基因编辑方法CRISPRCas9
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据 CRISPR-Cas 系统的特性对此系统进行改造产生了第 3 代人工核酸内切酶技术——CRISPR-Cas9 技术。该技术通过小片段的 RNA 介导对入侵的核酸进行靶向定位并通过Cas酶对核酸进行酶切、 降解。 • CRISPR-Cas9 技术是一种多物种适应性的，位点特异性的有效基因组编码工具。
effector nuclease，TALEN）技术
锌指核酸酶（ZFN）＆转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术
Cell 2014 157,1262-1278 Figure2B 不论是TALEN技术还是ZFN技术，其定向打靶都依赖于DNA序列特异性结合蛋 白模块的合成,将蛋白模块与限制性内切酶 (FokⅠ) 的DNA切割域融合而得到。由蛋白 特异结合域定位，DNA切割域剪切。
降低sgRNA/Cas9脱靶率的方法
Cell 2014 157,1262-1278 Figure6A,B Cas9的两个内切酶活性域为RuvC和HNH,两个亚基分别负责对一条DNA单链的切割。任一亚 基的失活都将形成DNA单链断裂（nicked DNA）。 当结合于两条互补的 DNA 链上相邻位置的一对 sgRNA 同 时引 导Cas9 D10A 识别并切割靶 位点时才能造成 DSB，从而加大了识别的长度，有效的提高了 Cas9-sgRNA 技术的特异性。
毒载体，可实现外源基因在目标细胞内稳定的传代表达。
gRNA的活性检测
•限制性内切酶法 当 Cas9/sgRNA靶点位置中间序列存在限制性内切酶切位点时，如果通过 Cas9/sgRNA 发生突
变，这个位点将可能被破坏，而不能被 内切酶酶切。可采用电泳的方法估计突变效率， 以突 变效率的高低来衡量sgRNA 的活性。 •非配对内切酶法
T7 核 酸 内 切 酶 I（T7 endonuclease I，T7E1） 能够识别不完全配对 DNA 并对其进行切割， 如果通过 Cas9/sgRNA 发生突变，将基因组DNA 做 PCR，将相对应的 PCR 产物与野生型 DNA的 PCR 产物等量混合，并退火杂交，将产生非配对DNA 片段，将能被非配对内切酶 T7E1 剪切。用 电泳的方法估计突变效率，以突变效率的高低来衡量 sgRNA 的活性。 •SSA 活性检测
辑。
CRISPR-Cas9技术的应用进展 1. CRISPR/Cas 系统可以作为一种位点特异性基因编辑平台
Cell 2014 157,1262-1278 Figure2A Cas9-sgRNA 在靶位点切割产生DSB后， 细胞可以通过两种方式对DNA 进行修复， 非同源末 端连接 （non-homologous endjoining，NHEJ）修复方式和同源重组方式（homology-directed repair，HDR）。 NHEJ 往往使得核酸链被剪切的区域发生基因突变，导致编码的基因Knockdown。 而HDR往往通过供体 DNA 与基因组 DNA 之间的同源重组造成靶位点的纠正或者靶向插入外源基因 Knockin。
原则：
• 选择的序列必须在全基因组中进行比对，原间隔序列必须唯一，否则会对其他基因进 行敲除而出现错误的实验结果。
• 优先选择 DSB 位点的侧翼存在重复序列（如果 DSB 的侧翼存在重复序列，在进行非同 源末端重组时能够精确的介导断裂位点碱基的缺失）。
• PAM 的5‘端尽量存在酶切位点。（有利于后期的活性检测）
Cell 2014 157,1262-1278 Figure2A
CRISPR-Cas9 技术 • 原理：规律性重复短回文序列簇（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，
CRISPRs） • CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌在不断进化的过程中获得一种适应性免疫防御机制，研究者根
ຫໍສະໝຸດ Baidu
构建重组质粒
构建方案 ： 1. 一是将gRNA 与 Cas9 连入同一个质粒载体中并以双启动子启动，载体中携带荧光报告基因
（用于流式细胞仪筛选）或抗性基因（用于药物筛选） 。 2. 二是将 gRNA与 Cas9 分别连载不同的载体上，两个载体携带有不同的荧光报告基因或抗性
基因
载体选择： 慢病毒载体 以HIV-1的主要功能元件为基础构建起来的转基因和基因治疗载体。区别于腺病
重组质粒导入细胞/生物体
Cell 2014 157,1262-1278 Figure6C,D,E C、将编码Cas9和sgRNA的表达质粒直接转染至细胞系中。 D、将纯化的Cas9和体外表达的sgRNA显微注射至受精卵，快速得到转基因动物模型。 E、将编码CRISPR组分的高效价的病毒载体转导至组织或细胞，完成特定时间，组织的基因编
Cell 2014 157,1262-1278 Figure4
CRISPR-Cas9 技术
sgRNA 的设计
• 选择 PAM（NGG）5‘端的一段碱基序列20nt作为原间隔序列，即敲除的靶位点。(PAM， Protospacer adjacent motifs 原间隔序列临近基序。一般形式为 NGG，其作用是将间 隔序列定位于入侵的噬菌体或质粒的 DNA 序列中)
一个终止子插入 luciferase（GFP）的编码区中央，luciferase（GFP）就会失去活性。为检测 Cas9/sgRNA 剪切活性，将一个 Cas9/sgRNA的靶点位置序列插在终止子后。在Cas9/ sgRNA 的作 用下，靶点位置产生 DSB，细胞通过同源重组方式修复 DNA，形成一个有活性的luciferase。通 过与对照组的比值变化就可反应 Cas9/sgRNA 剪切的活性水平。
基因编辑方法CRISPRCas9
基因组编辑技术
又称基因组定点修饰技术，通过在某些物种基因组中进行靶向特异性的突变，从而解答并提 出更多精确的生物学问题。
方法包括： •锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）技术 •转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like •Cas9/gRNA 系统(CRISPR-cas9技术)
effector nuclease，TALEN）技术
锌指核酸酶（ZFN）＆转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术
Cell 2014 157,1262-1278 Figure2B 不论是TALEN技术还是ZFN技术，其定向打靶都依赖于DNA序列特异性结合蛋 白模块的合成,将蛋白模块与限制性内切酶 (FokⅠ) 的DNA切割域融合而得到。由蛋白 特异结合域定位，DNA切割域剪切。
降低sgRNA/Cas9脱靶率的方法
Cell 2014 157,1262-1278 Figure6A,B Cas9的两个内切酶活性域为RuvC和HNH,两个亚基分别负责对一条DNA单链的切割。任一亚 基的失活都将形成DNA单链断裂（nicked DNA）。 当结合于两条互补的 DNA 链上相邻位置的一对 sgRNA 同 时引 导Cas9 D10A 识别并切割靶 位点时才能造成 DSB，从而加大了识别的长度，有效的提高了 Cas9-sgRNA 技术的特异性。
毒载体，可实现外源基因在目标细胞内稳定的传代表达。
gRNA的活性检测
•限制性内切酶法 当 Cas9/sgRNA靶点位置中间序列存在限制性内切酶切位点时，如果通过 Cas9/sgRNA 发生突
变，这个位点将可能被破坏，而不能被 内切酶酶切。可采用电泳的方法估计突变效率， 以突 变效率的高低来衡量sgRNA 的活性。 •非配对内切酶法
T7 核 酸 内 切 酶 I（T7 endonuclease I，T7E1） 能够识别不完全配对 DNA 并对其进行切割， 如果通过 Cas9/sgRNA 发生突变，将基因组DNA 做 PCR，将相对应的 PCR 产物与野生型 DNA的 PCR 产物等量混合，并退火杂交，将产生非配对DNA 片段，将能被非配对内切酶 T7E1 剪切。用 电泳的方法估计突变效率，以突变效率的高低来衡量 sgRNA 的活性。 •SSA 活性检测
辑。
CRISPR-Cas9技术的应用进展 1. CRISPR/Cas 系统可以作为一种位点特异性基因编辑平台
Cell 2014 157,1262-1278 Figure2A Cas9-sgRNA 在靶位点切割产生DSB后， 细胞可以通过两种方式对DNA 进行修复， 非同源末 端连接 （non-homologous endjoining，NHEJ）修复方式和同源重组方式（homology-directed repair，HDR）。 NHEJ 往往使得核酸链被剪切的区域发生基因突变，导致编码的基因Knockdown。 而HDR往往通过供体 DNA 与基因组 DNA 之间的同源重组造成靶位点的纠正或者靶向插入外源基因 Knockin。
原则：
• 选择的序列必须在全基因组中进行比对，原间隔序列必须唯一，否则会对其他基因进 行敲除而出现错误的实验结果。
• 优先选择 DSB 位点的侧翼存在重复序列（如果 DSB 的侧翼存在重复序列，在进行非同 源末端重组时能够精确的介导断裂位点碱基的缺失）。
• PAM 的5‘端尽量存在酶切位点。（有利于后期的活性检测）
Cell 2014 157,1262-1278 Figure2A
CRISPR-Cas9 技术 • 原理：规律性重复短回文序列簇（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，
CRISPRs） • CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌在不断进化的过程中获得一种适应性免疫防御机制，研究者根
ຫໍສະໝຸດ Baidu
构建重组质粒
构建方案 ： 1. 一是将gRNA 与 Cas9 连入同一个质粒载体中并以双启动子启动，载体中携带荧光报告基因
（用于流式细胞仪筛选）或抗性基因（用于药物筛选） 。 2. 二是将 gRNA与 Cas9 分别连载不同的载体上，两个载体携带有不同的荧光报告基因或抗性
基因
载体选择： 慢病毒载体 以HIV-1的主要功能元件为基础构建起来的转基因和基因治疗载体。区别于腺病
重组质粒导入细胞/生物体
Cell 2014 157,1262-1278 Figure6C,D,E C、将编码Cas9和sgRNA的表达质粒直接转染至细胞系中。 D、将纯化的Cas9和体外表达的sgRNA显微注射至受精卵，快速得到转基因动物模型。 E、将编码CRISPR组分的高效价的病毒载体转导至组织或细胞，完成特定时间，组织的基因编
Cell 2014 157,1262-1278 Figure4
CRISPR-Cas9 技术
sgRNA 的设计
• 选择 PAM（NGG）5‘端的一段碱基序列20nt作为原间隔序列，即敲除的靶位点。(PAM， Protospacer adjacent motifs 原间隔序列临近基序。一般形式为 NGG，其作用是将间 隔序列定位于入侵的噬菌体或质粒的 DNA 序列中)
一个终止子插入 luciferase（GFP）的编码区中央，luciferase（GFP）就会失去活性。为检测 Cas9/sgRNA 剪切活性，将一个 Cas9/sgRNA的靶点位置序列插在终止子后。在Cas9/ sgRNA 的作 用下，靶点位置产生 DSB，细胞通过同源重组方式修复 DNA，形成一个有活性的luciferase。通 过与对照组的比值变化就可反应 Cas9/sgRNA 剪切的活性水平。
基因编辑方法CRISPRCas9
基因组编辑技术
又称基因组定点修饰技术，通过在某些物种基因组中进行靶向特异性的突变，从而解答并提 出更多精确的生物学问题。
方法包括： •锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）技术 •转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like •Cas9/gRNA 系统(CRISPR-cas9技术)