种常用的病毒载体之一，在基因治疗中也发挥着重要的作用。

一、腺病毒的基本特性腺病毒（adenovirus）是一个非常普遍的病毒，它具有双链DNA，嗜热、嗜酸性、不被包膜包裹的特性。

腺病毒可以感染哺乳动物、鸟类和爬行动物等广泛的生物群体，通常引起感冒和呼吸道感染等疾病。

腺病毒在基因治疗中的应用主要依赖于其良好的遗传学特性，尤其是在基因表达和基因传递方面的优越性。

二、腺病毒载体的构建方法腺病毒载体的构建是基因治疗中非常关键的过程。

腺病毒载体的核心是表达负责特定治疗效应的外源基因，因此，正确构建腺病毒载体是确保基因治疗成功的首要保障。

目前，常用的腺病毒载体构建方法主要有3种：重组病毒DNA技术、Homologous recombination（同源重组）和Cre-loxP介导的低剂量DNA用量。

这些方法都与分子生物学方法和技术密切相关，需要用到许多分子生物学技术和实验室设备。

三、腺病毒载体的应用领域腺病毒载体在基因治疗中的应用非常广泛，主要包括以下几个方面：1、遗传缺陷症的治疗。

遗传缺陷症一般是由于某个基因发生突变导致的，因此采用基因治疗是治疗遗传缺陷症最有前途的方法之一。

目前针对一些单基因病进行基因治疗的研究已经开始，例如囊性纤维化、遗传性凝血因子Ⅷ、骨髓瘤等。

研究表明，采用腺病毒载体进行治疗的效果是非常显著的。

2、癌症的治疗。

癌症是一种破坏人们健康的致命疾病。

而采用腺病毒载体进行基因治疗，则能针对肿瘤细胞特异性基因、癌症相关基因和免疫调节基因等进行治疗，其表现形式可以是基因靶向方案、病毒粒子攻击方案等，有效地减轻患者的痛苦和提高生存质量。

3、神经系统疾病的治疗。

神经系统疾病一直是临床医学难以攻克的大难题之一。

绿色荧光蛋白基因腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

ｍｉｅｙｆｗｃｔｍｅｒ．ＡｄｎｖｒｓＷａｂａｎｄｂａｋｇｎ９ｅ１ＢＣｓＷａｒｎｆｃｅｔｖｒｏｓｔｅｓｆｎｄｂｏｙｏｔｌｙｅｏｕＳｏｔｉｅｙｐｃａｉｇ２３ｃｌｉ．ＭＳＳｔａｓｅｔｄａａｉｕｉｒｔｌ×
【ｂｔｃ】０ｊｔｅＴｕｙｔｏ — ｅｔｎｈｔｅｎｒｓｃｏｄｅｐｓｏｔｏｅａｏｅＡｓａｔｒｂｃｖｏｔｅｓｒａｏｓｐｅｅａｆｔｎｎｒｓｎａｂｎｒｗｓｍｅｉｓｄｈｄｅｌｉｉｂｗｔｎｅｉａｘｅｉｒｍｒｔ
ｃｌｗｔｄ — ＧＦｄｔｅｃａｇｆｅｌｉｌｇｒｐｒｎｏｓｕｙｔｅｆａｉｉｔｆｃｎｔｃｉｇｇｎ・ｄｆｄＢＭ－ｅｌｉＡｈ — Ｐａｈｈｎｅｏｌｂｏｏｙｐｏｅｔａｄｔｔｄｈｓｂｌｙｏｏｓｒｔｅｅ— ｍｏｉｅｎｃｙｅｉｕｎｉ・
１一１×１ＰＵ／）００Ｆｍ１．Ｔａｓｅｔｎｅｃｅｃｓａａｙｅｙｆｗｃｔｍｅｒｎｅｌｐｏｉｒｔｎｗａｅｅｔｄｂｒｎｆｃｉｆｉｎｙｗａｌｚｄｂｏｙｏｔｙａｄｃｌｒｌｅａｉｓｄｔｃｅｙｏｉｎｌｆｏ
维普资讯
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１８・８
广东医学
２００８年２月第２９卷第２期Ｇｕｎｄｎｄｃｌｏｒ￣Ｆｂ０８Ｖ１９。Ｎ．２ａｇｏｇＭｅｉｕｎａＪｅ．２０。ｏ．２ｏ

双报告基因系统

双报告基因系统引言双报告基因系统（Dual-reporter gene system）是一种广泛应用于生命科学研究中的工具。

它通过使用两个不同的报告基因来同时检测和表达目标基因的活性。

这种系统可以提供更准确、灵敏和可靠的测量结果，并且广泛应用于基因调控研究、药物筛选、分子生物学、细胞生物学等领域。

本文将介绍双报告基因系统的原理、应用、设计和优点等方面的内容。

原理双报告基因系统一般由两个不同的报告基因构成，通常是荧光蛋白（如绿色荧光蛋白 GFP）和荧光素酶（如火萤酶 Luc）。

这两个报告基因可以分别标记在目标基因的上游或下游区域，使得它们可以同时检测和表达目标基因的活性。

通常情况下，目标基因启动子或调控序列会被克隆到一个表达载体中，该载体中包含两个不同的报告基因。

当目标基因被激活或抑制时，两个报告基因的表达水平也会相应改变。

通过测量这两个报告基因的表达水平，可以间接获得目标基因活性的信息。

应用双报告基因系统在生命科学研究中有着广泛的应用。

以下是几个常见的应用领域：基因调控研究双报告基因系统可以用于研究基因的调控机制。

通过将该系统与不同的启动子或调控序列结合，可以研究不同基因调控元件对基因表达的影响。

通过测量两个报告基因的表达水平，可以评估基因调控序列的活性和响应特性。

药物筛选双报告基因系统可以用于药物筛选。

通过将该系统与特定的靶标基因结合，并同时测量两个报告基因的表达水平，在体外或体内评估药物对目标基因的调控效果。

这种系统可以快速筛选出对目标基因具有调控作用的药物，并且可以提供更准确的药物筛选结果。

分子生物学研究双报告基因系统可以用于分子生物学研究中的多种实验。

例如，可以通过该系统研究基因的启动子活性、转录因子的结合能力、信号通路的活性等。

该系统还可以用于检测基因的表达模式、细胞的转染效率等。

细胞生物学研究双报告基因系统可以用于细胞生物学研究中的多种实验。

通过将该系统与细胞标记试剂结合，可以追踪和定量细胞的增殖、分化和迁移等过程。

实验设计——绿色荧光蛋白的表达

分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达——闵霞（2013141241165）李彩云（2013141241095）一、引言基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。

荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。

荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。

它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。

基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。

采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA 分子。

在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。

本次实验中，分子克隆质粒载体所携带的外源基因是EGFP绿色荧光蛋白，实验的最终目的是将EGFP基因插入表达载体pET-28a中，组成重组子，并导入到大肠杆菌细胞中并诱导其表达，培养出绿色的大肠杆菌菌落。

为此，我们要利用碱变性法将大肠杆菌中的质粒DNA提取出来，并通过Bam HI和NotⅠ两种酶的双酶切作用，从而获得目的外源基因片段EGFP和表达载体pET-28a质粒的DNA，然后通过连接酶连接后形成重组子，并通过氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞中，让其在含有Amp和IPTG的LB琼脂平板上生长繁殖，最后通过观察大肠杆菌能否在含有Amp和IPTG的LB平板上长出绿色的菌落，来判断EGFP基因工程菌的构建效果二、主要路线：1、质粒DNA的提取2、琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA3、酶切连接重组质粒4、重组质粒的扩增5、菌落PCR法鉴定阳性克隆6、目的荧光蛋白基因的表达1、质粒DNA的提取实验原理：1）质粒是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。

GFP的简介和应用

GFP的简介和应用【摘要】源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白（GFP），是一种极具应用潜力的标记物，有着极其广泛的应用前景。

本文就GFP的理化性质、荧光特性、改进以及它在科学研究中发挥的作用进行了综述。

【关键词】绿色荧光蛋白（GFP）、标记物、荧光特性、进展、改进、应用、干细胞移植【正文】一、GFP的简介1. GFP的理化性质，荧光特性及其改进1.1 GFP的理化性质从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。

GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。

Aequoria GFP分子量约27×103，一级结构为一个由238 个氨基酸残基组成的单链多肽；而Renilla GFP是分子量为54kD的同型二聚体。

两种GFP有不同的激发光谱，Aequoria GFP在395 nm具有最高光吸收峰，肩峰为473 nm；Renilla GFP在498 nm具有强烈的光吸收，肩峰为470 nm。

两种GFP含有相同的生色团，发射光谱基本相同（λmax= 508~ 509 nm）。

GFP性质极其稳定，易耐受高温处理，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。

其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境，或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。

更重要的是，它们在很大的pH范围内的吸收、发射光谱也是相同的。

Renilla GFP的稳定性就更为显著。

它在上述一系列的变性条件下都很稳定，不易变性。

根据Sheen等的研究，GFP在受体内表达时，其稳定性并不亚于CAT 蛋白，因而可以得到持续时间较长的荧光。

1.2 GFP的荧光原理GFP的性质和发射光谱的稳定性是同其生色团结构的稳定性密不可分的。

GFP表达后折叠，在氧存在的条件下，使66位氨基酸残基的α、β键间脱氢。