临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识
二代测序及其在临床疾病中的应用
二代测序及其在临床疾病中的应用二代测序
二代测序（Next Generation Sequencing，NGS）又称大规模平行测序，能够同时对上百万甚至数十亿个DNA分子进行测序，实现了大规模、高通量测序的目标，是继Sanger测序之后的革命性进步。
二代测序的原理
二代测序从发明至今，已有数个不同的平台开发出了基于不同原理的测序方法，目前，Solexa测序技术应用最为广泛。本文也将详细介绍solxa测序的原理。
Solexa测序：边合成边测序（SBA），循环可逆终止（CRT）
Solexa技术测序的基本原理是边合成边测序，在体系中加入四种不同荧光标记的碱基，在测序过程中，不同的dNTP会释放出不同的荧光，根据图片捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，记录序列信息。
二代测序的临床应用
感染性疾病防控
医院感染性疾病暴发的调查：NGS序列信息可报告感染性疾病暴发的传播链，并已被用于跟踪由鲍曼不动杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯杆菌引起的医院感染性疾病的传播[1-3]；
未知病原体的鉴定：NGS已在临床感染性疾病的诊断和新病原体的发现中取得了令人瞩目的成果，其高通量、低成本、并可以从头组装病原体，这一优势是其他基因检测方法所无法比拟的[4-6]。
检测病原体耐药基因突变：NGS不仅可以确认Sanger测序验证的耐药位点，还有助于检测出抗生素耐药基因出现的新发突变，并且通过进一步的实验确定这些基因是否为导致抗生素耐药模式的原因。
肿瘤的早期诊断以及精准治疗
随着新的分子诊断技术的出现，对肿瘤的认知也从单一疾病，发展到一系列驱动基因突变形成的一组疾病，带来了从病理分型到分子分型的演变。目前在临床肿瘤实践中，NGS已广泛应用于多种肿瘤类型，如肺癌、乳腺癌、胃肠道肿瘤、黑色素瘤等[7-9]，是肿瘤精准诊疗的重要环节，大大促进了个体化医学发展，为临床诊疗提供了一个崭新的平台和广阔的前景。
二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识(2018年版)
血液肿瘤是一类具有高度异质性的疾病，其诊疗需要结合形态学、免疫学、遗传学和分子生物学进行综合分析。二代测序（Next-generation sequencing, NGS）作为新的分子生物学技术，具有通量高、灵敏度高、成本低等优势，是探索血液肿瘤的分子发病机制并指导临床诊疗的重要手段。为推动NGS在血液肿瘤诊疗中的应用，提高诊疗水平，中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会、中华医学会血液学分会、中华医学会病理学分会组织国内相关的血液、病理和检验专家，结合国外权威资料和已积累的大样本数据，制订了NGS在血液肿瘤中应用的中国专家共识。
血液肿瘤中常见的分子生物学异常主要包括基因突变、融合基因及基因异常表达。目前NGS在基因突变的检测方面应用最为广泛和成熟，本共识仅涉及基因突变的检测。
一、NGS在血液肿瘤诊疗中的应用价值
1．诊断分型：
基因突变的检测在急性髓系白血病（AML）伴重现性遗传学异常、遗传易感性髓系肿瘤、骨髓增殖性肿瘤（MPN）、骨髓增生异常综合征伴环形铁粒幼红细胞（MDS-RS）、毛细胞白血病（HCL）和淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症（LPL/WM）的诊断中具有关键性的作用，对于其他血液肿瘤则起到辅助诊断的作用[1,2,3,4,5,6,7,8]。
2．预后判定：
基因突变是各类血液肿瘤预后判断的重要依据，目前NCCN指南已提出了基于基因突变的AML预后分层体系[1]。此外，MDS、MPN、MDS/MPN、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤（CLL/SLL）、LPL/WM、大颗粒淋巴细胞白血病（LGLL）中，已经证实了一些具有明确预后意义的突变基因[2,3,4,5,6,7,8]。其他血液肿瘤中突变基因的预后意义尚有待于进一步研究。
二代测序技术在NSCLC中的临床应用中国专家共识(2020版)要点全文
二代测序技术在NSCLC中的临床应用中国专家共识
（2020版）要点全文
肺癌是目前全球最常见、致死率最高的恶性肿瘤。非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最常见的组织学类型，在肺癌病例中占比超过80%。
在NSCLC领域，随着基因检测技术的进步和一系列新药临床研究的突破，近10年间新发现的肿瘤驱动基因不断增多，推动了NSCLC靶向治疗药物的研发和临床应用。
全面的肿瘤相关基因检测方法成为提升NSCLC患者治疗效果及预后的有效手段。CSCO NSCLC诊疗指南提出应采用经过验证的检测方法同时检测多个驱动基因。NCCN NSCLC指南则强烈支持通过全面分子测序的结果，指导临床治疗方案的确定，或纳入相关临床试验中。
目前，国外已发表了多个NGS检测技术指南，但现有的NGS指南通常侧重检验科室的技术参数标准，尚缺乏可指导NGS检测在实体瘤临床诊疗路径中应用的指南或共识，然而我国NSCLC患者数量庞大，精准治疗药物的可及性高，全面而准确的肿瘤基因诊断结果已经成为肺癌医师临床诊疗的刚需。因此，国内外业内资深专家共同讨论并撰写了本共识，旨在为我国NSCLC临床诊疗规范使用二代基因测序（NGS）这一新型基因检测技术提供指引。
NGS检测的适用人群
共识1：推荐所有病理诊断为肺腺癌、含有腺癌成分的肺癌以及不能分型的晚期新发或术后复发的NSCLC患者常规进行基因检测。【I级推荐】对经小标本活检诊断为含有腺癌成分或具有腺癌分化的混合型鳞癌，以及年轻或不吸烟/少吸烟肺鳞癌患者，也推荐进行基因检测。【II级推荐】
虽然单纯肺鳞癌患者中有4%的EGFR突变率，但尚无证据支持肺鳞癌患者使用靶向EGFR TKI显著获益，因此不推荐对单纯肺鳞癌患者进行EGFR基因检测。
下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识
下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识摘要
近年来，宏基因组二代测序（mNGS）技术在下呼吸道感染（1RTI）病原诊断领域得到了广泛应用，国内临床医师在mNGS的临床应用方面已积累了一定的经验和证据。但mNGS在1RT1病原诊断中的适用场景仍缺乏规范，mNGS报告的临床意义解读也缺乏专业的指导意见。本共识基于mNGS在我国1RT1病原诊断方面的应用实践，梳理mNGS在1RT1应用领域的瓶颈问题，汇总本领域专家意见，明确了mNGS在1RT1病原诊断中的适用场景，为mNGS报告临床意义提供了一条合理可行的解读路径，以期规范mNGS在1RT1中科学合理应用。
宏基因组二代测序是近年来兴起的基于核酸检测的微生物鉴定技术，由于其非预设性、高通量等优点而得到广泛应用。下呼吸道感染主要包括社区获得性肺炎、医院获得性肺炎、免疫抑制宿主肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支气管扩张症合并感染等类型，临床表现多样，感染微生物种类复杂，感染和定植鉴别困难，加之mNGS技术本身存在的局限性，mNGS诊断效力的发挥有赖于选择恰当患者、采用适宜标本以及进行合理的解读。尽管国内就mNGS的技术要点和临床应用已有数部专家共识，但尚缺乏针对1RTI临床实践中具体问题的指导意见。为此，中华医学会呼吸病学分会发起并组织呼吸与危重症、临床微生物检验、感染等多学科的专家撰写本共识，以期规范mNGS在1RT1中的临床应用，为更好地规范解读mNGS报告提供指引。1RTI诊断要点、主要病原谱及特定致病微生物的危险因素本共识不再赘述，可参考相关指南或共识。
二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识(完整版)
二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识（完整版）
血液肿瘤是一类具有高度异质性的疾病，其诊疗需要结合形态学、免疫学、遗传学和分子生物学进行综合分析。二代测序（Next-generation sequencing, NGS）作为新的分子生物学技术，具有通量高、灵敏度高、成本低等优势，是探索血液肿瘤的分子发病机制并指导临床诊疗的重要手段。为推动NGS在血液肿瘤诊疗中的应用，提高诊疗水平，中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会、中华医学会血液学分会、中华医学会病理学分会组织国内相关的血液、病理和检验专家，结合国外权威资料和已积累的大样本数据，制订了NGS在血液肿瘤中应用的中国专家共识。
血液肿瘤中常见的分子生物学异常主要包括基因突变、融合基因及基因异常表达。目前NGS在基因突变的检测方面应用最为广泛和成熟，本共识仅涉及基因突变的检测。
一、NGS在血液肿瘤诊疗中的应用价值
1．诊断分型：
基因突变的检测在急性髓系白血病（AML）伴重现性遗传学异常、遗传易感性髓系肿瘤、骨髓增殖性肿瘤（MPN）、骨髓增生异常综合征伴环形铁粒幼红细胞（MDS-RS）、毛细胞白血病（HCL）和淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症（LPL/WM）的诊断中具有关键性的作用，对于其他血液肿瘤则起到辅助诊断的作用[1,2,3,4,5,6,7,8]。
2．预后判定：
基因突变是各类血液肿瘤预后判断的重要依据，目前NCCN指南已提出了基于基因突变的AML预后分层体系[1]。此外，MDS、MPN、MDS/MPN、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤（CLL/SLL）、LPL/WM、大颗粒淋巴细胞白血病（LGLL）中，已经证实了一些具有明确预后意义的突变基因[2,3,4,5,6,7,8]。其他血液肿瘤中突变基因的预后意义尚有待于进一步研究。
二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识(2018年版)
血液肿瘤是一类具有高度异质性的疾病，其诊疗需要结合形态学、免疫学、遗传学和分子生物学进行综合分析。二代测序（Next-generation sequencing, NGS）作为新的分子生物学技术，具有通量高、灵敏度高、成本低等优势，是探索血液肿瘤的分子发病机制并指导临床诊疗的重要手段。为推动NGS在血液肿瘤诊疗中的应用，提高诊疗水平，中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会、中华医学会血液学分会、中华医学会病理学分会组织国内相关的血液、病理和检验专家，结合国外权威资料和已积累的大样本数据，制订了NGS在血液肿瘤中应用的中国专家共识。
血液肿瘤中常见的分子生物学异常主要包括基因突变、融合基因及基因异常表达。目前NGS在基因突变的检测方面应用最为广泛和成熟，本共识仅涉及基因突变的检测。
一、NGS在血液肿瘤诊疗中的应用价值
1．诊断分型：
基因突变的检测在急性髓系白血病（AML）伴重现性遗传学异常、遗传易感性髓系肿瘤、骨髓增殖性肿瘤（MPN）、骨髓增生异常综合征伴环形铁粒幼红细胞（MDS-RS）、毛细胞白血病（HCL）和淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症（LPL/WM）的诊断中具有关键性的作用，对于其他血液肿瘤则起到辅助诊断的作用[1,2,3,4,5,6,7,8]。
2．预后判定：
基因突变是各类血液肿瘤预后判断的重要依据，目前NCCN指南已提出了基于基因突变的AML预后分层体系[1]。此外，MDS、MPN、MDS/MPN、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤（CLL/SLL）、LPL/WM、大颗粒淋巴细胞白血病（LGLL）中，已经证实了一些具有明确预后意义的突变基因[2,3,4,5,6,7,8]。其他血液肿瘤中突变基因的预后意义尚有待于进一步研究。
临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识
㊃标准与规范㊃
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９⁃５８０７．２０１７．０３．００１
基金项目：科技部卫生行业科研专项基金（２０１４０２００１）
执笔人：叶丰（四川大学华西医院病理研究室）；吴焕文（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院病理科）
通信作者：梁智勇（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院病理科，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｉａｎｇｚｈｉｙｏｎｇ１２２０＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ）；步宏（四川大学华西医院病理研究室／病理科，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｏｎｇｂｕ＠ｓｃｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）
临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识
‘临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识“编写组 近年二代基因测序（ｎｅｘｔ⁃ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）技术快速发展，其应用已进展至临床检测，如遗传疾病㊁实体肿瘤㊁血液肿瘤㊁感染性疾病㊁人类白细胞抗原分析及非侵袭性产前筛查等㊂国内外有关学会已出台相关共识与指南以推动其在临床中的应用［１⁃４］㊂中华医学会病理学分会和中国抗癌协会肿
瘤病理专业委员会前期组织病理㊁临床㊁生物信息等专家进行了充分讨论，拟在ＮＧＳ的操作流程㊁数据处理㊁结果解读等方面作规范和建议，以规范ＮＧＳ在分子病理领域的应用㊂
临床分子病理实验室ＮＧＳ样本可采用甲醛固定石蜡包埋（ｆｏｒｍａｌｉｎ⁃ｆｉｘｅｄｐａｒａｆｆｉｎ⁃ｅｍｂｅｄｄｅｄ，ＦＦＰＥ）组织㊁新鲜组织㊁各种体液及其上清液㊁体液离心细胞蜡块㊁血浆／血液标本等㊂本共识特色是基于病理评估的组织样本（ＦＦＰＥ组织㊁新鲜组织）而
沈佐君分子诊断检验程序性能验证指南解读
6.1.4 抗干扰能力
1. 验证要求 分子诊断常见的干扰物质主要包括血红蛋白、甘油三酯、胆红素、免疫球蛋白G、类风湿因子和药物等。
实验室可根据临床需求、厂家声明和样本特点（实际可能存在的干扰物质及达到的浓度）选择需要验证的 干扰物质及浓度。需要时，也应评估抗凝剂和样本保存液等对结果的影响。
2. 验证方案 实验室可根据实际情况选择验证方案。 方案1：实验组为在弱阳性样本中加入干扰物质溶液（对照组加入等量的溶剂），使得干扰物质的终浓
实验室应根据检测项目的预期用途以及生产制造商声明，选择 对检测结果质量有重要影响的参数进行验证。不同技术平台、样本 类型以及预期用途不同时，所需验证的性能指标宜有所侧重。
4.3 性能验证的判断标准 实验室应根据临床需求选择经确认的符合预
期 用途的检验程序。实验室性能验证结果的判断 标准 是厂商或研发者在试剂盒或检测系统说明书 中声明 的性能指标。
6.1.3 交叉反应
1. 验证要求 应验证与检测对象可能存在交叉反应的核酸物质对检测的影响。对于病原体
核酸检测来说，主要指与检测对象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床 症状的病原体核酸，宜在病原体感染的医学决定水平进行验证。对于报告具体基 因型的方法，应在待测核酸浓度水平验证其它基因型对待测核酸测定的影响。
本文件适用于医学实验室采用的经确认的检验程序。 注：鉴于实际临床工作中进行分子诊断的样本类型（如进行原位杂交 的样本有血液、羊水穿刺、肿瘤组织等）以及预期用途差别较大，而不同 样本类型对性能验证的要求和难易程度差别较大，建议结合实际情况酌情 选择与之相符合的性能验证方案。
肝胆肿瘤分子诊断临床应用专家共识
• （4）建议使用血清学糖类抗原19-9检测，结合影像学特点作为胆囊癌临床诊断 的标志物。
诊断相关的主要分子标志物
• （5）ctDNA、微小RNA等血清学标志物，由于检测成本较高，且缺乏大规模临 床试验结果论证，缺乏组织和肿瘤特异性特征，建议可作为肝胆肿瘤患者诊断 及筛查的参考指标。
• （2）注意使用试剂的保存（避免反复冻融、污染等），建立组织处理、免疫组 织化学切片、抗原修复、染色操作等的标准化流程。
• （3）严格按照相关分级标准进行结果判定，最大限度规避因主观因素造成的结 果差异。
• （4）病理报告建议除常规病理结果、免疫组织化学结果、典型图片外，建议包 含与肝脏恶性肿瘤潜在药物靶点检测、生物学行为评估以及预后判断等相关的 分子病理学结果。
• （2）HCC靶向治疗（索拉非尼、仑伐替尼、瑞戈非尼等）前，不推荐常规进行 基因筛查预测疗效，但可结合临床实际情况或临床试验，对患者进行RAS、 MET、HRD、VEGFA等基因检测，为HCC耐药后治疗以及联合治疗提供参考依 据。
• （3）临床中可结合实际情况或临床试验，尝试对CCA/胆囊癌患者进行FGFR、 ERBB2、BRAF、IDH、HRD、PI3K/mTOR、FGF19等基因检测，探索患者个 体化靶向治疗的新方案。
临床NGS全流程共识——样品处理和实验室检测流程
临床NGS全流程共识——样品处理和实验室检测流程
/live/webinar_play_new/454.html真实世界”——院内NGS检测数据对比研究
NGS比对工具/u/5927786455
划重点
1. 没有精准检测就没有精准医疗，目前临床基因检测实验室尚没有统一标准，部分仍沿用科研标准进行临床检测，亟需规范化，特别是技术细节、质量控制、质量评价的具体内容；
2. 实验室首先应遵守临床相关国内文件规范要求，实行分区，遵守生物安全要求；样本采集、运输与存储应根据不同样本类型进行操作，见文中表格归纳；
3. 质量控制包括核酸质控、文库质控、测序数据质控，特别是文库构建需评估试剂有效性，测序需评估不同试剂批次和固定时间间隔下的仪器损耗的稳定性；
4. 样本追踪包括性别一致性鉴定和SNP一致性鉴定；至少添加一个阳性质控、一个阴性质控或空白对照与常规样本同时检测进行质量评价。
重临床NGS全流程共识的由来
△图：基因检测联盟（筹）历届会议合影（来源/基因慧）
二代测序（NGS）已广泛应用于遗传病的临床检测。同时遗传病基因检测流程长、环节多、技术含量高，基因检测行业亟需在检测全流程规范化方面建立共识。
为推进基因检测行业的健康有序发展，配合相关部门和临床遗传专家组制订规范并落地实施，基因检测联盟（筹）组织临床专家、遗传学家以及第三方基因检测机构开展研讨会和指定行业共识。
2017年10月在深圳召开首届临床基因检测标准和规范研讨会，会后参会专业人士共同编写《临床基因检测报告规范与基因检测行业共识探讨》，于2018年2月发表在《中华医学遗传学杂志》（点击详情）。2019年5月在上海召开第二届基因检测联盟会议，会后形成
二代测序临床报告解读指引
2020年8月第20卷第4期
循证医学
The Journal of Evidence-Based Medicine
Aug.2020
Vol.20No.4二代测序临床报告解读指引
二代测序临床报告解读专家组
［摘要］二代测序（next generation sequencing，NGS）已成为中国临床肿瘤医生常用检测工具，而中国超90%临床医生需要NGS报告解读支持。因此，为提升临床医生NGS报告解读能力，特编写了NGS临床报告解读指引，以帮助临床医生梳理NGS报告解读逻辑，快速抓取关键信息，同时尽可能规避过度解读基因组信息导致的潜在危害。本文从临床靶点或驱动基因相关体细胞变异注释及解读、NGS报告解读及临床决策、可报告范围及质量控制等方面详细介绍了NGS报告解读应遵循的恰当的结构化循证原则，正确理解NGS报告的逻辑结构、抓取关键信息并综合分析，为肿瘤患者带来切实的临床获益。帮助医生在综合浏览完一份样本检出的所有分子变异后，结合患者的基本临床信息以及既往或同期其他配对样本检测结果，综合判断患者疾病的全面分子特征谱及其演化过程，了解这些信息所提示的生物学意义和临床意义，最终做出正确的临床决策。
［关键词］二代测序；报告解读；指引
［中图分类号］R446.7［文献标识码］A DOI：10.12019/j.issn.1671⁃5144.2020.04.001 Standards and Guidelines for the Interpretation of Next Generation
Sequencing Clinical Reports
基因测序(一代测序和二代测序)-用于临床疑难病原体鉴定
黑曲霉菌测序图
难鉴定真菌分子诊断案例
➢ 黑曲霉菌（Aspergillus niger），标本来源是患
者耳部脓液。
➢ 该例患者25岁，女性，就诊于耳鼻喉门诊，诊断 为慢性化脓性中耳炎，国内文献报道耳部感染的 主要病原真菌是黑曲霉菌。
黄曲霉菌测序图
镰孢菌测序图
难鉴定真菌分子诊断案例
该标本加做结核分枝杆菌荧光定量PCR检测，
➢ 及时区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。
Leabharlann Baidu
WHO推荐GeneXpert效果最佳
➢ 多重荧光定量PCR及 熔解曲线法原理。
➢ 快速全自动检测各类 标本中结核杆菌、非 典型分枝杆菌、利福 平耐药基因。
结核分枝杆菌测序图
龟分枝杆菌测序图
诺卡菌属测序图
放线菌测序图
放线菌用药治疗
生氮二氧化碳嗜纤维菌测序图
难鉴定细菌分子诊断案例
➢ 血液中分离出生痰二氧化碳嗜纤维菌 （Capnocytophaga sputigena），G-球菌，是人 类口腔的正常菌群，属于条件致病菌，常通过口 腔粘膜进入血液，感染者大多患有血液系统恶性 肿瘤或粒细胞减少等疾病。
➢ 该例败血症患者男性，诊断为地中海贫血，来自 小儿科层流病房。
➢ 比对细菌的16S rRNA基因，相同性（identity） 百分比大于99可以定义到种的水平，97～99 可以 定义到属的水平，小于97有可能是一个新 种。
CLIACAP 二代测序临床检测标准操作指南
2015-04-23自由度
本临床二代测序操作指南来自于Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) of 1988/College of American Pathologists (CAP) laboratory。
释义：Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) of 1988：美国临
床实验室改进修正法规’88 。这个法规里面有关于医学检验项目的一些质量规范，中国的临床行业很多项目的指标都参考过CLIA’88 中的内容。
College of American Pathologists (CAP) laboratory：美国病理学家协会。
相较于Sanger测序，二代测序技术（新一代测序技术，NGS）拥有高通量和低单碱基成本的特点，这使其在临床检测领域拥有得天独厚的优势。过去的数年间，相当数量的NGS服务商迅速成长，而美国病理学家协会却没有及时依照美国临床实验室改进修正法规（CLIA）编制指南来规范这个检测。
基于NGS平台的临床检测是一种新的检测方式，相较于原有检测方法，其复杂程度大大提高，因此迫切需要一个规范标准来指导各实验室进行检测。
CAP于2011年成立了NGS工作部门，商讨NGS临床检测实验检查表的内容。本次CAP列出共计18条实验室要求的检查表，包含检测的二代测序实验过程和生物信息学分析过程。
二代测序技术（NGS）包含两个部分：实验操作部分（wet bench）和生物信息分析部分（dry bench）。实验操作部分包括以下部分或所有的流程：病例样本的采集处理、核酸提取、片段化、生物分子标签（barcode）、目标区段/基因捕获富集、连接、扩增、文库构建、上机测序、数据产出。生物信息分析部分主要依赖于高性能的计算机和不同的生物信息分析方法，主要流程包括：参考序列比对、组装、变异检测、注释、临床解释（依赖于是否运用诊断工具）。
临床基因检测报告规范与基因检测 行业共识探讨(完整版)
临床基因检测报告规范与基因检测行业共识探讨（完整版）
【摘要】(二代测序技术next generation sequencing, NGS)在临床的应用为广泛开展遗传病的基因检测、病因诊断、治疗及预防奠定了基础，但同时也伴随着一系列的问题，其中很重要的一个环节就是基因检测报告缺乏统一或基本的标准。首届“临床基因检测标准与规范专题研讨会”于2017年10月28日在深圳召开，来自全国138家机构的250多位遗传学专家、临床专家及第三方检测机构的代表共同探讨了遗传病基因检测报告的标准和规范问题。本文根据此次研讨会专家的意见和建议，就遗传病基因检测报告的原则、规范以及基因检测行业的发展进行了讨论，并发布了临床基因检测报告规范共识，以促进检测报告的规范化和标准化，推进我国基因检测行业的健康有序地发展。
【关键词】基因检测；二代测序；报告规范；行业共识
1背景
随着基因检测技术的发展、医学遗传学知识的积累以及民众对于遗传性疾病的诊断、治疗和预防的需求的不断增长、医学遗传学这一新的临床专科正日渐被大众所认识，并随着以二代测序技术(next generation sequencing,NGS)重要标志和基因芯片在临床上的广泛应用而发展为遗传与基因组医学（genetics and genomic medicine）。上述进展在为遗
传性疾病的基因检测、诊断、治疗及预防方面提供了更多的可能的同时，也产生了一系列的问题。其中一个很重要的环节，就是不同机构所出具的基因检测报告缺乏统一或基本的标准。关键信息的缺失可能，导致临床医师与受检者在解读报告的结果时可能误解和遗漏，使得基因检测报告难以在医院和检测机构之间形成互认。
二代测序技术在NSCLC中的临床应用中国专家共识（2020版）
二代测序技术在NSCLC中的临床应用中国专家共识（2020
版）
让我们一起学习啊！
二代基因测序（next generation sequencing, NGS）又称为高通量测序，该技术能够同时对上百万甚至数十亿个DNA进行分析，实现了高通量测序的目标。
NGS检测的适用人群
共识1：推荐所有病理诊断为肺腺癌、含有腺癌成分的肺癌以及不能分型的晚期新发或术后复发的NSCLC患者常规进行基因检测。【I 级推荐】
对经小标本活检诊断为含有腺癌成分或具有腺癌分化的混合型鳞癌，以及年轻或不吸烟/少吸烟肺鳞癌患者，也推荐进行基因检测。【II级推荐】
注：虽然单纯肺鳞癌患者中有4%的表皮生长因子受体（EGFR）突变率，但尚无证据支持肺鳞癌患者使用靶向EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）显著获益，因此不推荐对单纯肺鳞癌患者进行EGFR基因检测。
共识2：针对敏感型突变发生率高的NSCLC患者（见“共识1”），常规基因检测结果为阴性时，建议使用中国国家药品监督管理局（National Medical Products Administration, NMPA）或美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准的NGS产品进行复检。【III级推荐】
晚期新发或术后复发NSCLC患者首次进行基因检测的共识意见
共识3：针对晚期新发或术后复发的NSCLC患者，首次检测建议采用NMPA批准的检测产品，检测至少包括NSCLC常见驱动基因: EGFR突变（应涵盖18号、19号、20 号、21号外显子），以及ALK 融合、ROS1融合。【I级推荐】
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㊃标准与规范㊃
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９⁃５８０７．２０１７．０３．００１
基金项目：科技部卫生行业科研专项基金（２０１４０２００１）
执笔人：叶丰（四川大学华西医院病理研究室）；吴焕文（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院病理科）
通信作者：梁智勇（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院病理科，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｉａｎｇｚｈｉｙｏｎｇ１２２０＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ）；步宏（四川大学华西医院病理研究室／病理科，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｏｎｇｂｕ＠ｓｃｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）
临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识
‘临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识“编写组 近年二代基因测序（ｎｅｘｔ⁃ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）技术快速发展，其应用已进展至临床检测，如遗传疾病㊁实体肿瘤㊁血液肿瘤㊁感染性疾病㊁人类白细胞抗原分析及非侵袭性产前筛查等㊂国内外有关学会已出台相关共识与指南以推动其在临床中的应用［１⁃４］㊂中华医学会病理学分会和中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会前期组织病理㊁临床㊁生物信息等专家进行了充分讨论，拟在ＮＧＳ的操作流程㊁数据处理㊁结果解读等方面作规范和建议，以规范ＮＧＳ在分子病理领域的应用㊂
临床分子病理实验室ＮＧＳ样本可采用甲醛固定石蜡包埋（ｆｏｒｍａｌｉｎ⁃ｆｉｘｅｄｐａｒａｆｆｉｎ⁃ｅｍｂｅｄｄｅｄ，ＦＦＰＥ）组织㊁新鲜组织㊁各种体液及其上清液㊁体液离心细胞蜡块㊁血浆／血液标本等㊂本共识特色是基于病理评估的组织样本（ＦＦＰＥ组织㊁新鲜组织）而形成的规范㊂测序分析范围基于目前临床需求，本共识着重于目标区域测序（ｐａｎｅｌ）分析的实践㊂随着技术的更新和应用的成熟，本共识将持续更新以满足临床需求㊂
一㊁实验室总体要求
ＮＧＳ检测实验室的总体设计与要求应参考‘分
子病理诊断实验室建设指南（试行）“㊁‘医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则“㊁‘个体化医学检测质量保证指南“㊁‘肿瘤个体化治疗检测技术指南“㊁‘个体化医学检测实验室管理办法“㊁‘测序技术的个体化医学检测应用技术指南（试行）“进行［５⁃７］㊂
１．ＮＧＳ检测人员的资质要求：ＮＧＳ检测技术人
员应具备临床病理学㊁分子生物学的相关专业大专
以上学历，并经过ＮＧＳ技术的理论与技能培训合格，同时具有临检中心‘临床基因扩增实验室技术人员培训合格证“㊂数据分析人员应具有临床医学㊁分子生物学或遗传学知识背景并经生物信息学培训㊂最终报告应由中级或硕士以上具有病理学背景㊁经培训合格的本单位执业医师或者授权签字人（高级职称或医学博士学位）审核㊂
２.ＮＧＳ检测实验室的区域设置要求：原则上
ＮＧＳ实验室应当有以下分区：样本前处理区㊁试剂储存和准备区㊁样本制备区㊁文库制备区㊁杂交捕获区／多重ＰＣＲ区域（第一扩增区）㊁文库扩增区（第二扩增区）㊁文库检测与质控区㊁测序区㊁数据存贮区㊂各工作区空气及人员流向需要严格按照‘医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则“配置㊂分区可根据实际情况合并，但是在前处理和建库时，血液样本与组织样本分开㊂
３．ＮＧＳ检测试剂及项目要求：试剂和测序平台
应选择中国食品药品监督管理总局（ＣＦＤＡ）认可产品㊂涉及实验室自配试剂，应该有严格的试剂制备标准操作规程（ＳＯＰ），需经过临床实验室自建项目（ＬＤＴ）验证合格才可使用㊂每个ＮＧＳ检测项目在验证时需要根据建库方法㊁测序平台和分析工具以及不同的突变类型，包括单碱基突变（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｖａｒｉａｎｔ，ＳＮＶ）㊁小片段插入或者缺失（Ｉｎｄｅｌ）㊁基因拷贝数变异（ｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒｖａｒｉａｔｉｏｎｓ，ＣＮＶ）㊁染色体结构变异（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｖａｒｉａｔｉｏｎ，ＳＶ）以及不同的样本类型（如ＦＦＰＥ组织㊁新鲜组织㊁全血㊁
胸水等）对特定ｐａｎｅｌ的准确性㊁精确性㊁敏感性㊁特异性等性能参数进行ＬＤＴ验证㊂应该有经过标准品测试的在不同的变异频率（ｍｕｔａｎｔａｌｌｅｌｅｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ，ＭＡＦ）下，不同测序深度的灵敏度及特异度数据，确定不同样本的可信的测序深度㊂经验证后，ＳＯＰ发生的任何改动，包括试剂㊁仪器㊁基因项目等都需要重新做验证㊂验证实验结果签名留底备案㊂
４．ＮＧＳ检测实验室的质量管理要求：ＮＧＳ检测
万方数据
主要包括实验操作和生物信息学分析两部分㊂实验操作部分包括样本准备㊁文库制备㊁编码
（ｂａｒｃｏｄｉｎｇ）㊁目标区域富集㊁测序等；生物信息学分析部分包括定位（ｍａｐｐｉｎｇ）㊁比对㊁变异识别㊁变异注释㊁变异解读及报告等㊂上述流程均需要建立实验室质量管理体系文件和ＳＯＰ及机器运行和维护ＳＯＰ，具有严格的室内质控措施；定期参加室间质评以及有持续的质量保证和改进计划㊂
二㊁ＮＧＳ分析样本㊁基因ｐａｎｅｌ和转运要求ＮＧＳ分析样本类型可采用ＦＦＰＥ组织㊁新鲜组织㊁各种体液及其上清液㊁体液离心细胞蜡块和血浆／血液标本等㊂
对于肿瘤体细胞变异初次ＮＧＳ检测应首选经病理评估的组织样本，在此数据基础上的再次检测可选取液体样本动态监测㊂
ＮＧＳ检测前需通过病理诊断明确其肿瘤的性质及含量，根据不同肿瘤类型选择合适的基因ｐａｎｅｌ测序［８⁃１１］㊂
不同疾病的基因ｐａｎｅｌ列表，必须由临床与检测机构的专家共同决定，在满足临床需求的同时达到最优化的实验设计㊂
未经病理评估的基因检测结果不可单独用于分子病理临床诊断目的㊂
样本质量对检测结果和分析至关重要，病理医师需要对可评估的样本进一步明确病理诊断，并评价标本有无出血㊁坏死和不利于核酸检测的前处理（例如含ＨＣｌ脱钙液处理），病变细胞（如肿瘤细胞）的总量和比例，避免假阴性㊂组织标本中肿瘤细胞含量建议达到２０％以上，低于此标准可富集后检测［１２］㊂ＮＧＳ检测实验室应对不同类型的样本有采集及处理ＳＯＰ指导㊂对于不同的样本（ＦＦＰＥ组织㊁体液㊁血液等）实验室应有不同的样本运送ＳＯＰ，物流环节（含冷链运输）应有相关运送记录，确保样本运送安全㊁无污染㊁无降解㊂
三㊁ＮＧＳ检测流程中的质量标准１．核酸提取及其质量分析：提取的核酸质量是ＮＧＳ检测成功的关键因素，在制备文库前应采用多种方法对核酸质量评估，包括纯度㊁浓度和完整性分析㊂需要根据不同的样本类型制定相应的ＳＯＰ用以鉴定核酸的纯度㊁浓度㊁完整性或降解程度等㊂对应明确接受和拒绝的标准㊂
２．文库制备及其质量分析：文库制备方法主要有杂交捕获和扩增子建库，无论采用何种方法制备文库和平台检测，都应对检测基因㊁区域或突变热点进行描述，并建立实验室检测ＳＯＰ㊂建立好文库后上机测序前需对文库进行质量分析㊂每个检测项目应设定其文库质量的要求，明确接受或拒绝的标准㊂
３．ＮＧＳ测序仪上机检测及其质量分析：测序主要有检测氢离子释放和荧光信号两大技术平台㊂测序时根据检测样本量和质量要求确定适当的芯片，以保证测序质量和靶区覆盖深度㊂录入样本编号㊁检测内容㊁设定参数等信息，按仪器操作流程进行测序㊂产生的测序数据质量参数要求详见后文㊂４．ＮＧＳ检测中的样本追踪及对照设置：（１）样本追踪：为确保检测过程中样本没有混淆或污染，可选用多个ＳＮＶ位点或其他标签作为样本身份标识（ｓａｍｐｌｅＩＤ），在检测前对每个样本进行ＳＮＶ位点信息的测定，在ＮＧＳ检测后对上述位点进行追踪，证明没有交叉污染㊂（２）阳性对照：应用组合型质控材料，可采用已知突变信息的混合样本，以模拟样本的复杂性㊂实验时同时检测，以确保其检出能力㊂（３）阴性对照：用无核酸或明确无突变的样本作为模板同时进行检测，以确保检测过程中没有污染或非特异性㊂（４）应对方案和替代方法：各个质量控制步骤中如出现异常或失败，实验室应有应对措施或备选方案；对于测序结果质量差或有问题的区域应建立替代方法（如Ｓａｎｇｅｒ测序）㊂
四㊁生物信息分析
ＮＧＳ数据的生物信息分析可分为两个主要步骤：一是对测序数据进行质控分析及过滤㊂二是对通过质控的序列进行变异位点鉴定分析并注释㊂所用各种生物信息分析软件，都要通过适量标准品测序数据进行验证，证明所用软件及参数可达到临床报告的要求㊂
１．ＮＧＳ生物信息分析流程标准：（１）质控分析：为保证分析结果的可靠性，需要对原始的测序数据进行质量控制与过滤㊂测序数据的质量控制主要包含４个方面：质量评估㊁去接头序列㊁去低质量序列㊁去重复序列㊂（２）序列比对：将通过质控后每一条ｒｅａｄ与参考基因组进行比对，回贴到基因组上最佳位置㊂（３）变异鉴定：对每个位点进行变异鉴定㊂在肿瘤ｐａｎｅｌ测序中，主要检测ＳＮＶ和Ｉｎｄｅｌ两种突变类型，参数调整后可分析ＣＮＶ㊂部分ｐａｎｅｌ的设计还可以鉴定染色体易位㊂对于肿瘤ｐａｎｅｌ基因测序数据，鉴定后的变异位点都需要进行该位点可视化查看和确认，如ＴｈｅＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＧｅｎｏｍｉｃｓＶｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）㊂（４）变异注释：基于通用数据库，对突变基
万方数据