应用CRISPR技术制备ATG7基因Knockout的N2a细胞的试验研究宋

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敲除zDHHC17基因的N2a细胞系及其构建方法和试剂盒[发明专利]

专利名称：敲除zDHHC17基因的N2a细胞系及其构建方法和试剂盒
专利类型：发明专利
发明人：刘慧聪,饶木顶,焦雪苗,吴灿,孔二艳,张中健
申请号：CN201910160654.3
申请日：20190304
公开号：CN109735501A
公开日：
20190510
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了敲除zDHHC17基因的N2a细胞系及其构建方法和试剂盒，所述方法为利用CRISPR‑Cas9系统的构建方法，能够兼顾质量和效率，准确而高效。

由于zDHHC17是一种重要的棕榈酰修饰酶，通过调控靶蛋白的棕榈酰化修饰修饰影响蛋白功能；zDHHC17又称为亨廷顿互作蛋白(Hip14)，与亨廷顿疾病的发病机理密切相关。

敲除zDHHC17基因的N2a细胞系易于扩增培养，方便提供大量的生物样本，易于其靶标蛋白的发现研究；易于特异的研究其靶蛋白的调节功能及相关的信号通路。

因此，敲除zDHHC17基因的N2a细胞系可用于其棕榈酰化底物的功能研究和亨廷顿疾病的发病机理研究。

申请人：新乡医学院
地址：453003 河南省新乡市红旗区金穗大道601号新乡医学院精神神经医学研究院
国籍：CN
代理机构：北京冠榆知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
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基因敲除技术的原理及应用

基因敲除技术的原理及应用1. 什么是基因敲除技术？基因敲除技术是一种用于研究基因功能的重要工具。

它通过针对特定基因进行序列特异性的基因组改变，从而使该基因在细胞或有机体中无法正常表达。

基因敲除技术可以通过多种方法实现，包括CRISPR/Cas9技术、RNA干扰技术等。

2. 基因敲除技术的原理基因敲除技术的原理是通过引入带有特定敲除序列的DNA或RNA分子，干扰目标基因的正常表达，从而导致该基因在细胞或有机体中无法产生功能性蛋白质或RNA。

具体的原理可以通过以下步骤进行解释：•设计敲除序列：根据目标基因的DNA序列，设计敲除序列，一般是由数十个碱基组成的寡核苷酸序列。

这个敲除序列将与目标基因的DNA序列互补匹配。

•传递敲除序列：将设计好的敲除序列导入目标细胞或有机体中。

传递方式可以包括转染、电穿孔等多种方法。

•敲除序列与目标基因结合：敲除序列与目标基因的DNA序列互补配对，形成双链结构。

这种配对会触发细胞内的DNA修复系统。

•DNA修复系统介入：细胞内的DNA修复系统会介入敲除序列与目标基因的配对，将目标基因的DNA序列修复或剪切。

•基因无法表达：通过以上步骤，目标基因的DNA序列被修复或剪切，导致基因在细胞或有机体中无法正常表达。

3. 基因敲除技术的应用基因敲除技术在生物学研究和生物医学领域有着广泛的应用。

下面列举几个常见的应用领域：•基因功能研究：通过敲除目标基因，研究其对细胞生理过程和有机体发育的影响，揭示基因功能与疾病发生之间的关系。

•疾病模型构建：利用基因敲除技术，构建动物模型来模拟人类遗传疾病，研究病理机制、筛选新药物。

•基因治疗：通过基因敲除技术，研究特定疾病相关基因的功能，为基因治疗提供理论和实验依据。

•农业转基因研究：基因敲除技术在农业领域可以用于研究植物基因的功能，提高作物抗病虫害能力、调控植物生长和发育等。

4. 基因敲除技术的优势与局限性基因敲除技术具有以下优势：•高效性：基因敲除技术可以精确地靶向特定基因，对其进行敲除，从而实现高效的基因敲除。

用于CRISPR文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第42卷第12期2020年12月V ol.42No.12Dec.2020doi ：10.3969/j.issn.1008-0589.202002012用于CRISPR 文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建张纪文，王露露，李芳，刘杏，赵东明*，步志高*（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150069）摘要：为了进行CRISPR 文库筛选，本研究采用慢病毒转导的方法利用N2a 细胞构建表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞系。

实验将LentiCas9-Blast 、pSPA X2和pMD 2.G 3种质粒共转染人胚胎肾细胞（HEK293T ）获取高滴度的重组慢病毒，收集重组慢病毒并感染N2a 细胞，经杀稻瘟菌素（Blasticidin ）筛选，通过有限稀释法获得含有Cas9基因的多个单克隆细胞株。

Western blot 结果显示候选细胞系高水平表达Cas9蛋白；利用慢病毒表达报告基因载体系统检测显示候选细胞系的Cas9蛋白具有很高的切割活力；利用CellTiter-Glo 试剂检测结果显示，Cas9基因在候选细胞系内高表达但不影响细胞增殖活性。

本研究利用慢病毒转导系统构建了稳定表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞系，为基于CRISPR/Cas9全基因组高通量筛选技术探究神经细胞内关键宿主基因调控狂犬病病毒嗜神经性提供研究基础。

关键词：基因编辑；慢病毒；高通量筛选；鼠神经瘤母细胞中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589（2020）12-1292-04Construction of N2a-Cas9cell line for genome-wide CRISPR screeningZHANG Ji-wen,WANG Lu-lu,LI Fang,LIU Xing,ZHAO Dong-ming *,BU Zhi-gao *(State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069,China)Abstract :In this study,mouse neuroblastoma (N2a)cells were used to construct N2a-Cas9cell line which stably expresses Cas9protein by using lentivirus transfection technology.This constrcted cells line laid the foundation for CRISPR library screening.First,three plasmids including LentiCas9-Blast,pSPA X2,and pMD 2.G were co-transfected into human renal epithelial cells (HEK293T)to obtain recombinant lentivirus with high titers.N2a cells were infected with the recombinant lentivirus,and then screened by Blasticidin.Finally,several monoclonal cell lines expressing Cas9protein were isolated by limiting dilution.The expression of Cas9expression in N2a-Cas9cell line was determined by western blot,and the high cleavage activity of Cas9was also examined by using lentivirus-based reporter vector system.By using CellTiter-Glo ®reagent,the cell proliferation activity was well detectable and not decreased in N2a-Cas9cell lines,where Cas9gene was expressed in a high level.Therefore,N2a-Cas9cell line was successfully constructed using a lentiviral transfection system,which can provide a basis for genome-wide CRISPR screening to identify crucial host factors regulating Rabies virus neuro-tropism.Key words :gene editing;lentivirus;genome-wide CRISPR screening;murine neuroblastoma收稿日期：2020-02-11基金项目：兽医生物技术国家重点实验室自主课题（SKLVBP201801）作者简介：张纪文（1993-），男，河南驻马店人，硕士研究生，主要从事兽医微生物及其分子生物学研究.*通信作者：E-mail ：****************；*********************Corresponding author张纪文，等.用于CRISPR文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建第12期CRISPR-Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9）是存在于细菌或古生细菌中的一种抵御外源DNA 侵入的适应性免疫反应系统[1]。

基因敲除实验步骤

基因敲除实验步骤嘿，咱今儿就来讲讲基因敲除实验这档子事儿！你想啊，这基因就好比是生物体的一套神秘密码，而基因敲除呢，就是要去修改或者删掉其中的一些关键部分。

这可不容易，但别怕，咱一步一步来。

首先呢，得选好你要敲除的那个基因，这就像是在茫茫密码本里找到你要动的那一部分，得精准，可不能找错咯。

然后，设计出专门针对这个基因的工具，就像是一把特制的小钥匙，能准确地去开启或者关闭这个基因。

接下来，就是把这个工具送到细胞里面去。

这可不是随便就能送进去的呀，得用些巧妙的办法，比如利用一些载体，就好像给这把小钥匙找了个合适的交通工具，让它能顺利到达目的地。

到了细胞里，这工具就开始发挥作用啦！它会找到目标基因，然后按照我们的设计，要么把它删掉，要么让它失去功能。

这过程中，可得时刻留意着，看看是不是真的敲除成功了。

怎么看呢？那就得用各种检测手段啦，就像给细胞做个体检，看看那个基因是不是真的被搞定了。

你说这像不像一场和基因的小战斗？我们就是那指挥作战的将军，得精心策划每一步，稍有不慎可就前功尽弃啦！而且啊，这实验可不是一次就能成功的哟，有时候可能得反复尝试好多回呢。

就跟你学骑自行车似的，一开始总会摔倒，但多练几次不就会了嘛。

在做基因敲除实验的时候，还得特别小心，别一不小心敲错了其他基因，那可就麻烦大啦！这就好比你本来想去剪个头发，结果一剪刀下去，把耳朵给剪了，那可不行呀！总之呢，基因敲除实验是个精细活儿，需要我们有耐心、有技术、还要有那么一点点运气。

但一旦成功了，那可就太有成就感啦！说不定还能为科学研究做出大贡献呢！所以呀，别害怕，大胆去尝试，说不定你就是下一个基因敲除大师哟！。

拟南芥At4g37820基因CRISPR敲除与表型分析

拟南芥At4g37820基因CRISPR敲除与表型分析拟南芥At4g37820基因CRISPR敲除与表型分析引言：拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种常用的模式植物，被广泛用于植物生物学研究。

近年来，CRISPR-Cas9基因编辑技术的出现，使得研究者能够更方便地对拟南芥基因进行精确操控和功能验证。

本文通过CRISPR-Cas9技术对拟南芥基因At4g37820进行敲除，进一步研究At4g37820在拟南芥生长发育中的表型变化与调控机制。

材料与方法：首先，设计合适的CRISPR引物以定点敲除At4g37820基因。

通过体外转录和翻译后的Cas9蛋白与设计的sgRNA形成RNP复合物，并导入拟南芥野生型株系进行基因敲除。

随后，使用PCR和测序技术验证克隆株中的敲除突变，筛选出目标敲除的阳性植株。

结果与讨论：经过筛选，我们成功获得了多个At4g37820基因敲除的阳性拟南芥株系。

通过对比野生型和敲除株系的生长形态观察，发现At4g37820基因敲除株系的株高显著低于野生型株系。

同时，叶片形态也发生了明显变化，敲除株系的叶片更小且形状异常。

进一步的根系形态观察表明，敲除株系的根长和根数也减少。

这些表型变化与At4g37820基因在拟南芥发育过程中扮演的角色密切相关。

At4g37820基因是一种编码无机磷转递酶（inorganic phosphate transporter）的基因，主要参与植物对磷素的吸收和运输。

拟南芥作为一种基于土壤营养状况对营养素吸收和分配高度敏感的植物，At4g37820基因在磷素代谢中的重要性不言而喻。

敲除At4g37820基因导致根系对磷素的吸收能力下降，从而影响了植物的生长发育。

进一步的研究表明，At4g37820基因的敲除还影响了植物的叶绿素合成和光合作用效率。

叶绿素含量减少导致叶片逐渐变黄，减弱了光合作用的能力，进而影响植物的光合产物合成和生长发育。

自学自讲(基因敲除)

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治疗措施研究方面的应用
急性排斥反应的半乳糖转移酶基因敲除, 用此方法培育的动物的器官可以移植到人体而无排斥反应。他们已成功培育半乳糖转移酶基因敲除猪, 且已经开展了将该基因敲除猪的心脏移植至狒狒体内的实验,经移植后的狒狒存活了 2 -6 个月( 均值为 78天),且均未出现超急性排斥反应的表现。
gene double knockout mice[ J] . FASEB J. 1999, 13( 6): 667-75.
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参考文献
[ 5 ] Leheste JR, Melsen F , Wellner M, et al.Hypocalcemia and osteopathy in mice with kidney-specific megalin gene defect[ J] .
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免疫学方面的应用
近年来,在免疫学方面出现了几十种免疫分子基因敲除动物模型, 将免疫学研究特别是免疫耐受的研究推到一个新的阶段。例如: TCR 基因敲除后 ,小鼠胸腺发育不全, 脾中 B 细胞增多 ; 免疫球蛋白 u链基因被敲除后 ,B 细胞发育受阻 ; MHC I 和 II 类抗原基因敲除后, 小鼠缺乏 CD4 +、CD8 +型 T 细胞; β2
insights on the pathogenesis of ocular albinism type 1[ J] .Hum Mol
Genet . 2000, 9( 19): 2781-2788. [ 4] Witting PK, Pettersson K, Ostlund-Lindqvist AM , et al.Inhibition by a coantioxidant of aortic lipoprotein lipid peroxidation and atherosclerosis in apolipoprotein E and low density lipoprotein receptor

基因敲除方法的原理应用

基因敲除方法的原理应用1. 概述基因敲除是一种常用的遗传学实验技术，通过将目标基因从细胞或生物体中删除，以研究基因在生物体中的功能和调控机制。

本文将介绍基因敲除方法的原理和常见应用。

2. 基因敲除方法的原理基因敲除方法主要包括两个步骤：构建敲除基因载体和敲除基因导入目标细胞或生物体。

2.1 构建敲除基因载体1.确定目标基因：首先需要确定要敲除的目标基因。

可以通过文献资料和数据库查询，分析基因序列和功能等信息，选择合适的目标基因。

2.设计敲除基因：设计针对目标基因的敲除基因，通常采用DNA重组技术构建。

敲除基因通常包括选择标记基因和目标基因序列特异性引物。

3.构建敲除基因载体：将设计好的敲除基因插入适当的载体中，如质粒或病毒载体。

2.2 敲除基因导入目标细胞或生物体1.选择合适的敲除基因导入方法：根据目标细胞或生物体的特性和要求，选择合适的基因导入方法，常见的方法包括细胞转染、病毒载体导入和转基因动物等。

2.导入敲除基因：将构建好的敲除基因载体导入目标细胞或生物体中，通过基因重组等技术使敲除基因与目标基因发生相应的重组事件。

3. 基因敲除方法的应用基因敲除方法被广泛应用于基因功能研究、药物研发、疾病模型构建等领域。

以下列举几个常见的应用案例：3.1 基因功能研究通过基因敲除方法，可以在细胞或生物体中敲除目标基因，观察其对生物体的影响，以揭示目标基因在生物体中的功能和调控机制。

例如，敲除特定的转录因子基因，可以研究其对基因表达和细胞分化的影响。

3.2 药物研发基因敲除方法可以用于筛选药物靶点和评估药物疗效。

通过敲除潜在的靶点基因，观察其对疾病模型动物的影响，以评价该靶点的重要性和药物的效果。

这对于药物研发和治疗策略的选择具有重要意义。

3.3 疾病模型构建利用基因敲除方法，可以构建基因敲除动物模型，模拟特定疾病的发生和发展过程。

通过敲除与疾病相关的基因，可以研究疾病的发病机制、病理过程和药物治疗的有效性。

基因敲除技术的基本原理和应用

基因敲除技术的基本原理和应用1. 基因敲除技术的概述基因敲除技术是一种通过人为干预来改变生物体特定基因表达的方法。

它是基于基因组工程技术的基础上发展起来的。

2. 基因敲除技术的基本原理基因敲除技术的基本原理是通过人为设计和构建特定的DNA序列，通过转染或转化将其导入到目标细胞中，从而抑制或破坏目标基因的正常功能，进而实现对目标基因的敲除。

3. 基因敲除技术的方法3.1 siRNA敲除法siRNA（small interfering RNA）是一种通过RNA干扰机制来靶向特定基因的技术。

它通过设计合成与目标基因互补的双链小分子RNA，并通过导入细胞内抑制目标基因的表达。

3.2 CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9系统是一种新兴的基因编辑工具，可以实现高效、精准地靶向敲除目标基因。

该系统包括CRISPR RNA (crRNA) 和转录单元结合酶Cas9。

通过引导RNA与Cas9结合，可精确指导Cas9蛋白靶向到特定的DNA序列，从而实现基因敲除。

3.3 TALEN技术TALEN（Transcription activator-like effector nuclease）技术是一种利用转录激活样结构域的蛋白质与核酸酶结合来敲除基因的方法。

它可以实现对特定DNA序列的敲除，具有较高的精准性和特异性。

4. 基因敲除技术的应用4.1 功能基因研究基因敲除技术可以帮助研究人员确定特定基因在生物体发育、生长、代谢等方面的作用。

通过敲除特定基因，可以观察到其缺失对生物体功能的影响，从而揭示出该基因的功能和作用机制。

4.2 疾病模型研究基因敲除技术可以构建疾病模型，帮助研究人员深入了解某些疾病的发生机制。

通过敲除与特定疾病相关的基因，在动物模型中观察到与人类疾病相似的表型，可以用来研究疾病的发展过程和潜在治疗方法。

4.3 基因治疗基因敲除技术可用于基因治疗，即通过敲除异常基因来恢复或调节正常基因的功能。

基因敲除的原理及应用

基因敲除的原理及应用前言基因敲除是一种重要的分子生物学技术，它通过特定的操作使得目标基因在细胞或生物体中失去功能。

基因敲除对于研究基因功能和疾病发生机制具有重要的意义，也在农业、医药等领域具有广泛的应用前景。

原理基因敲除的原理是通过干扰目标基因表达来实现。

具体说，通过介导特定的DNA修复机制，使得目标基因的DNA序列在细胞中发生改变，导致基因失去功能。

基因敲除可以分为两种主要的方法：CRISPR/Cas9系统和RNA干扰。

CRISPR/Cas9系统CRISPR/Cas9系统是一种新兴的基因编辑技术，它基于细菌天然的免疫系统。

通过设计合成一段目标基因特异性的RNA，并与Cas9蛋白结合，形成一个双链RNA将导致Cas9蛋白在目标基因上发生剪切，从而实现基因敲除。

RNA干扰RNA干扰是一种通过介导RNA分子进行基因敲除的技术。

该技术通过合成特异性的双链RNA，将其导入目标细胞，RNA分子会与目标基因的mRNA相结合，导致mRNA降解，从而抑制目标基因的表达。

应用基因敲除在医学、农业等领域有着广泛的应用。

研究基因功能基因敲除是研究基因功能的重要工具之一。

通过敲除特定基因，可以观察目标基因参与的信号通路、调控网络以及该基因对于细胞生物学过程的影响。

这有助于揭示基因与疾病发生相关机制，并为研发相关治疗手段提供理论基础。

研究疾病发生机制基因敲除在疾病研究中起到重要作用。

通过敲除与某种疾病相关的基因，可以研究该基因对疾病发生的具体作用。

例如，敲除某些恶性肿瘤相关基因后，可以观察到肿瘤细胞的增殖受到抑制，从而为肿瘤治疗提供策略。

农业应用基因敲除技术在农业领域有着广泛的应用前景。

通过敲除与农作物病虫害相关的基因，可以使作物具备更强的抗性。

此外，基因敲除还可以用于改良农作物的品质和产量等重要性状。

结论基因敲除技术是一种重要的分子生物学技术，通过干扰目标基因表达来实现。

它在研究基因功能、疾病发生机制以及农业领域都具有广泛的应用前景。

基因特异性敲除技术及其在生物学中的应用

基因特异性敲除技术及其在生物学中的应用随着科技的不断进步，人类在生物学这个领域取得了很多令人瞩目的成就。

其中，基因编辑技术就是最为引人关注的研究方向之一。

特别是在基因特异性敲除技术（CRISPR-Cas9）的出现后，这项技术的研究进展更加迅速，引起了国际学术界的广泛关注。

本文旨在介绍基因特异性敲除技术的原理和应用，以及它对生物学领域产生的重大影响。

一、基因特异性敲除技术的原理CRISPR-Cas9技术是一种高效、精准的基因编辑技术，可以在基因组特定的位点上切断DNA分子。

它的核心机制是利用特定的酶类蛋白Cas9和靶向RNA (sgRNA)识别、结合并切割DNA。

这样，就可以针对性地修饰或删除基因序列，实现对基因的特异性敲除。

其原理流程如下图所示：其最显著的优点是具有较高的精准度、灵活性和便捷性。

这种技术对于研究基因功能、药物研发以及植物、动物育种等方面都具有重要意义。

二、基因特异性敲除技术的应用领域1.基因功能研究CRISPR-Cas9技术在基因功能研究方面的应用最为广泛。

通过使用这种技术，基因研究人员可以针对感兴趣的基因进行敲除，然后观察到其是否影响生物的表型。

通过这种方法，可以确定这些基因对组织、器官或生物的哪些方面有影响，从而更好地理解生物的本质。

以肺癌相关基因Pten作为例子，科学家利用CRISPR技术在小鼠中敲除了Pten，结果发现小鼠出现了肺癌，这一发现引发了对Pten在肺癌发生中的重要作用的研究。

2.药物研发CRISPR-Cas9技术还可以用于药物研发。

通过基因编辑技术，可以制造被编辑的小鼠模型，模拟人类疾病，并通过筛选药物对其进行治疗。

例如，科学家使用这种技术制造了一种基于肝癌基因的小鼠模型。

通过使用这种模型，科学家可以尝试使用多种药物，并确定哪种药物是最有效的。

3.植物与动物育种通过CRISPR-Cas9技术可以敲除或编辑目标基因，从而改变作物和动物基因组中的性状、性质等特征，用于促进育种工作的进展。

一种制备拟南芥自噬基因突变体的方法及应用[发明专利]

专利名称：一种制备拟南芥自噬基因突变体的方法及应用专利类型：发明专利
发明人：黄晓,刘易林,谭慧琼,李发强
申请号：CN202111204379.4
申请日：20211015
公开号：CN114107373A
公开日：
20220301
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种制备拟南芥自噬基因突变体的方法及应用，所述的方法为在野生型拟南芥中，使用CRISPR/Cas9系统沉默ATG8基因的拷贝基因，所述的拷贝基因为ATG8a、ATG8b、ATG8c、ATG8d、ATG8e、ATG8f、ATG8g、ATG8h和ATG8i。

所述引用为降低植物营养循环利用。

本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可以在较短时间内达到精确、有效地敲除全部ATG8基因的多突变体，为后续研究ATG8基因家族的功能奠定坚实基础。

本发明还提供了ATG8基因在降低植物营养循环利用方面的应用，为培育营养高效利用的植物新品种提供了新的基因资源，在农业生产上具有重要的应用价值。

申请人：华南农业大学
地址：510642 广东省广州市天河区五山路483号
国籍：CN
代理机构：广州粤高专利商标代理有限公司
代理人：段卉
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CRISPRCas9基因敲除研究进展

902021年第1期CRISPR/Cas9基因敲除研究进展白祥慧（青海师范大学生命科学学院，青海西宁 810008）摘要：功能基因组学的发展促进基因敲除技术的进步，基因敲除技术从载体的构建到细胞筛选再到动物模型都取得长足进步。

基因敲除手段种类繁多，其中CRISPR/Cas9作为常用的基因编辑技术，具有高效、便捷、精确等优点，在农业、医学、生物学的模型构建中被广泛运用。

随着科研工作的逐渐深入，CRISPR/Cas9技术逐渐渗透到植物和微生物研究领域中。

文章综述近年来CRISPR/Cas9的应用，为科研工作的开展提供参考。

关键词：CRISPR/Cas9；基因；敲除中图分类号：S 852 文献标识码：A 文章编号：1672-9692（2021）01-0090-03Research progress of CRISPR/Cas9 gene knockoutBai Xianghui(College of Life Science, Qinghai Normal University, Qinghai Xining 810008)Abstract: The development of functional genomics has promoted the development of gene knockout technology, which has made great progress from vector construction to cell screening to animal models. There are many kinds of gene knockout methods, among which CRISPR/Cas9, as a common gene editing technology, has the advantages of high efficiency, convenience and accuracy, making it widely used in the construction of models in agriculture, medicine and biology. CRISPR/Cas9 technology has gradually infiltrated the field of plant and microbial research as scientific work demands. In the paper, the application of CRISPR/Cas9 in recent years is briefly reviewed to provide reference for the development of scientific research.Key words: CRISPR/Cas9; Gene; Knockout收稿日期：2020-11-17作者简介：白祥慧，硕士在读，研究方向为动物生理。

基因敲入敲出技术在基因功能研究中的应用

基因敲入敲出技术在基因功能研究中的应用随着基因工程技术的不断发展，各种新的基因操作技术也接踵而至，其中基因敲入敲出技术作为一种较为成熟的技术，已经在基因功能研究中得到了广泛的应用。

本文将从基因敲入敲出技术的原理、方法和应用等方面进行探讨。

一、基因敲入敲出技术的原理和方法基因敲入敲出技术主要是指将人工合成的DNA片段通过某种方式导入到生物体内，从而达到某种特定的目的，如研究基因功能、治疗基因疾病等。

基因敲入敲出技术主要有以下几种方法：1. 基因转染基因转染是通过化学方法将外源基因材料转移到细胞内，达到基因敲入的目的。

目前常用的基因转染方法有磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、电击法、微波和激光法等。

基因转染方法成本相对较低，但是效率较低，且对不同的细胞型号、组织和物种的适应性差异较大。

2. 基因炮击基因炮击是一种基因敲入技术，它利用高压氦气或金属微粒将外源DNA粒子加速到指定的细胞表面，使得DNA颗粒穿过细胞膜，达到基因敲入的目的。

这种方法的优点是能够高效地传递基因材料，并且适用于不同种类的细胞。

3. 基因酶基因酶是一种通过利用蛋白质工具进行基因敲入和敲出的技术。

目前常用的一种基因酶是锌指核酸酶（ZFN），它是一类利用酶切技术将外源DNA片段剪切下来并导入到指定的位置上，从而达到基因敲入效果的技术。

基因酶方法的优点是能够准确控制敲入部位和效果，但是缺点是使用成本较高，并且需要专业技术支持才能实现。

4. CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9技术是近年来较为流行的一种基因敲入技术，它通过利用CRISPR/Cas9蛋白复合体与著靶基因结合，进一步将原来DNA序列精准地“剪切”并实现普通基因编辑、点突变和基因组插入等操作。

CRISPR/Cas9技术因为其操作简单、成本低廉等特点而备受关注，对于基因编辑疗法等方面的研究具有广阔的应用前景。

二、基因敲入敲出技术在基因功能研究中的应用基因敲入敲出技术在基因功能研究中的应用主要包括以下几个方面。

基因敲除及其在功能研究中的应用

基因敲除及其在功能研究中的应用基因是生命的基本结构，它决定了生物的性状。

在过去的几十年里，随着基因技术的不断发展，人们对基因的认识也日益深入。

其中，基因敲除是一种常用的基因技术，它通过破坏目标基因来探究该基因的功能。

在本文中，我们将探讨基因敲除及其在功能研究中的应用。

一、基因敲除的原理基因敲除是一种通过破坏目标基因来探究该基因功能的技术。

它的原理在于将细胞内的目标基因突变或剪切，使其无法正常表达或产生功能性蛋白。

目前，常用的基因敲除技术包括RNA干扰、CRISPR-Cas9和TALEN等。

1. RNA干扰RNA干扰是通过引入人工合成的小RNA（siRNA或miRNA）来特异性靶向目标基因RNA从而抑制其表达的方法。

siRNA与靶基因的RNA相互结合，形成RNA酶复合物，使RNA酶活性增强，降解RNA，从而抑制目标基因的表达。

miRNA则通过结合靶基因扩散，通过不同的机制抑制靶基因的表达。

RNA干扰技术具有特异性高、噪音低等优点，已被广泛应用于细胞生物学和分子生物学领域中。

2. CRISPR-Cas9CRISPR-Cas9是一种基因编辑技术。

它利用RNA分子在引导下，将Cas9酶切割DNA靶标的特定序列。

这种技术的优点在于定点精准、可对多种细胞类型大规模筛查和操作等。

由于其化学复杂性和高度可编程能力，CRISPR-Cas9目前已成为显微注入基因敲除策略的主力军。

3. TALENTALEN（Transcription Activator-Like Effector Nucleases）技术是一种能够靶向及精确剪切DNA的基因编辑方法。

TALEN核酸酶由一个转录激活因子（Transcription Activator-LikeEffector,TALE）和一个DNA内切酶（nuclease）组成。

通过将TALE和nuclease序列组合成新的核酸酶并识别特定的DNA序列，即可剪切目标基因。

二、基因敲除在功能研究中的应用基因敲除技术在很多方面有着广泛的应用，主要体现在以下几个方面。

利用CRISPR

颜静宛，陈子强，周淑芬，等．利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统创制水稻品种ＧＷ２基因的突变体［Ｊ］．江苏农业科学，２０２４，５２（３）：７３－７８．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２４．０３．０１１利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统创制水稻品种ＧＷ２基因的突变体颜静宛，陈子强，周淑芬，王　锋（福建省农业科学院生物技术研究所／福建省农业遗传工程重点实验室，福建福州３５０００３）摘要：培育具有育种价值的ＧＷ２基因编辑的水稻优异新品种在水稻育种中具有重要意义，利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑技术，以生产上广泛推广应用的１３份水稻品种为材料，对粒质量基因（ＧＷ２）进行定向性状改良，通过农杆菌转化创制出一批无Ｔ－ＤＮＡ元件的水稻非转基因ＧＷ２突变纯合株系。

结果表明：１３份Ｔ０代水稻转基因中，有２８．０％～５９．１％植株的ＧＷ２基因发生了突变，纯合突变株数量占总突变株数量的３５．０％，双等位突变株数量占总突变株数量的１４．２％，杂合突变株数量占总突变株数量的５０．８％。

此外，不同水稻品种发生的突变类型也略有不同。

对１３份Ｔ２代非转基因水稻ＧＷ２突变纯合株进行千粒质量性状的考种分析。

与对应的野生型亲本品种相比，纯合突变水稻植株的千粒质量显著提高１０．８１％～５８．２２％。

本研究结果极大地丰富了ＧＷ２的突变类型，为不同水稻品种的高产稳产创造了重要的种质资源，同时也为利用基因编辑提高水稻产量提供了有价值的育种信息。

关键词：水稻；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；基因编辑；粒质量；ＧＷ２基因；突变中图分类号：Ｑ３４４＋．１４；Ｓ５１１．０１文献标志码：Ａ文章编号：１００２－１３０２（２０２４）０３－００７３－０６收稿日期：２０２３－０４－０８基金项目：福建省科技计划———省属公益类科研院所基本科研专项（编号：２０２０Ｒ１０２７００８）；福建省农业高质量发展超越“５５１１”协同创新工程（编号：ＸＴＣＸＧＣ２０２１００２）。

基因组编辑技术在生物科技中的前沿

基因组编辑技术在生物科技中的前沿应用：疾病治疗、农业改良、生物进化等领域的最新研究成果
未来研究趋势：基因组编辑技术的优化和改进、多基因编辑技术的发展、伦理和法规的制定等
挑战与机遇：基因组编辑技术面临的伦理、法律和技术挑战，以及未来发展的机遇和前景
CRISPR-Cas9系统：介绍 CRISPR-Cas9的发现、工作原理和在基因组编辑中的应用
基因组编辑技术在农业生物技术中的应用转基因作物的培育抗病、抗虫、抗草等性状的改良产量和品质的提高
减少有害基因的传播：通过基因组编辑技术，可以减少有害基因的传播，降低对环境和生物的影响。
保护濒危物种：基因组编辑技术可以帮助保护濒危物种，通过修复有害基因或增加有益基因，提高物种的适应性和生存能力。
基因组编辑技术的合法性：各国对基因组编辑技术的法律规定和监管政策
基因组编辑技术的专利保护：相关专利申请和授权情况
基因组编辑技术的伦理审查：伦理审查机制和流程
基因组编辑技术的法律责任：涉及基因组编辑技术的法律纠纷和法律责任问题
各国对基因组编辑技术的监管政策监管政策对基因组编辑技术发展的影响伦理与法律问题的监管原则未来监管政策的展望
基因组编辑技术的伦理与法律问题
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基因组编辑技术的新进展：介绍近年来在基因组编辑技术领域取得的重要进展和突破
基因治疗：介绍基因组编辑技术在基因治疗领域的应用，包括罕见病、遗传病和癌症治疗等

转基因与基因敲除knockoutmice

转基因 • 基因敲除• 表型分析 •影像分析• 慢病毒• 基因资源
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MicroRNA载体
关键因素
• DNA concentration • Injection buffer • Visualizing pronuclei • Timing of injection • Size of DNA • Copy number ：随机的 • Position Effect insulator
• 1982年，Palmiter和Brinster，Nature，超级鼠
转基因动物研究历史
1. 20世纪60年代末和70年代初，John Gurdon向蛙卵和小鼠胚胎注射mRNA，研究mRNA能否在动物卵细胞和早期胚胎中翻译。
2. 1974年，Jaenisch和Mintz首次报道应用显微注射法获得SV40DNA转基因小鼠。
Spontaneous P<0.0005%
Induced
Random （随机突变）
Targeted
（定向突变）
X-ray mutagenesis 0.05% Chemical mutagenesis 0.1%
Transgene（转基因）10% Homologous Recombination（同源重组）
转基因与基因敲除
-基因工程动物模型的构建
1. Overview.
（概述）
2. Transgenic technology
（转基因技术）
3. Gene targeting
（基因打靶技术）
4. Present
(动物模型的现状)
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转基因动物(transgenic animal) • 概念：用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能