细胞培养

我培养的是3T3成纤维细胞，方法是：

（1）准备大量的3T3细胞，每个安瓿瓶装1－1000000个细胞，然后冻存。使用的细胞不超过20代。

（2）将3T3细胞加入175cm2的培养瓶中，用含有10％小牛血清DMEM培养。案每平方厘米15000个细胞接种。2天后换液，每4－5天传代。

（3）通过60Gy X射线或Co饲养细胞灭活。被照射的3T3细胞在4度条件下可存放3－4天。

（4）在无照射源的条件下，用丝裂菌素C灭活饲养细胞。

（5）在37度条件下，用400微克每毫升的丝裂菌素C处理单层3T3细胞1h。

（6）用胰蛋白酶消化丝裂菌素C处理过的细胞活，混悬细胞，用含有血清的培养液洗细胞2次。然后，用完全培养液混悬细胞调整细胞密度

分离培养大鼠腹腔巨噬细胞

一、实验材料：wistar大鼠（200－250g）；1.5%戊巴比妥钠(35mg/kg)；手术器械。生理盐水（或者D-HANKS）；1640（HYCLONE），胎牛血清（HYCLOEN）；离心管；苔昐蓝；二氧化碳孵箱；无菌操作台。

二、实验步骤

1）取wistar大鼠，体重200－250g，用1.5%戊巴比妥钠(35mg/kg)麻醉后，固定于鼠板上；2）腹部常规消毒后，剪开腹部皮肤,，在腹部正中剪开一0.2cm长切口，行手术插管并固定；3）将约20ml生理盐水注入腹腔，抽出灌洗液，重复灌洗10次；

4）将肺泡灌洗液移入离心管中，300g离心5min沉淀细胞；

5）用含10％胎牛血清的RPMI1640重悬AM，将AM浓度调至1×106/ml左右后，平均接种于约培养皿中。

6）在CO2孵箱370C培养2小时换液，用D-Hank’s冲去非贴壁细胞，370C继续培养24小时。

7）苔昐蓝吞噬实验显示，95％以上的AM具有活力。

三、讨论及注意事项

用生理盐水还是D-HANKS液体，或者PBS我均用过，都可以。但尽量不要让细胞在体外太久。

是个好帖子，不过跟帖在此恕我不能加分by victoh

脂质体法转染真核细胞（Lipofectamine法）

1．收获对数中期细胞，含10％FCS的DMEM重悬，调整细胞密度为1´105／ml，取2ml 种植于35mm塑料培养皿（NUNC）。

2． 1天后，细胞生长达到60－70％融合。(注：细胞密度过低则最后形成的克隆少，而密度过高时细胞已经过了对数分裂期，则细胞分裂差，转染效率低)。

3．各将约2mg DNA及10ml Lipofectamine（GIBCO）溶于2份100ml无血清DMEM，再将2份DMEM轻轻混匀，室温孵育30min以利于DNA－脂质体混合物形成，然后加入0.8ml

无血清DMEM轻轻混匀。（注：脂质体和DNA的比例随质粒的不同而可能有改变）4．用2ml无血清DMEM冲洗细胞，加入DNA－脂质体混合物，于5％CO2孵育箱37oC 过夜（约5hr，GIBCO推荐）。

5．次晨加入1ml双倍血清的DMEM，并在转录开始后18－24hr内（时间过长则细胞毒性大，时间过短则转染效率低，一般观察细胞毒性作用不强时可适当延长时间）换入含10％FCS的新鲜DMEM。置于37oC 、5％CO2孵育箱培养。

6．转染后48hr左右，待细胞生长接近融合时弃培养液，更换为含有G418的全培养液进行筛选，筛选浓度依对照试验。（注：对照实验可以同时进行，细胞种植密度、脂质体作用时间及筛选浓度等条件完全相同，但转染时不加DNA）

7．待对照组细胞完全杀死后，G418浓度降至200mg／ml形成持续筛选压力。

8．约10－20天后可见抗性克隆形成并增大，用记号笔在显微镜下标记，用吸管将单个克隆挑至培养瓶，继续筛选扩增。

9．单克隆长满一瓶，以1：10传代备用。（注：脂质体大多为瞬间转染，传代次数过多则失去表达，因此应尽量减少传代次数，但在长期压力选择下可能会形成稳定转染株）

同楼上的一样，是个好帖子，不过跟帖在此也请恕我不能加分by victoh

删帖内容，你可以pm战友或另开帖求助。

我养vero细胞的经验：

胰酶

用D-Hanks配制0.25％胰酶，过滤除菌

EDTA溶液

用D-Hanks配制0.03％EDTA溶液，过滤除菌。

配制时可配为10×，用时加高压灭菌的三蒸水。

消化液：

根据细胞不同，可将EDTA溶液与0.25％胰酶以7：1或其它体积比混合

消化前，将PBS及消化液在37度预热，将细胞用PBS洗两遍，并把残液洗净，加入适量的消化液，放在37度孵育半分钟至一分钟，在镜下观察，如细胞均变圆，将消化液倒掉，并残留少许（半毫升左右)消化液，轻轻拍打培养瓶，直至细胞脱落，若细胞未脱落，将培养瓶再放回37度孵育一会儿，继续前过程。然后加培养液轻轻吹打，分瓶。

注意越嫩的细胞越容易消化，所以传细胞时，别让细胞长得太满，及时传。

师姐摸索的小窍门，在此我整理出来与同道们分享。

在细胞传代时，我们实验室面临一个共通的问题：细胞消化时间比较长，这样既耽误时间，

又可能增加污染机会，我们师姐发现，先将培养瓶中培养液倒掉，然后使用生理盐水冲洗一遍，最后加入少许胰酶（0.25％），只需1－－2分钟，便可进行细胞吹打了，我们屡试不爽，请大家不妨一试。

多谢，不过这可不是您师姐发明的方法哦，只是平时一般用PBS或D-Hanks'洗by victoh

我翻了下，好像没有说S180肿瘤细胞的,S180腹水型肿瘤细胞平时可以在小鼠腹腔中转种传代.我们科室保种时就这样的.

在有的试验时需在培养瓶中培养一段时间,由于其增殖较快,培养时密度不宜大,一般10*5/ml 就够了;通常2天就需换一次液,由于其是悬浮细胞，无须消化,直接离心去上清,PBS洗涤,用含10%小牛血清的RPMI1640培养液就可以了.其要求条件相对较底,一般培养室都能达到.

我平时还养小鼠的淋巴细胞,我们养的是混合淋巴细胞,不是单一的细胞株(或系),主要特点是如果需要传代培养要加IL-2(出于经费考虑,我们就用人源IL-2,因为IL-2具有沿种系普向上约束性,而乡下无约束性)50~100u/ ml,换液时可以离心去上清,可以用PBS洗涤两一次,加入含10%小牛血清就可以了,其他注意事项同一般的培养.

AAV-293细胞我养了半年了，我觉得很好养，上面有战友提过了，可是我的经验和他不一样，。此细胞是比较怕冷，在培养箱外时间久了会飘起来。但也不是特别娇贵的，培养时用含有10%小牛血清的DMEM培养，一般是在80%左右传代。消化时用0.05%的胰酶消化，然后再轻轻晃动瓶子既可将其消化下来，不用等半分钟，用10%小牛血清的DMEM终止消化，再轻轻吹打散细胞，加入10%小牛血清的DME，放在CO2培养箱即可。战友们可以试试看哪种方法好些。希望版主加分

还有HELA细胞的培养，我有时间再发给大家

我再来发一个我培养的血管内皮细胞：

（1）将长10cm和直径2-10mm血管的一端结扎再5cm塑料注射器上。

（2）用20cmPBSA冲洗血管，以洗去血液。

（3）向血管灌注胶原蛋白酶液，直至流至血管下端。然后，用止血钳夹血管下端。在室温条件下，孵育含有胶原蛋白酶液的血管10min。

（4）用锋利的手术剪在止血器的稍上方剪断血管，然后用10cmPeti培养皿收集胶原蛋白酶液。

（5）用10mlPBSA浸洗血管腔，然后将PBSA加入在操作步骤4收集的胶原蛋白酶液。（6）将消化下来的细胞离心（100g,5min)

（7）通过用培养液混悬和离心，将细胞洗2次。

（8）用生长培养液混悬细胞团，然后将细胞接种于涂有明胶的培养皿或培养瓶。

（9）用常规的姨蛋白酶消化法进行传代培养。

关于HELA 细胞的培养