乙内酰脲水解酶基因在大肠杆菌中的克隆表达
节杆菌乙内酰脲水解酶与GST蛋白融合表达及纯化
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文 章编 号 ： ０ ９ ０ ０ （Ｏ ８０ — ８ ２ ０ １０ — Ｏ ２２ ０ ）６ ０ ５ — ３
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节杆菌乙内酰脲水解酶与GST蛋白融合表达及纯化
节杆菌乙内酰脲水解酶与GST蛋白融合表达及纯化李洪贞;张惟材;汪建华;熊向华【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2008(19)6【摘要】目的:构建节杆菌BTB01乙内酰脲水解酶(HyuH)与GST融合表达载体,利用大肠杆菌表达GST-HyuH融合蛋白并纯化.方法:将节杆菌HyuH基因插入载体pGEX-KG构建重组表达质粒pGEX-KG-HyuH;SDS-PAGE检查GST-HyuH的表达;利用薄层层析检查融合蛋白的HyuH活性;最后利用谷胱甘肽-Sepharose 4B 树脂纯化融合蛋白GST-HyuH.结果:SDS-PAGE表明重组菌在相对分子质量77x103处有特异的蛋白表达条带,且重组菌可以水解5-苯基乙内酰脲,纯化得到了有HyuH活性的纯度较高的GST-HyuH融合蛋白.结论:得到了有HyuH活性的GST-HyuH,为进一步研究HyuH的修饰奠定了基础.【总页数】3页(P852-854)【作者】李洪贞;张惟材;汪建华;熊向华【作者单位】军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;沈阳药科大学,辽宁,沈阳,110016;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.GST－NRP－1融合蛋白的原核表达及纯化 [J], 韩正祥;张梦瑾;徐杰;王红梅;杜秀平;陈翀;徐开林2.小鼠CD36基因片段合成、表达及GST融合蛋白的表达和纯化 [J], 王欣;陈莹;陈杰3.TRAF6-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化 [J], 孙利;王晓辉;关薇;唐刘君;王建;杨晓明;汪思应4.乙内酰脲水解酶基因在大肠杆菌中的克隆表达 [J], 李迎丽;张惟材;汪建华;黄留玉5.GST-Nogo-66融合蛋白的表达及纯化 [J], 范有明;黄缄;刘福玉;蔡明春;高钍琪;黄庆愿因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
葛仙米中SOD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
葛仙米中SOD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达汪滢;章秀;吴双秀;王全喜【摘要】采用PCR技术从葛仙米(Nostoc sphaeroides)总DNA中克隆了一段基因序列,该序列与基因库中已公布的编码普通念珠藻(Nostoc commnue)超氧化物歧化酶的氨基酸序列同源性为98%.将该基因插入含,T7启动子的质粒pET-32a(+)中构建表达质粒pET-sod,然后将该表达质粒转入大肠杆菌BL21中进行蛋白表达,表达菌株用1mmol/L IPTG诱导表达数小时后,产生较多重组的蛋白,且该蛋白以可溶性蛋白形式存在.SDS-PAGE分析表明:在相对分子量约为22kd的位置有一条明显蛋白质带.将诱导表达后的蛋白通过亲和层析的方法进行蛋白纯化;NBT光还原法测定表达产物的比活力,每毫克纯化蛋白约为2550U.【期刊名称】《上海师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2008(037)003【总页数】4页(P301-304)【关键词】葛仙米;SOD基因克隆;诱导表达【作者】汪滢;章秀;吴双秀;王全喜【作者单位】上海师范大学生命与环境科学学院,上海,200234;上海师范大学生命与环境科学学院,上海,200234;上海师范大学生命与环境科学学院,上海,200234;上海师范大学生命与环境科学学院,上海,200234【正文语种】中文【中图分类】Q785;Q949.220 引言超氧化物歧化酶(SOD)是的专一清除剂，它们都能有效地清除对机体有害的超氧自由基，在防护自由基的损伤及植物逆境生理等方面起到重要作用[1].葛仙米(Nostoc sphaeroides)是球状念珠藻[2]的俗称,它具有较高的营养价值,是重要的经济藻类.关于它的遗传背景所知甚少,其SOD基因的研究也未见报道.本实验根据Genebank中公布的编码普通念珠藻(Nostoc commune)超氧化物歧化酶的基因序列,利用同源性设计引物,采用PCR技术克隆了球状念珠藻中的编码超氧化物歧化酶的基因,并在大肠杆菌中进行异源蛋白表达,该重组蛋白以可溶性蛋白形式存在，利用亲和层析的方法对该重组蛋白进行了纯化,用NBT光还原法测定了该酶的活性,为念珠藻属的研究提供基础资料.1 材料和方法1.1 实验材料本实验所用的材料葛仙米购自中科院武汉水生所; 大肠杆菌DH5α，BL21，质粒pUC-19，pET-32a(+)由本试验室保存；考马斯亮蓝G-250、各种限制性内切酶为(Takara) (Dalian) Co., Ltd产品; 抗生素、IPTG购自华美生物工程公司;牛血清白蛋白(BSA)(沪试)为国药集团化学试剂有限公司产品;Ni-NTA 为Novagen产品.1.2 实验方法提取葛仙米总DNA，采用SDS-CTAB法[3].质粒抽提、酶切反应、电泳鉴定、DNA片段回收、连接反应、大肠杆菌的转化、SDS-PAGE均按照《分子克隆试验指南》操作[4].DNA的测序由上海联合基因生物技术公司完成.1.2.1 引物合成及PCR扩增上游引物BamHI下游引物SalI反应体系为50ul,PCR反应条件：94℃预变性5 min，一个循环；94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35个循环.1.2.2 葛仙米超氧化物歧化酶基因在大肠杆菌中表达质粒的构建和转化将葛仙米超氧化物歧化酶基因片段用BamHI，SalI双酶切，回收片段，与预先经双BamHI，SalI双酶切的 pET-32a(+)回收片段相连接，构建大肠杆菌表达质粒pET-sod.将此表达质粒转入大肠杆菌BL21中.经含有Amp (100ug/L)抗性的培养基筛选表达质粒.1.2.3 葛仙米超氧化物歧化酶基因在大肠杆菌中的表达及纯化挑取单克隆在LB培养基含Amp(100ug/L)中，37℃下培养至OD600=0.4～0.6，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导6h后收集菌液，将收集的菌用Tris-Cl(pH 7.4)洗3～4次，超声破碎.将破碎后的菌以12000 r/min离心10 min，分别取破碎后的全菌、上清和沉淀SDS-PAGE分析.蛋白纯化按照Novagen公司的Ni-NTA His.Bind Resins的操作说明书进行：将蛋白过事先准备好的Ni2+Agrose 柱，静置30～40 min，后用20 mmol/L咪唑洗脱杂蛋白，用250 mmol/L的咪唑缓冲液洗脱结合蛋白.1.2.4 酶活性测定和蛋白含量测定酶活性测定用NBT光还原法[5].SOD活性=2(OD560对照-OD560处理)×稀释倍数/OD560空白.酶比活力(U/mg)=SOD酶液活性(U/ml)/酶液蛋白含量(mg/ml).蛋白质含量的测定方法：将纯化后的蛋白稀释一定倍数后至300 μL试管内，再加入考马斯亮蓝G-250 2.7mL混匀，室温下静置2 min，测其595 nm下的吸光度，根据牛血清蛋白标准曲线计算其蛋白含量.1.DL-2000 marker;2.Negative control ;3.Amplified PCR product.图 1 SOD 基因的PCR扩增2 结果与分析2.1 葛仙米超氧化物歧化酶基因的克隆将以葛仙米总DNA为模板进行PCR扩增的产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，可得到一条长与预期大小相符的DNA扩增片段(图1).将PCR产物双酶切回收后由T4连接酶与pUC-19相连后进行序列测定.测序结果如图2，GenBank登录号为EF569675.2.2 葛仙米超氧化物歧化酶在大肠杆菌中表达载体的鉴定克隆在pUC-19的基因片段用BamHI及SalI双酶切，回收片段，并与事先经BamHI及SalI双酶切的pET-32a(+)相连接，构建表达质粒pET-sod，酶切鉴定结果如图3.2.3 葛仙米超氧化物歧化酶基因在大肠杆菌中的表达SDS-PAGE分析表明，在相对分子量约为22 kDa的位置上有一条明显的表达条带(图4)，表明蛋白以可溶性蛋白存在上清中.2.4 表达产物的纯化和活性测定经IPTG诱导表达的大肠杆菌菌体，冰浴下经超声破碎、Ni2+亲和纯化后，利用NBT光还原法测定表达产物的活性.换算出该酶比活力为2550 U/mg.图 2 葛仙米超氧化物歧化酶基因的核苷酸序列及相应的氨基酸序列1. DL-2000；2. PCR product of Nostoc sphaeriodes;3. pET32+BamHI/SalI;4. pET-sod+ BamHI ;5. pET-sod+ SalI;6. pET-so d+;7.λ\Hind-III.图 3 表达载体的鉴定1.Molecular weight marks;2.free pET-sod of BL21;3.sediments ofBL21 with pET-sod; 4.supernatent of BL21 with pET-sod; 5.total of BL21 with pET-sod; 6.purified expression protein.图 4 蛋白在大肠杆菌中的表达SDS-PAGE分析3 讨论超氧化物歧化酶(SOD)是生物有机体清除超氧阴离子自由基的一个重要的保护酶.目前已经对许多生物的SOD及其基因进行了广泛的研究，在蓝藻中亦有过报道：如前期报道的发菜SOD酶基因的克隆[6]，卢敏等克隆了普通念珠藻(地木耳)的Fe-SOD基因并在大肠杆菌中进行了表达[7].而葛仙米的SOD基因却从未见报道.本实验以Genebank中公布的编码普通念珠藻超氧化物歧化酶的基因序列设计引物，首次成功地克隆了葛仙米中编码超氧化物歧化酶的基因，运用BLAST软件将该基因在核苷酸和氨基酸水平上与Genebank中公布的地木耳(Nostoc commune)的Fe-sod基因进行同源性比较，结果两者在核苷酸和氨基酸水平上的一致性分别为96%和98 %,和发菜[6]在核苷酸和氨基酸水平上一致性分别为98%和100%,说明SOD基因在近源物种间相似度非常高.此外，本实验还构建了高效表达的重组表达载体，表达率占可表达蛋白的18%以上，且以可溶性蛋白形式存在，将表达后的蛋白进行纯化，并根据测定超氧化物歧化酶常用方法-NBT光还原法测定该纯化蛋白的活性，结果表明: 该纯化后的蛋白的比活力为2550U/mg, 具有明显的超氧化物歧化酶活性特征，这说明该表达蛋白为超氧化物歧化酶.超氧化物歧化酶是公认的抗逆酶之一，但超氧化物歧化酶是如何在基因水平调控其耐胁迫能力的，所知甚少.但有人提出假设：清除氧自由基的机制对增强原核生物的抗胁迫有重要作用[8].本实验所用材料葛仙米和发菜同属于念珠藻属(Nostoc)，但它们的生境又有不同：发菜主要分布在干旱、半干旱地区，对极端环境有着很强的适应性.而葛仙米是水生念珠藻，主要生长在水稻田.本研究中葛仙米超氧化物歧化酶体外表达的酶的活性与前期报道的发菜体外表达的酶活相同，说明SOD酶基因的体外表达结果不能区分发菜与葛仙米的抗逆性高低.可能有其他的抗逆因子影响发菜抵御恶劣的环境，这些问题都有待进一步的研究.同时本研究也为进一步研究葛仙米中其他功能蛋白提供了一个参考，有利于推动葛仙米产业的发展.参考文献:[1] 程光宇, 吴国荣, 储慧君. 朱桔Mn-SOD的纯化、鉴定及浓度梯度胶电泳在其中的应用[J].植物研究, 2004, 24(2): 240-245.[2] 胡鸿均, 魏印心. 中国淡水藻类[M]. 北京：科学出版社, 2006.[3] KIM S，LEE C H，SHIN J S，et a1．A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP [J]．Nucleic Acids Research，1997，25(5)：1085-1086.[4] SAMBROOK J, FRITSCH E F, MANIATIS T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed[M]. New York: Cold Spring Laboratory Press, 1989.[5] 罗广华, 王爱国. 超氧化物歧化酶及其同工酶的活性测定和同工酶显示[M]. 北京：科学出版社, 1999.[6] 汪滢, 陈李萍, 陈晓,等. 发菜超氧化物歧化酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[J]. 植物研究, 2007, 27(3): 289-292.[7] 卢敏, 龚兴国, 郭建军,等. 念珠藻Fe-SOD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[J]. 浙江大学学报(工学版), 2006, 40(11): 2011-2015.[8] SHIRKEY B, KOVARCIK D P, WRIGHT D J. Active Fe-Containing Superoxide Dismute and Abundant sodF mRNA in Nostoc commune (Cyanobacteria) after Years of Desiccation[J]. Bact , 2000, 182(2): 189-197.。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的
研究
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究是利用基因工程
技术将人类胰岛素基因导入大肠杆菌细胞中，并使其表达和分泌人类
胰岛素。
研究的具体步骤如下：
1. 克隆：将人类胰岛素基因插入到大肠杆菌中的表达载体上，构建重
组胰岛素的基因工程菌株。
2. 表达：将重组胰岛素基因工程菌株进行培养和诱导表达，启动胰岛
素基因的转录和翻译，使其合成胰岛素多肽链。
3. 折叠：由于胰岛素中存在多肽链的结构，其需要正确折叠形成活性
结构。
通过培养条件的调控和辅助分泌蛋白的表达帮助胰岛素多肽链
正确折叠。
4. 分泌：经过折叠的胰岛素多肽链进入细胞分泌途径，通过胞外酶切，胰岛素分泌至外部培养液中。
5. 纯化：将培养液中的胰岛素进行纯化，去除其他杂质，得到纯度较
高的重组人胰岛素。
这种方法相比其他表达系统有以下优势：
1. 大肠杆菌生长快速且易于培养，并且具有可高效表达外源基因的能力。
2. 人类胰岛素的基因序列已经大量研究，其表达也相对成熟和稳定。
3. 大肠杆菌发酵工艺相对简单，易于工业化生产。
4. 经过纯化的重组胰岛素具有较高的活性和纯度，适用于临床应用。
第四章++基因在大肠杆菌和酵母的高效表达
湖南师范大学生命科学学院 袁婺洲
本章目录
4.1 基因的表达系统与表达策略 4.1.1 基因的表达系统 4.1.2 根据表达蛋白用途选择基因的表达策略
4.2 基因在大肠杆菌中的高效表达 4.2.1 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统 4.2.2 蛋白质的融合表达 4.2.3 蛋白质的分泌型表达 4.2.4 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性
4.3 基因在酵母中的高效表达 4.3.1 酵母表达系统概述 4.3.2 甲醇酵母表达系统 4.3.3 组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达
第一节 基因的表达系统与表达策略
基因的表达系统 基因的高效表达策略
一、基因的表达系统
表达载体的组成：
DNA复制及质粒DNA的筛选: 有DNA复制起点ori, 及Amp, Tet抗 性基因
糖性
启动子
乳糖启动子Plac的可控性：
cAMP
CAP
高效转录
基因工程中使用的乳糖启动 子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型，即Plac UV5
Plac 葡萄糖代谢
O cAMP浓度降低
基底水平转录
Plac
O
高效转录
Plac UV5 O
2. 核糖体结合位点
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构： ①位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列：5’ UAAGGAGG 3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它与大 肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合； ②翻译起始密码子AUG； ③ SD序列与翻译起始密码子之间的距离(7bp)及碱基 组成； ④基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列
2023-2024学年高中生物苏教版选修3第1章 基因工程单元测试(含答案解析)
2023-2024学年苏教版高中生物单元测试学校 __________ 班级 __________ 姓名 __________ 考号 __________注意事项1．答题前填写好自己的姓名、班级、考号等信息;2．请将答案正确填写在答题卡上;一、选择题（本大题共计15小题每题3分共计45分）1.有关蛋白质工程和基因工程说法正确的是（）A. 蛋白质工程是基因工程的基础B. 蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作定向改变分子的结构C. 蛋白质工程是遵循中心法则进行的D. 基因工程和蛋白质工程产生的变异都是可遗传的【答案】D【解析】2.下列有关免疫系统组成的叙述错误的是（）A. 免疫系统包括免疫器官、免疫细胞和免疫活性物质B. 免疫器官是免疫细胞生成、成熟或集中分布的场所C. 免疫活性物质是由免疫细胞产生的发挥免疫作用的物质D. 淋巴细胞和吞噬细胞都起源于造血干细胞属于免疫细胞【答案】C【解析】解 A.免疫系统包括免疫器官、免疫细胞和免疫活性物质 A正确B.免疫器官是免疫细胞生成、成熟和集中分布的场所 B正确C.免疫活性物质是由免疫细胞或其他细胞产生的发挥免疫作用的物质 C错误D.淋巴细胞和吞噬细胞都是免疫细胞都是由造血干细胞分化来的 D正确故选 C3.土壤农杆菌含有一个大型的Ti质粒在侵染植物细胞的过程中其中的T-DNA片段转入植物的基因组若想用基因工程手段获取抗旱植株以下分析不合理的是（）A. 农杆菌不易感染单子叶植物是因为单子叶不能产生一种吸引农杆菌的物质B. 若用Ti质粒作为抗旱基因载体时目的基因的插入位置应该在T-DNA片段内C. 将重组Ti质粒导入农杆菌中时可以用钙离子处理细菌使其处于感受态D. 可使用微量注射器将抗旱基因直接注入子房中获得抗旱转基因植物【答案】D【解析】解 A.农杆菌具有趋化性双子叶植物的受伤组织会产生糖类和酚类等吸引农杆菌的物质而单子叶植物不能产生此类物质 A正确B.若用Ti质粒作为抗旱基因的载体目的基因的插入位置应该在T-DNA片段内 B正确C.将重组Ti质粒导入土壤农杆菌中时可以用钙离子处理细菌使其处于感受态 C正确D.用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌感染植物细胞后可通过植物组织培养技术得到具有抗旱基因的植物不能直接注入子房中获得抗旱转基因植物 D错误故选 D4.下列关于基因身份证的有关叙述中正确的是（）A. 由于基因身份证反映了个人全部的遗传信息因此能够准确地预测、预防和治疗遗传病B. 基因身份证能够反映个人的一些重要遗传信息人们可以根据基因身份证的信息选择合适的职业等C. 基因身份证能够反映个人的某些遗传信息但并不是基因身份证中所反映的信息一定能够表现D. 人类蛋白质组计划已经启动由于基因控制蛋白质的生物合成蛋白质的结构和功能将全部可以通过基因身份证推测【答案】C【解析】A、基因身份证能够反映个人的某些遗传信息不能反映了个人全部的遗传信息 A错误B、由于表现型由基因控制受环境影响故基因身份证中所反映的信息不一定都能够表现出来故人们不能根据基因身份证的信息选择合适的职业等 B错误C、基因身份证能够反映个人的某些遗传信息但并不是基因身份证中所反映的信息一定能够表现 C正确D、由于表现型由基因控制受环境影响故蛋白质的结构和功能不能全部通过基因身份证推测 D错误5.下列关于植物、动物以及微生物在基因工程应用方面的叙述错误的是（）A. 动物和微生物可以生产基因工程药物植物不能B. 三类生物技术操作中目的基因导入受体细胞的方式不同C. 三类生物技术操作原理相同D. 三类生物技术操作中用到的工具酶相同【答案】A【解析】解 A.动物、植物和微生物都可以生产基因工程药物 A错误B.将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法其次还有基因枪法和花粉管通道法等将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射技术将目的基因导入微生物细胞原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少最常用的原核细胞是大肠杆菌其转化方法是先用 Ca^2+处理细胞使其成为感受态细胞再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子完成转化过程 B正确C.三类操作的原理都是基因重组 C正确D.三类操作中用到的工具酶相同都是限制酶和DNA连接酶 D正确故选 A6.下列有关基因工程中限制性内切酶的描述错误的是（）A. 一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B. 限制性内切酶的活性受温度影响C. 限制性内切酶能识别和切割RNAD. 限制性内切酶可从原核生物中提取【答案】C【解析】略7.下列关于酶的叙述中不恰当的一项（）A. 不应将加酶洗衣粉溶于沸水中使用B. 与无机催化剂相比酶降低活化能的作用更明显C. 麦芽糖酶水解后产生许多氨基酸分子D. 酶能催化原来不能进行的反应【解析】解 A、高温会破坏酶的空间结构使酶失活 A正确B、与无机催化剂相比酶降低活化能的作用更明显 B正确C 、麦芽糖酶的本质为蛋白质水解后产生许多氨基酸分子 C正确D、酶不能催化原来不能进行的反应 D错误．故选 D．8.下列叙述符合基因工程概念的是（）A. B淋巴细胞与肿瘤细胞融合B. 将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌获得能产生人干扰素的菌株C. 用紫外线照射青霉菌使其DNA发生改变通过筛选获得青霉素高产菌株D. 自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上【答案】B【解析】解 A.B淋巴细胞与肿瘤细胞融合这是细胞工程中的细胞融合技术 A错误B.将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌获得能产生人干扰素的菌株这符合基因工程的概念 B正确C.用紫外线照射青霉菌使其DNA发生改变通过筛选获得青霉素高产菌株这属于诱变育种 C错误D.自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上这是噬菌体侵染细菌没有采用基因工程技术 D错误故选 B9.下列关于基因工程应用的叙述正确的是（）A. DNA分子杂交技术可用于基因诊断B. 一种基因探针能检测水体中的各种病毒C. 真核基因不能用来进行原核生物的遗传改良D. 基因治疗就是把有缺陷的基因诱变成正常基因【答案】A【解析】A、基因诊断又称DNA诊断或分子诊断通过分子生物学和分子遗传学的技术直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常从而对疾病做出判断利用的技术就是DNA分子杂交 A正确B、基因探针是用放射性同位素（或荧光分子）标记的含有目的基因DNA片段一种基因探针只能检测水体中的一种或一类病毒 B错误C、真核基因能用来进行原核生物的遗传改良 C错误D、基因治疗就是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中达到治疗疾病的目的 D 错误10.基因治疗是指用正常基因取代或修补病人细胞中有缺陷的基因从而达到治疗疾病目的治疗方式下列关于基因治疗的说法中正确的是（）A. 基因治疗可以治愈所有的遗传病B. 基因治疗的原理是基因突变C. 基因治疗时可用经过修饰的病毒作载体D. 经基因治疗治愈的病人其后代不会再患同种基因疾病【解析】A、基因治疗只能治疗因基因异常导致的疾病例如白化病、红绿色盲等而不能治愈所有的遗传病 A错误B、基因治疗的原理是基因重组 B错误C、基因治疗要把正常基因导入病人体内有缺陷的细胞中所以在治疗时可用经过修饰的病毒作载体 C正确D、基因治疗的对象是具有致病基因的体细胞没有涉及原始性细胞所以其后代仍会再患同种基因疾病 D错误11.中华鲟是地球上最古老的脊椎动物被称为“活化石” 研究者试图通过蛋白质工程改造中华鲟体内的某些蛋白质使其更加适应现在的水域环境以下说法错误的是（）A. 该工程可以定向改变蛋白质分子的结构B. 改造蛋白质是通过改造基因结构而实现的C. 改造后的中华鲟和现有中华鲟仍是同一物种D. 改造后的中华鲟的后代不具有改造的蛋白质【答案】D【解析】A、蛋白质工程可以定向改造蛋白质分子的结构 A正确B、改造蛋白质是通过改造基因结构而实现的 B正确C、改造后的中华鲟具有新的性状但其和现有中华鲟仍是同一物种 C正确D、蛋白质工程改造的是基因可以遗传给子代因此改造后的中华鲟的后代也具有改造的蛋白质 D错误12.下列关于基因工程中操作工作的叙述正确的是（）A. 切开DNA分子的酶为限制性核酸内切酶简称内切酶B. 将两个DNA片段连接为一个DNA的酶为DNA聚合酶C. 质粒是常用的运载体D. 抗虫棉的抗虫性状一定能稳定遗传【答案】C【解析】解 A.切开DNA分子的酶为限制性核酸内切酶简称限制酶 A错误B.将两个DNA片段连接起来的酶是DNA连接酶 B错误C.质粒是常用的运载体 C正确D.抗棉虫的抗虫性状受多种因素影响不一定能够遗传下去 D错误故选 C13.下面是四种不同质粒的示意图其中ori为复制必需的序列 amp为氨苄青霉素抗性基因 tet为四环素抗性基因箭头表示限制酶的酶切位点下列有关叙述正确的是（）A. 基因amp和tet是一对等位基因常作为基因工程中的标记基因B. 质粒是指细菌细胞中能自我复制的小型环状DNA和动植物病毒的DNAC. 限制酶的作用部位是DNA分子上两个特定的核苷酸之间的磷酸二酯键D. 用质粒4将目的基因导入大肠杆菌该菌不能在含青霉素的培养基上生长【答案】C【解析】解 A.基因amp和tet在同一个DNA分子上不是一对等位基因 A错误B.质粒指细菌细胞中能自我复制的小型环状的DNA 动植物病毒的DNA不属于质粒 B错误C.限制性内切酶的作用部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 C正确D.重组质粒4中氨苄青霉素抗性基因完好四环素抗性基因被破坏因此用质粒4将目的基因导入大肠杆菌该菌能在含青霉素的培养基上生长 D错误故选 C14.下列有关基因工程应用的叙述错误的是（）A. 动物基因工程技术主要用于提高动物的生长速度B. 利用转基因技术生产的药物已经有很多种如抗体、疫苗、激素等C. 基因治疗是治疗遗传病最有效的手段治疗后产生的变异一般是不可遗传的D. 利用植物基因工程提高农作物抗虫能力时所用杀虫基因可以是Bt毒蛋白基因【答案】A【解析】A、动物基因工程技术主要用于动物品种改良、建立生物反应器、器官移植等提高动物的生长速度仅是其中的一个应用 A错误B、利用转基因技术可生产如抗体、疫苗、激素等多种药物 B正确C、基因治疗是治疗遗传病最有效的手段治疗后产生的变异一般是不可遗传的 C正确D、植物抗虫基因有Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等提高农作物抗虫能力时所用杀虫基因可以是Bt毒蛋白基因 D正确15.利用基因工程技术生产羧酸酯酶（CarE）制剂的流程如图所示下列相关叙述错误的是（）A. 过程①②都在体外进行二者需要的原料相同B. 当大肠杆菌处于感受态时才能进行过程③C. 工程菌合成的羧酸酯酶的空间结构与小菜蛾合成的羧酸酯酶的空间结构相同D. 在稻田中使用工程菌会改变大肠杆菌种群的基因库【答案】C【解析】解 A. 图中过程①表示通过逆转录法合成相应的DNA 过程②表示利用PCR技术对目的基因进行扩増二者都在体外进行需要的原料都是脱氧核糖核苷酸 A正确B.过程③将目的因导入受体细胞前常用 Ca^2+处理大肠杆菌使其成为感受态细胞使大肠杆菌更容易吸收重组DNA分子 B正确C.小菜蛾合成的羧酸酯酶需要经过内质网和高尔基体的加工与利用工程菌制备的羧酸酯酶的空间结构不相同 C错误D.在稻田中使用工程菌会改变大肠杆菌种群的基因库 D正确故选 C二、多选题（本大题共计5小题每题3分共计15分）16.如图是培育抗除草剂玉米的技术路线图含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达其产物能催化无色物质K呈现蓝色转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长下列相关叙述错误的是（）A. 过程①用两种限制酶就可防止酶切产物自身环化B. 过程②用Ca^2+处理可提高转化成功率C. 过程③应在培养基中加入除草剂和物质KD. 筛选得到的A是无农杆菌附着的转化愈伤组织【答案】A, D【解析】17.新型冠状病毒(2019−nCOV)的检测可以采用实时荧光RT−PCR （逆转录聚合酶链式反应）的方法RT−PCR的具体过程如图下列叙述错误的是（）A. PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶B. 过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增理论上需要\ 2^n-2个引物BC. 该技术用于对某些微量RNA病毒的检测可提高检测的灵敏度D. PCR技术是利用DNA的热变性原理由PCR仪自动控制DNA的解聚与结合【答案】A, B【解析】解 A.PCR体系中需要的是耐高温的DNA聚合酶不是从受体细胞中提取的DNA 聚合酶 A错误B.过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增根据DNA分子半保留复制特点可知该过程理论上至少需要 2^n-1个引物B 因为PCR扩增DNA片段过程最高经过n次扩增形成的DNA分子数是 2^n个其中只有2条单链不含有引物 B错误C.利用实时荧光RT-PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测时可提高检测的灵敏度是因为增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量（或浓度）便于检测 C正确D.PCR反应过程包括高温变性、低温复性、中温延伸所以PCR技术是利用DNA的热变性原理由PCR仪自动控制DNA的解聚与结合 D正确故选 AB18.下图是利用基因工程技术构建重组表达载体的过程示意图其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶下列相关叙述正确的是（）A. 需要用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ来切割质粒B. 表达载体中的抗青霉素基因在受体细胞中能复制C. 表达载体中抗原基因的终止子位于抗青霉素基因的下游D. 表达载体中目的基因的上游有启动子和复制原点【答案】A, B, D【解析】解 A.限制酶SmaⅠ的识别序列位于目的基因上因此需要用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ来切割质粒 A正确B.表达载体中的抗青霉素基因是标记基因能够在受体细胞中复制 B正确C.表达载体中抗原基因的终止子位于抗青霉素基因的上游 C错误D.表达载体中目的基因的上游有启动子和复制原点 D正确故选 ABD19.下图是培育抗除草剂玉米的技术路线图含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达其产物能催化无色物质K呈现蓝色转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长下列相关叙述错误的是（）A. 过程①用两种限制酶就可防止酶切产物自身环化B. 过程②用\ Ca^2+处理可提高转化成功率C. 过程③应在培养基中加入除草剂和物质KD. 筛选得到的A是无农杆菌附着的转化愈伤组织【答案】A, D【解析】解 A.若过程①使用两种限制酶且这两种限制酶切割产生的粘性末端不同才可以防止酶切产物自身环化 A错误B.过程②用 Ca^2+处理可增大农杆菌细胞膜的通透性从而提高转化成功率 B正确CD.过程③培养基中加入除草剂筛选出来的是无农杆菌附着的转化愈伤组织、农杆菌附着的转化愈伤组织、农杆菌附着的未转化愈伤组织加入Ｋ物质筛选出来的是无农杆菌附着的转化愈伤组织和农杆菌附着的转化愈伤组织 C正确 D错误故选 AD20.发现真核生物中编码A蛋白的基因上游有能够增强基因表达的DNA序列被称为增强子增强子的作用机理如图下列相关叙述正确的是（）A. 增强子通过控制激活因子的合成发挥作用B. 增强子的核苷酸序列改变将引起A蛋白空间结构的改变C. 图中“？”处代表RNA聚合酶增强子可以增强其与启动子的结合D. 增强子发挥作用时需要依赖染色质的缠绕使其与A蛋白基因相互靠近【答案】C, D【解析】三、解答题（本大题共计5小题每题10分共计50分）21.（1）在利用基因工程大规模生产胰岛素时将胰岛素合成基因与质粒重组后导入大肠杆菌进行了表达以上过程除了证明质粒可以作为载体外还证明了________、________等21.（2）构建基因表达载体时常用的工具酶是________ 他们作用的化学键是________ 基因工程中不能将胰岛素合成基因直接导入大肠杆菌其原因是________21.（3）检测胰岛素合成基因是否导入受体菌时常用________作探针21.（4）胰岛素合成基因在大肠杆菌细胞内表达时遗传信息的传递方向是________ 经检测胰岛素合成基因的表达产物未能达到预期的生物活性导致这种差异的原因可能是表达产物未经________的加工【答案】体外重组的质粒可以进入大肠杆菌, 真核外源基因可以在原核细胞中表达等【解析】利用基因工程大规模生产胰岛素时将胰岛素合成基因与质粒重组后导入大肠杆菌进行了表达以上过程除了证明质粒可以作为载体外还证明了体外重组的质粒可以进入大肠杆菌真核外源基因可以在原核细胞中表达等【答案】DNA连接酶和限制性核酸内切酶, 磷酸二酯键, 胰岛素合成基因在大肠杆菌细胞中不能稳定遗传和表达【解析】构建基因表达载体时常用的工具酶是DNA连接酶和限制性核酸内切酶它们作用的化学键是磷酸二酯键基因工程中不能将胰岛素合成基因直接导入大肠杆菌其原因是胰岛素合成基因在大肠杆菌细胞中不能稳定遗传和表达必须构建基因表达载体【答案】（放射性物质标记的）胰岛素合成基因（的一条链）【解析】检测胰岛素合成基因是否导入受体菌时常用探针检测而检测胰岛素合成基因的探针是含有放射性物质标记的胰岛素合成基因的一条链【答案】DNA→（m）RNA→蛋白质, 内质网、高尔基体【解析】胰岛素合成基因在大肠杆菌细胞内表达时遗传信息的传递方向是DNA→RNA→蛋白质经检测胰岛素合成基因的表达产物未能达到预期的生物活性导致这种差异的原因可能是表达产物未经内质网、高尔基体的加工所致22.（1）过程①中要将上皮细胞的核移植给去核的卵母细胞而不能直接用上皮细胞进行培养的原因是______________________22.（2）过程②利用的技术是________ 过程③中涉及到了基因工程技术其中作为受体细胞的是________22.（3）过程③中获取的目的基因是________ 可以根据该基因的________设计引物利用PCR技术扩增目的基因片段按此方法和图示技术流程完成 Rag_2基因缺失小鼠的基因治疗涉及的酶有限制性核酸内切酶、DNA连接酶、________、________等22.（4）图中造血干细胞中的遗传物质至少有________个来源为检测 Rag_2基因的表达情况可提取治疗后小鼠骨髓细胞的________ 用抗 Rag_2蛋白的抗体进行杂交实验图中所述克隆技术属于________性克隆【答案】（1）上皮细胞的全能性低【解析】解（1）上皮细胞等体细胞的细胞全能性低而卵母细胞的细胞质中含有促进体细胞的细胞核全能性表达的物质因此要将上皮细胞的核移植给去核的卵母细胞而不是直接用上皮细胞进行培养【答案】（2）早期胚胎培养, ES细胞【解析】（2）过程②利用的技术是早期胚胎培养过程③中涉及到了基因工程技术其中作为受体细胞的是ES细胞【答案】（3）（正常的）\ Rag_2基因, 脱氧核苷酸序列（或碱基对序列或遗传信息）, 胰蛋白酶, 耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）【解析】（3）由图分析可知利用胚胎干细胞（ES细胞）对 Rag_2基因缺失小鼠进行基因治疗时过程③中获取的目的基因应为（正常的） Rag_2基因步骤③中在构建含有Rag_2基因的表达载体时可以根据 Rag_2基因的脱氧核苷酸序列设计引物利用PCR技术扩增 Rag_2基因片段分离、培养上皮细胞过程中需要用胰蛋白酶分散细胞 PCR技术扩增过程中需要用耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）基因导入过程中需要用限制性核酸内切酶、DNA连接酶【答案】（4）三, 蛋白质, 治疗【解析】（4）图中造血干细胞中的遗传物质至少有3个来源上皮细胞、卵母细胞和Rag_2基因为检测 Rag_2基因的表达情况可采用抗原—抗体杂交法即提取治疗后的小鼠骨髓细胞的蛋白质用抗 Rag_2蛋白的抗体进行杂交实验图中所述克隆技术属于治疗性克隆23.（1）抗虫棉能抵抗________的侵害提高棉花的产量和品质但不能抵抗病毒、病菌其目的基因﹣﹣Bt毒蛋白基因是从________这种细菌中分离得到的23.（2）Bt毒蛋白基因能与运载体整合成基因表达载体的根本原因是________ 抗虫棉的细胞能正常合成Bt毒蛋白的原因是________23.（3）将成功转入Bt毒蛋白基因的棉花体细胞培育为植株要利用________技术该过程中体细胞主要经历________两个阶段23.（4）大面积种植抗虫作物在环境保护方面的意义主要表现在________【答案】棉铃虫, 苏云金（芽孢）杆菌【解析】抗虫棉能抵抗棉铃虫的侵害提高棉花的产量和品质但不能抵抗病毒、病菌其目的基因﹣﹣Bt毒蛋白基因是从苏云金芽孢杆菌这种细菌中分离得到的【答案】二者的化学组成与结构相同, 都遵循中心法则共用一套遗传密码【解析】由于Bt毒蛋白基因与运载体的化学组成与结构相同并且Bt毒蛋白基因表达都遵循中心法则共用一套遗传密码子因此可以将Bt毒蛋白基因与运载体整合成基因表达载体导入到棉花细胞中使其表达出Bt毒蛋白【答案】组织培养, 脱分化和再分化【解析】将成功转入Bt毒蛋白基因的棉花体细胞培育为植株要利用组织培养技术该过程中体细胞主要经历脱分化和再分化两个阶段【答案】减少化学农药的用量减少环境污染和对人类的危害对保护环境有益【解析】大面积种植抗虫作物在环境保护方面的意义主要表现在减少化学农药的用量减少环境污染和对人类的危害对保护环境有益。
_乙酰乳酸脱羧酶在大肠杆菌中的克隆表达
文章编号 ： I77S97776k6778n73973IX97L
生
物
技
术
通
讯
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研究报告
!9乙酰乳酸脱羧酶在大肠杆菌中的克隆表达
李联正 !"#! 张惟材 !! 汪建华 !! 何维明 #
2H 军事医学科学院 生物工程研究所 ! 北京 2VVVT2 " 6H 西北农林科技大学 动物科技学院 ! 陕西 杨凌 T262VV
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基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究一、概述基因工程是一种革命性的生物技术，它允许科学家在分子水平上对生物体进行精确的操控和改造。
自从20世纪70年代基因工程技术诞生以来，它已广泛应用于医药、农业、工业等领域，为解决人类面临的诸多挑战提供了新的途径。
利用基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素是基因工程在医药领域的一个重要应用。
重组人胰岛素是一种通过基因工程技术生产的人胰岛素类似物，具有与天然人胰岛素相似的生物活性。
它主要用于治疗糖尿病等代谢性疾病，具有广阔的市场前景和重要的社会价值。
与传统的动物源胰岛素相比，重组人胰岛素具有纯度高、稳定性好、免疫原性低等优点，因此备受关注。
在大肠杆菌中发酵生产重组人胰岛素的过程涉及多个关键步骤，包括基因克隆、表达载体的构建、宿主细胞的选择、发酵条件的优化等。
通过这些步骤，可以实现重组人胰岛素的高效表达和分泌，从而生产出符合治疗要求的胰岛素产品。
本文旨在探讨基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究进展、技术原理、工艺优化以及未来的发展趋势。
通过深入了解这一领域的研究现状，可以为重组人胰岛素的生产提供理论支持和实践指导，进一步推动基因工程技术在医药领域的应用和发展。
1. 重组人胰岛素的重要性和应用背景重组人胰岛素，作为一种生物技术产品，在医学领域具有极其重要的地位。
它是通过基因工程技术，将人类胰岛素基因插入到大肠杆菌等微生物体内，使其能够生产与人体胰岛素功能相似的胰岛素。
这种胰岛素在治疗糖尿病方面发挥着至关重要的作用。
糖尿病是一种全球性的健康问题，影响着数以亿计的人口。
根据国际糖尿病联盟（IDF）的数据，全球约有62亿成年人患有糖尿病，预计到2045年这一数字将增至7亿。
糖尿病的治疗需要长期使用胰岛素，而重组人胰岛素因其与人体胰岛素的高度相似性，成为糖尿病治疗的首选药物。
重组人胰岛素的应用背景源于对胰岛素需求的不断增长。
在重组人胰岛素出现之前，糖尿病患者主要依赖从猪或牛体内提取的胰岛素进行治疗。
微生物乙内酰脲酶及其研究进展
微生物乙内酰脲酶及其研究进展
张惟材;邓兵兵
【期刊名称】《生物技术通讯》
【年(卷),期】1999(0)2
【摘要】乙内酰脲酶是广泛分布在微生物中的一类可降解乙内酰脲酶类化合物的酶系 ,包括乙内酰脲水解酶、N-氨甲酰氨基酸水解酶及乙内酰脲消旋酶。
微生物的乙内酰脲酶在结构与组成、立体选择性、底物专一性、反应条件和作用机制等方面有所不同 ,在各种 L-及 D-型氨基酸的酶法生产中具有良好的应用前景。
本文对乙内酰脲酶研究及应用的一般情况作了概述。
【总页数】4页(P141-144)
【关键词】乙内酰脲酶;微生物
【作者】张惟材;邓兵兵
【作者单位】军事医学科学院生物工程研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q936
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γ-PGA合成酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达
（ ＋ ） － ｐ ｇ ｓ Ｂ Ｃ Ａ， 导入 宿 主 Ｅ ｓ ｃ ｈ ｅ ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ ｃ ｏ ｌ ｉ Ｒ ｏ ｓ ｅ ｔ ｔ ａ中 ， 诱 导使 之 表 达 。 将发 酵 液 离心 去 除 茵 体 ， 得 到 上 清 液 用 旋 转 蒸 发 仪
浓 缩后 。 采用 Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 电泳 检 测 重组 菌 Ｅ ． ｃ ｏ ｌ ｉ Ｒ ｏ ｓ ｅ ｔ ｔ ａ ｌ ｐ Ｅ Ｔ ２ ８ ａ － ｐ ｇ ｓ Ｂ Ｃ Ａ 产 生的 ￣ ／ － Ｐ Ｇ Ａ分子量在 ２ ０ ０ － ３ ０ ０ ｋ Ｄ ａ 之 间，
ｃ ｏ ｌ ｉ Ｒｏ ｓ ｅ ｔ ｔ ａ， ａ ｎ ｄ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ ｉ ｔ ｔ ｏ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ．Ｄｅ ａ ｌ ｉ ｎ ｇ ｗｉ ｔ ｈ ｆ ｅ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｂ ｒ ｏ ｔ ｈ， ｃ ｅ ｎ ｔ ｉ ｒ ｆ ｕ ｇ ｅ ｄ ｔ ｏ ｒ ｅ ｍｏ ｖ ｅ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｂ ｏ ｄ ｙ ａ ｎ ｄ ｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎ ｅ ｄ ｓ ｕ ｐ ｅ ｍａ ｔ ａ ｎ ｔ ，ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ Ｓ ＤＳ － Ｐ ＡＧＥ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｏ ｒ ｅ ｓ ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｔ ｈ ｅ Ｐ ＧＡ ｍｏ ｌ ａ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｗｅ ｉ ｇ ｈ ｔ ｂ ｅ ｔ ｗｅ ｅ ｎ ２ ０ ０ — ３ ０ ０ ｋ Ｄａ ｐ ｒ ｏ －
将产物水解 ， 采 用 薄 层层 析 法 鉴 定 产 物 由 单 一 的谷 氨 酸 组 成 ， 表明 一 Ｐ Ｇ Ａ合成酶基 因ｐ ｇ ｓ Ｂ Ｃ Ａ 在 大 肠 杆 菌 中成 功 表
达。
关键词 ： 大肠 杆 菌 ； 聚谷氨酸合成酶； 克隆 ； 表 达
氢酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达
自由基，再将其清除，而ＣＡＴ正是其中非常重要的一种清除自由基的酶类，因此ＣＡＴ
在缺血性脑损伤治疗中有着非常重要的作用。 另外，ＣＡＴ在对肠上皮细胞的保护中发挥关键性作用。肠上皮细胞是肠黏膜屏障组
成中最重要的细胞成分，肠黏膜屏障遭到破坏时伴随着氧活性物质（ＲＯＳ）的增加，Ｒ０怒 作为细胞内第二信使可以激活多种转录因子，调控致炎细胞因子和化学因子的过度表 达，加重肠黏膜屏障功能的损坏。ＣＡＴ作为ＲＯＳ的清除剂可以使过氧化氢分解为水和
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ｃａｔａｌａｓｅ（ＣＡＴ）ｗｉｔｈ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ
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ＣＡＴ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ Ｎｅｓｔｅｄ ＰｅＲ
ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｓｍｉｄｓ
精氨酸脱亚胺酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及纯化
精氨酸脱亚胺酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及纯化刘咏梅;倪晔;李娜;李利峰;孙志浩【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2011(030)005【摘要】通过PCR扩增得到菌株编码ADI的arcA基因,并构建表达载体pET24a-ADI.将该载体导入大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达ADI基因的重组菌.对ADI诱导表达条件进行优化,结果发现宿主菌在A600达到1.0时加入0.2 mmol/L异丙基-β-D-口硫代半乳糖苷(IPTG),在30℃诱导4h酶活最高,为2.04 U/mL发酵液.经超声波破碎、HiPrep DEAE FF阴离子交换层析、SuperdexTM 200凝胶过滤层析,可获得SDS-PAGE电泳纯重组精氨酸脱亚胺酶(rADI).rADI相对分子质量大小为92 600,由两个相同亚基组成,纯化后的rADI比酶活达20.9U/mg.【总页数】7页(P750-756)【作者】刘咏梅;倪晔;李娜;李利峰;孙志浩【作者单位】江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122【正文语种】中文【中图分类】Q819【相关文献】1.人肝细胞癌相关抗原661基因在大肠杆菌中的克隆、表达及产物纯化 [J], 李树蕾;谭岩;刘力华;段秀梅;方艳秋;许淑芬2.水蛭素基因在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化 [J], 曾凡杰;华子春3.猪链球菌国内分离株精氨酸脱亚氨酶的克隆表达及其活性分析 [J], 张金秋;陆承平4.人神经生长因子基因在大肠杆菌中的克隆、表达及产物纯化 [J], 赵娟;何冰;江汉民;程秀玮;俞新大5.百日咳杆菌毒素S_1亚单位与谷胱甘肽S-转移酶融合基因在大肠杆菌中表达及其一步纯化 [J], 郑波;程继忠;皇甫永穆;海涛;戴五星;王建平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Thermomyces lanuginosus ZJB09222脂肪酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达
Thermomyces lanuginosus ZJB09222脂肪酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达雷丽华;郑仁朝;柳志强;黎小军;郑裕国【摘要】Thermomyces lanuginosus lipase is one of the most important industrial enzymes. Based on published DNA sequence, the full length cDNA of the lipase was cloned using RT-PCR method. It revealed that the cDNA of the T. lanuginosus lipase gene encoded a protein lipase of 292 amino acid residues. The open reading frame of the cDNA was cloned into the plasmid pET-28b, which was then transformed into E. coil BL21 （DE3）strain. The Mr of the expression product was 32 ku by SDS-PAGE. The recombinant E. coli BL21/pET28b-TLL exhibited highest activi-ty of 41U/mL at 28℃ for 7 h induction with 0. 1 mmol/L IPTG after screening ofthe best medium.%Thermomyces lanuginosus脂肪酶（简称TLL）是具有重要商业应用价值的脂肪酶之一。
运用RT-PCR技术，从Thermomyces lanuginosus ZJB09222基因组中克隆得到885bp脂肪酶基因cDNA序列，其结构基因编码蛋白包含292个氨基酸。
乳酸菌胞外蛋白水解酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
3-18K 型台式高速冷冻离心机 美国 Sigma 公司； Tgradient PCR 仪 Whatman Biometra 公司；DYCP-31A 水平电泳仪 北京六一仪器厂；U-3400 分光光度计 日 本 Hitachi 公司；TH2-82 型恒温振荡培养箱 上海医疗 器械厂。 1.4 方法
1.4.2 原核表达重组质粒的构建 对 pMD18-T-simple-R 和 pW425et 均以 Sac Ⅰ、Kpn Ⅰ
双酶切。切胶回收纯化后以 T4 DNA 连接酶连接。连 接产物应用 CaCl2 转化法转化至 thyA 基因缺陷型的大肠 杆菌感受态 E.coli X13 中，之后将转化产物在 LB 固体培 养基( 不添加胸腺嘧啶核苷) 上培养，筛选阳性重组体。
乳酸菌的降血压作用在于其代谢产生的蛋白酶可以
收稿日期：2009-12-14 基 金 项 目 ： 国 家 “ 8 6 3 ” 计 划 项 目 ( 2 0 0 7 A A 1 0 Z 3 2 2 ；2 0 0 6 A A 1 0 A 2 0 5 )；
国家自然科学基金项目(30671573；30700602；30870116)；吉林省科技发展计划项目(20080104) 作者简介：杨桂连(1978 —)，男，讲师，博士，主要从事动物微生物免疫学与分子生物学研究。E-mail：yangguilian@ * 通信作者：王春凤(1972 —)，女，教授，博士，主要从事动物微生物免疫学与分子生物学研究。E-mail：wangchunfeng@
利用天然乙内酰脲酶启动子在大肠杆菌中诱导N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的可溶性表达
利用天然乙内酰脲酶启动子在大肠杆菌中诱导N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的可溶性表达张伟【期刊名称】《中国医药工业杂志》【年(卷),期】2008(39)9【摘要】将来源于放射土壤杆菌（A．radiobacter）TH572的编码N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的基因克隆至质粒pET30a上，并转化大肠杆菌BL21（DE3），结果蛋白质大部分以包涵体形式表达。
本试验采用天然的乙内酰脲酶启动子（PHase，长度为209bp）构建质粒pGEMT—DCB，并优化了该启动子下游的核糖体结合位点（RBS）以促进表达。
【总页数】1页(P675-675)【关键词】D-氨基酸;酰胺水解酶;乙内酰脲酶;大肠杆菌;启动子;可溶性表达;天然;诱导【作者】张伟【作者单位】【正文语种】中文【中图分类】Q517;S643.1【相关文献】1.N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的融合表达、纯化和酶活性 [J], 钮利喜;石亚伟;袁静明2.海因酶和N-氨甲酰氨基酸水解酶的比例:由5-取代海因制备D-氨基酸的关键 [J], 姚忠;竺凯;周华;韦萍;欧阳平凯3.定点突变提高D-氨甲酰水解酶的可溶性表达 [J], 袁野;蔡渊恒;姜世民;姜卫红4.Burkholderia cepecia.njut01中D-海因酶和D-N-氨甲酰-氨基酸酰胺水解酶的纯化和性质 [J], 李家璜;李苏平;严明;姚忠;欧阳平凯5.假单胞菌菌株ON-4a中的一个新型N—氨基甲酰—L—氨基酸酰胺水解酶：在大肠杆菌中表达的N—氨基甲酰—L—半胱氨酸酰胺水解酶的纯化和特性研究Ohmachi T等[Appl microbiol biotechnol，2004，65（6）：686．693] [J], 宫倩;朱春宝因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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图!
Q4ER 1
表达产物的生物学活性分析
重组质粒 )*((!% !"# + 结构图
!G5BS2TUS4G5 &V; GW 2XUG&Y45V5S ;AVB&4C ;M""1) !"# +
由于乙内酰脲水解酶水解 %)*+ 开环产生的 9) 氨甲酰苯丙氨酸不易通过显色进行检测， 我们在反
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李迎丽等： 乙内酰脲水解酶基因在大肠杆菌中的克隆表达
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重组菌株乙内酰脲水解酶活力测定
以 %"23 为 底 物 分 别 测 定 了 节 杆 菌 26L#(、 （ 5.4） 53% ),Q0(L"(/R 和 2’*( ),6**(" !"# 3 的乙内 # 酰脲水解酶活性 （表 (） 。
酰脲的水解开环。乙内酰脲水解酶的表达对于乙内酰脲酶的催化机制研究及氨基酸的生物不对称合成都具有重 （ !"#$） ， 置于表达载体 H1##% 的 1? 启动子下游， 将构建的重 要意义。通过 EFG 技术扩增得到乙内酰脲水解酶基因 组质粒引入大肠杆菌 BD#% （*5A） 。 I*I3EJK5 分析在相对分子量 C$L* 处有一较强的表达带， 经薄层扫描分析目的 主要以可溶性形式存在， 活性分析表明表达产物具有天然的酶活性。 蛋白占全菌蛋白的 !$M ， 关键词： 乙内酰脲酶，乙内酰脲水解酶，基因表达 中图分类号： N4A 文献标识码： J 文章编号： $$$%3"#$4（#$$!）$"3$??%3$!
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微
生
物
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// 卷
离心收集菌体， 用生理盐水洗涤 " 次， !"# ! 培养物， 重悬于 #$%&’ #$%( %)*+ 底物悬液中， ,-. 水浴反 应 /0， 取上清液在硅胶 6 薄层 1"###23&45 离心 1&45， 板上展开， 展开剂为正丁醇 7 乙酸 7 水 8 / 7 1 7 1， 用 茚 三 酮 显 色， 阳 性 转 化 子 可 将 转 化 为 #$,( %)*+ 并进一步在 :1%3;<=>#) !"# ! 9)氨甲酰基苯丙氨酸， 的作用下转化为苯丙氨酸， 以苯丙氨酸标准品为对 照， 在相对应的位置可出现紫红色斑点。 !"# $%氨甲酰基氨基酸的测定 在试管中加 "&’ 反应液， 加 #$%&’ 1"( （ ?3@） 三氯乙酸终止反应， 再加入 #$%&’ =02A4B0 试剂并用
乙内酰脲水解酶基因在大肠杆菌中的克隆表达
# 李迎丽%， 张惟材%" 汪建华% 黄留玉% （% 军事医学科学院生物工程研究所 （ 南开大学生命科学学院
#
北京
%$$$?%）Leabharlann 天津A$$$?%）
摘
要： 节杆菌 B12$% 的乙内酰脲酶系能够水解 C3苄基乙内酰脲生成 D3苯丙氨酸， 其中乙内酰脲水解酶负责乙内
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材料和方法
材料 菌株和质粒： 大肠杆菌 （ -.+!,&/+!/* +(0/ ） BD#%
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" 通讯作者。 1+(： 2"3%$3""4!22#"；53-67(：896:;<+7,67= 9’>-67( ) ,’-
作者简介： 李迎丽 （%4?? @ ） ， 女， 河南三门峡人， 博士研究生， 研究方向为资源细菌及其工程学。 修回日期： 收稿日期： #$$!3$!3$#， #$$!3$23%"
乙内酰脲酶 （OPQ6:>’7:6R+） 是广泛存在于自然界 中的一种酶系， 一般包括乙内酰脲水解酶 （ OPQ6:>’7: 和 03氨甲酰基氨基酸水解酶 （ 03F6/.6-’P3 9PQ/’(6R+） ， 有些 情 况 下 还 有 乙 内 酰 脲 消 旋 酶 （ OPQ6:>’7: (6R+）
［%， #］ 。乙内酰脲酶在植物、 动物和微生物细 /6,+-6R+） 胞中分布广泛。利用乙内酰脲酶的立体选择性， 外
TT4
应体系中添加过量的 !"氨甲酰基苯丙氨酸水解酶， 使之进一步转化为苯丙氨酸， 以便于用茚三酮进行 显色， 这个方法也可用于乙内酰脲水解酶活性的定 量分析。 取 #$%&’ 菌液， 加入 ()* 体积 +(%),-./#" !"# 0 细胞悬液， 离心收集菌体， 与 #$%1 %"23 反应后， 取 反应产物的上清液 4 薄层层析法检测 （图 4） 。由 ’， ! 图可见不加底物的菌体和酶 " （ +(%),-./#" !"# 0） 加底物 %"23 没有出现产物显色斑点， 而有重组子 （5.4） 有紫红色斑 2’*( ),6**(" !"# 3 和酶 " 存在时， 点， 表明重组子能够把底物 %"23 转化为中间产物 并进一步在酶 888 的催化下， 转化为苯丙氨酸， !"07， 显示重组子具有生物活性。
!! 卷 " 期 #$$! 年 %# 月
微 生 物 学 报 !"#$ %&"’()&(*(+&"$ ,&-&"$
&’() !! *+,+-.+/
0’) " #$$!
! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !
［!］ 的高效表达已获得成功 ， 但乙内酰脲水解酶的表 ［A］
达比较困难， 曾做过一些尝试， 一般表达量都很低， 表达产物没有生物活性。我们就乙内酰脲水解酶的 表达问题进行了探索， 实现了该酶在大肠杆菌中的 活性表达。
挑取 DB 平板上的单菌落接种于含氨苄青霉素 的 DB 液体培养基中， A?Z #$$/T-7: 培养至 45"$$ 为 继续培养 $XC [ % 时加入 \E1K 至终浓度为 %--’(TD， ， 收集菌体， 供电泳分析和测定酶活。 ! [ C9 !"$ 酶活性的定性检测 进行酶活的定性测定。 利用薄层层析法 （ 1DF） 取 $XC-D 培 养 物， 再 加 入 %T# 体 积 的 S%CTHN5"$3
离 心 除 去 菌 体 细 胞， 取上清于 ,&’ C+" D 稀 释， 以 9)氨甲酰苯丙氨酸标准品绘 /"#5& 测定吸光度， 制标准曲线， 在此曲线上计算反应转化的中间产物 9)氨甲酰苯丙氨酸的含量。以 %)苄基乙内酰脲为底 物酶解生成 9)氨甲酰苯丙氨酸的速率计算乙内酰 脲水解酶的活力。在上述条件下 10 内催化底物转 化生成 1&E 产物的酶量定义为 1 个活力单位 （F） 。 !"& !"’ 蛋白含量测定 按 ’GH2I 法 进行。 引物合成和测序 根据乙内酰脲水解酶基因序列设计了一对特异 性引物， J1：%K)!66LLMM!MLLM6MMM6L!6MLLM!6) 下划线部分为 $%& N ! 位点； M6LL6LLMM6!),K， J"： %K)!66L6!M!M!LMMM666LM!!M66!MMM!),K，下 划 线部分为 ’(% ! 位点， 引物合成及测序均由上海博 亚公司完成。
（ Z=,） ]Z])JL6= V5VAIB4B GW *’"1 3;M""1) !"# +
（ Z=,） 1$ J2XU4;4SVSX W2G& AIBVSX GW *’"1 3;M""1) !"# + VWSX2 45CTUX&X5S； （ Z=, ） "$ ]T;X25VSV5SB W2G& AIBVSX GW *’"1 3;M""1) !"# + VWSX2 45CTUX) （ Z=, ） &X5S ； ,$ MGSVA UXAA AIBVSX GW *’"1 3 ;M""1 VWSX2 45CTUX&X5S；/$ （ Z=, ） 3 ;M""1；%$ MGSVA UXAA AIBVSX GW *’"1 MGSVA UXAA AIBVSX GW *’"1 （ Z=,） ；>$ ’GH &GAXUTAV2 ;2GSX45 &V2^X2 R
消旋的乙内酰脲类衍生物在几个酶的协同作用下， 可以完全转化为相应的手性氨基酸， 因此乙内酰脲 酶在各类手性氨基酸的酶法不对称合成中具有广泛 的应用前景， 其中 03氨甲酰氨基酸水解酶是整个反 应的 限 速 酶。我 们 自 % 株 D3乙 内 酰 脲 酶 产 生 菌 %&’!&()*+’,& B12$% 中分离得到了编码乙内酰脲酶系 的基因片段 ， 其 A 个基因排列成 % 个操纵子， 依次 、 乙内酰脲水解酶 （酶 编码乙内酰脲消旋酶 （酶 ! ） 和 03氨甲酰氨基酸水解酶 （酶 #） 。其中乙内酰 "） 脲消旋酶和 03氨甲酰氨基酸水解酶在大肠杆菌中
用 $%& N ! 和 ’(% ! 双酶切； %&45。纯化 J!N 产物， 将质粒 ;M""1 用相同的酶作双酶切， 回收纯化片段。 用 M/ Z9L 连接酶连接两片段， 构建成重组表达质 粒 ;M""1) !"# + （图 1） 。连接产物转化 $ R %&)* *’"1 （Z=,） 感受态细胞， 在含 1## E3&’ 氨苄青霉素的 ’* " 平板上培养 "/0， 选择单菌落进行检测。 ("( 重组质粒 )*((!% !"# + 的酶切和 ,-. 鉴定 挑取平板上单菌落接种于含氨苄的 ’* 液体培 养基中， 提取质粒， 用 ,-. "##23&45 培养 1" [ 1>0， 在 1/##Y; 出 现 电 泳 $%& N! 和 ’(% ! 双酶切鉴定， 带， 与预期产物大小 （ 1,--Y; ） 相 符 合。采 用 全 菌 J!N 进行转化子的快速筛选。取少量菌液制备模 板， 用引物 J1 和 J" 进行 J!N 扩增， 1$#( 的琼脂糖 凝胶电泳可检测到均有特异性扩增带出现， 与预期 产物大小 （1,OPY;） 一致。对阳性转化子质粒进行测 序， 结果表明重组质粒构建正确。 ("/ （ 23/ ） 01(! 4)*((!% !"# + 表 达 产 物 的 525% ,673 分析