质粒DNA的小量制备、电泳检测及细菌转化
质粒DNA的提取和纯化实验报告
质粒DNA的提取和纯化实验报告实验一、质粒DNA的提取和纯化一、实验目的：1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。
2、初步了解DNA纯化的原理。
二、实验原理1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
三、实验步骤1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管）2、将试管放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16h。
3、将菌落转入1.5ml离心管中（尽量倒满）1200r/min，离心30s（沉淀菌体）4、重复一次第三步的过程5、弃掉上清液并扣干，加入预冷的Solution1 100微升，剧烈震荡打散菌体6、加入新配置的Solution2 200微升，温和颠倒试管6-7次混匀，室温放置5min，使液体由浑浊变为透明粘稠7、加入预冷的Solution3 150微升，温和颠倒离心管2-3次，震荡7-8次，之后在1200r/min离心7min8、小心将含有质粒DNA的上清液转移到另一离心管中（400-500微升）9、加等体积的氯仿，轻微震荡，1200r/min，离心2min,之后将上清液转移至另一离心管10、加入2倍体积冰冷无水乙醇，轻轻颠倒离心管混匀，室温放置2min，1200r/min 下离心10min11、弃上清，加入70%乙醇洗涤沉淀，12000r/min，离心2min，弃上清12、弃上清，液体尽量倒净，并在吸水纸上扣干，室温静置15min干燥13、加入1*TE 40微升溶解质粒，用于定量分析、电泳检测等实验二、DNA琼脂糖凝胶电泳一、实验目的1、学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术2、掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
质粒提取的原理操作步骤各溶液的作用
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各类质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情形下可持续稳固地处于染色体外的游离状态，但在必然条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞割裂传递到后代。
质粒已成为目前最经常使用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可取得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方式可用于质粒DNA的提取，本实验采纳碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为普遍的制备质粒DNA的方式，其大体原理为：当菌体在NaOH和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方式一般是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平稳离心、离子互换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方式，但这些方式相对昂贵或费时。
关于小量制备的质粒DNA，通过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可知足细菌转化、DNA 片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中经常使用。
一、试剂预备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH ，10mM EDTA(pH ）。
1M Tris-HCl<!--[if !supportAnnotations]--><!--[endif]--> (pH ）， EDTA（pH ）10ml，葡萄糖，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
任何生物化学反映，第一要操纵好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。
生物技术制药试验
生物技术制药实验武汉大学药学院生物技术实验室湖北·武汉目录实验一质粒DNA的小量制备 (2)实验二质粒DNA电泳鉴定 (4)实验三感受态细胞的制备和转化 (5)实验四目的基因的表达及表达产物的初步提取 (8)实验五蛋白质纯化—盐析沉淀法 (10)实验六凝胶过滤层析 (14)实验七蛋白质免疫印迹实验（Western Blotting） (16)实验八HRP结合物的过碘酸钠交联法 (19)实验一质粒DNA的小量制备【目的】学会最常用的碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。
【原理】根据共价闭合环状质粒DNA和线性DNA在拓扑学上的差异来分离。
在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。
尽管在这样的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心和蛋白质和大分子RNA等发生共沉淀下去而被去除。
【器材】超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。
【试剂】pET-28a质粒载体菌, LB培养基1000ml（含10μg/ml卡那霉素），葡萄糖/Tris/EDTA 溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液（溶液II），KAc溶液（pH4.8）（溶液III），RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。
【实验准备】1. 配制卡那霉素储存液（无菌水配制10mg/ml，分装后-20︒C保存）。
2. 配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL 双蒸水搅拌完全溶解，用约200μL 5N NaOH调pH至7.0，加双蒸水至1L，121︒C灭菌20min）。
3. 溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）。
质粒DNA提取方法与原理
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。
50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳一、前言质粒质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。
大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为原核生物）中，乃至于植物的线粒体等胞器中。
然而，1984年，在Streptomyces coelicoler(天蓝色链霉菌)等放线菌以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形质粒。
天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。
质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。
质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可能。
有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒)。
有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。
一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。
它是基因工程最常见的运载体。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制型。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子，如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。
细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。
质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。
质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。
质粒DNA的小量制备
质粒DNA的小量制备准备工作：细菌培养：挑取单菌落，接种到3-5ml适宜的液体培养基(如氨苄青霉素抗性的标准LB培养基)中，37℃震荡培养过夜。
注：（1）最好在细菌的对数生长晚期时提取。
过早则质粒得率太低，过晚则会有杂菌污染，或得到的质粒杂质太多，影响其后的酶切、电泳等处理；（2）某些严紧型质粒(如pBR322)需要在进入对数生长中期后，在细菌培养物中加入氯霉素继续培养，以提高产量。
具体步骤：1、细菌的收获：将1.5ml菌液倒入微量离心管中，12000g离心30秒，吸去培养液。
上清要务必吸取干净，否则会影响质粒的质量。
必要时可以离心2次。
2、将细菌沉淀重悬于150μl用冰预冷的溶液Ｉ中，加入1/50体积RNaseA贮存液，剧烈振荡，使之完全分散。
溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LT ris•Cl(pH8.0)，10mmol/LEDT A(pH8.0)不含DNA酶的RNaseA：10mg/ml，TE配制，煮沸15~30min，-20℃分装贮存注：（1）溶液Ｉ高压蒸气灭菌后，贮存于4℃；（2）葡萄糖可以由NaCl代替，以利于储存；但提取大于15kb的质粒，应将细菌悬于等渗蔗糖溶液中，并用溶菌酶处理；（3）务必使细菌沉淀完全分散，以利于碱液作用充分；（4）震荡时可以在离心管中加入牙签或枪头，提高效率；（5）配制RNaseA贮存液时，煮沸时间不宜过长或过短；（6）溶液Ｉ每2个月重新配制1次。
3、加200μl溶液Ⅱ，颠倒混匀。
溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS注：（1）若菌体裂解得充分，则溶液会变得很粘稠；（2）不要剧烈震荡，否则会混入基因组DNA；（3）每2个月重新配制1次。
4、加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，轻微震荡混匀溶液Ⅲ：5mol/Ｌ乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml注：（1）所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L，pH4.8左右；（2）尽量不要有大的块状沉淀，以利于下步离心；（3）每1个月重新配制1次，并分装贮存于小口瓶中。
质粒dna的转化实验报告
质粒dna的转化实验报告质粒DNA的转化实验报告引言：质粒DNA转化是分子生物学中常用的实验技术之一，通过将外源DNA导入到细胞内，实现基因的转移和表达。
本实验旨在探究质粒DNA转化的原理、方法以及影响转化效率的因素。
一、实验原理质粒DNA转化是利用细菌细胞膜的渗透性，将外源DNA导入到细胞内。
质粒DNA通常带有抗生素抗性基因，通过筛选培养基中的抗生素对转化细胞进行筛选，从而获得转化成功的细胞。
二、实验材料与方法1. 实验材料：- 大肠杆菌DH5α细胞- 质粒DNA- LB培养基- 抗生素（如氨苄青霉素）2. 实验方法：a) 质粒DNA制备：将目标基因克隆到质粒载体中，通过大肠杆菌的培养和质粒提取技术，获得纯化的质粒DNA。
b) 细胞预处理：取适量的大肠杆菌DH5α细胞，进行预处理，使其处于最佳转化状态。
c) 转化实验：将质粒DNA与细胞混合，并通过热冲击法或电穿孔法使DNA转移到细胞内。
d) 恢复培养：将转化后的细胞在预热的LB培养基中恢复培养，使其恢复生长。
e) 筛选转化细胞：将恢复培养的细胞均匀涂布在含有抗生素的LB平板上，筛选出抗生素抗性的细胞。
三、实验结果与讨论1. 转化效率的影响因素：转化效率受到多种因素的影响，如DNA浓度、细胞状态、转化方法等。
在本实验中，我们通过改变转化体系中DNA和细胞的比例、转化时间等条件，探究了这些因素对转化效率的影响。
结果显示，较高的DNA浓度和适宜的细胞状态有利于提高转化效率。
此外，热冲击法和电穿孔法在不同实验条件下的转化效率也存在差异，需要根据具体实验要求选择合适的转化方法。
2. 质粒DNA的筛选：通过在含有抗生素的LB平板上筛选转化细胞，可以筛选出含有目标基因的细胞。
在本实验中，我们使用了氨苄青霉素作为抗生素，通过对转化后细胞的培养和筛选，成功获得了抗生素抗性的细胞克隆。
3. 转化效率与实验条件的关系：我们分别以不同的DNA浓度、细胞状态和转化时间进行了转化实验，并计算了转化效率。
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告#特选资料
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告#特选资料DNA（Deoxyribonucleic Acid），中文名叫脱氧核糖核酸，是生命活动的基础物质。
它是各种生物体的特征物质，在细胞的核内存在，也是遗传信息的载体。
病毒DNA也用于各种研究和检测，尤其是在病毒的鉴定及转基因技术中发挥着重要作用。
因此，定性病毒DNA提取及少量DNA琼脂糖凝胶电泳实验都成为实验室检测中必不可少的一项实验内容。
本实验采用DNA提取试剂盒（TOYOBO）进行DNA的提取，特点是无色素、无皂、无蛋白、简便快捷，可以获得高质量的脱氧核糖核酸产物并提高检测效率。
该试剂中的抗腐蚀劑、抑制核糖核酸的酶和其他特殊的保护剂，能够有效防止DNA降解，为提取保护DNA。
本实验做法如下：用离心机将试管内管壁完全湿润，然后在试管中加入灭菌液中离心5min，在电烙铁上将试管放置至400℃时将管口朝内容物烤，使病毒落入管内，加入溶解液将病毒完全溶解，加入避免pH影响的预测液，再加入 DNA提取试剂盒内的DNA提取液，再加入离心液，速度2000rpm/min，离心15min，将DNA分离，收集上清液，即可完成DNA 的提取。
下一步，将提取的DNA溶液经过超滤处理，清洗去盐、去酵氨酸和其他病毒物质，然后将收集的DNA溶液加入加热消化液（20ul加强热金属离子消化液），任务反应器中加入DNA溶液，改变反应器温度逐渐提高，以到达95℃时，保留10min，完成加热消化，之后将消化液在室温空气中反应30min，待反应液体质清澈后，收取液体。
最后，加入检测凝胶（1.2%琼脂糖凝胶）及TBE解剖液，调节溶液酸碱度至7.4,凝胶细胞中加入示性荧光物质即蛋白质标记剂，加入磁控脱水，进行凝胶电泳实验，常用50V ——200V，应用1.0mh氯化钠池，当特征带迁移至仪器中央时，实验完毕。
经上述实验，本实验成功提取了少量 DNA，并通过DNA琼脂糖凝胶电泳实验证实，获得了琼脂糖凝胶电泳图像，数据获取良好印证实验结果满足实验要求。
质粒DNA提取,电泳鉴定
试剂中的主要成分和作用
重悬细菌
GTE缓冲液： Tris-HCl溶液：调节pH。 葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管
子底部。 EDTA：二价金属离子螯合剂，抑制DNase活性。
变性
NaOH-SDS溶液： NaOH：溶解细胞，破坏核酸碱基配对使氢键断裂
从而让核酸变性。 SDS：裂解细胞，结合蛋白质，形成SDS-蛋白质
定要充分混匀！
6. 4℃，12000rpm离心5min，取上清300ul 转移 的EP管中。
至另一支新
7. 加180ul异丙醇，冰浴20min，12000rpm离心5min，弃上清液。
8. 缓慢加入70%乙醇0.5ml，轻轻上下颠倒， 12000rpm离心 1min，吸弃大部分上清，挥干剩余乙醇。
agrose gel电泳是分离鉴定和纯化DNA分子的常用方法，不同浓 度的琼脂糖胶可分离100bp-60kb的DNA片段，在琼脂糖电泳中， DNA迁移的速率不仅与其分子量的对数值成反比，即分子量越大， 移动速率越慢，而且还与分子构型有关如质粒开环DNA<线性DNA< 共价闭合环状DNA。
预期实验结果
RNase溶液：水解上清中小分子RNA。 异丙醇：快速沉淀质粒DNA，但难以挥发。 70%乙醇：去除异丙醇，且易于挥发除去。 TE缓冲液：溶解质粒DNA沉淀，含有EDTA能
够使DNA保存时间更长。
琼脂糖凝胶电泳
溴化乙锭（EB）能够嵌入 到DNA分子的碱基对中形成荧 光复合物，在紫外线激发下发 射荧光
基本原理
当菌体在NaOH-SDS溶液中裂解时，蛋白质与 DNA会发生变性。加入中和液（乙酸钾）后， 质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离 心时留在上清中；而染色体DNA、大分子RNA 以及蛋白质-SDS复合物等形成沉淀，可通过离 心去除。
质粒DNA的提取、纯化和电泳检测
质粒DNA的提取、纯化和电泳检测学号同组人班级实验时间摘要：质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA，它是基因工程中一种非常重要的载体。
质粒DNA的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。
碱变性提取法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法。
电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。
凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。
本次实验利用碱变法对E.coli DH5 受体菌中质粒pUC19的DNA进行提取、纯化和电泳检测，旨在学习并掌握质粒DNA提取的原理、纯化及琼脂糖凝胶电泳技术。
通过此次实验，我们达到了预期效果。
关键词：质粒DNA、碱变性提取法、质粒DNA的纯化、DNA凝胶电泳1.引言质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA。
细菌质粒的相对分子质量大小从1kb至200kb以上不等。
一些质粒永远独立于染色体之外，另外一些质粒在一定条件下会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子（简称cccDNA）。
由于质粒分子小、便于分离和提取的特点，在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒可通过连接外源基因构成重组体，携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体进行扩增与表达，因此质粒是基因工程中一种非常重要的载体。
质粒特征的分析已被广泛用于细菌种属鉴定、耐药性、毒力及同源性分析。
近年来由于基因芯片技术的出现，质粒基因探针的开发和应用也得到了飞速的发展，所以这就要求我们从宿主细胞中提取高质量的质粒DNA。
因此，质粒DNA的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。
提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱裂解/碱变性法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
AxyPrep 质粒 DNA 小量试剂盒
洗脱液或者去离子水 65°C 预热以及增加洗 脱时间至 5min 都可提高洗脱效率。
3）菌量过多
4）加入Buffer S1后菌体没有 完全悬起
5）加入 Buffer S2 后裂解不 完全
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参见“A260/280 比值过高”
1. 盐污染 2. 乙醇污染 3. Buffer S2 作用时间过长 4. 核酸酶污染引起的质粒降解 5. 质粒序列缺失
确保用 Buffer W2 洗涤 2 次。
在最后一次 Buffer W2 洗涤后可将制备管离 心时间由原来 1min 增加至 2min。
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裂解 中和
结合 洗涤
洗脱
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六、常见问题分析
主要问题
原因
得率低或纯化
1. 质粒丢失
不到质粒
2. 细菌裂解不完全 1) 菌量过多
建议 在含有新鲜抗生素的平板上重新划甘油菌培 养。若当前使用的是氨苄青霉素，可以考虑 试用羧苄青霉素。如果有必要，可重新转化 质粒或使用不同的宿主菌。 将菌量减少为原先的ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ半（实际操作中可按 实验情况相应调整）。
2) Buffer S2 过期
* 确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 * 两次使用 Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。
细菌质粒DNA的微量制备
细菌质粒DNA的微量制备、酶切和琼脂糖凝胶电泳一、实验目的和要求1．掌握碱变性法提取质粒的原理和方法。
2．掌握核酸浓度测定方法、酶切技术。
3．掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和实验技术二、基本原理质粒（Plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，是染色体外能够稳定遗传的因子。
质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主的进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。
从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生型的自主复制子。
根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。
目前，质粒已广泛用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。
大肠杆菌染色体DNA比通常用作载体的质粒DNA分子大得多，在提取得过程中，染色体DNA易断裂成线性DNA分子，而大多数质粒DNA则是共价闭环型，根据这一差异便可以设计出各种分离、提纯质粒DNA的方法。
在EDTA存在的条件下，用溶菌酶破坏细菌细胞壁，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。
此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来。
而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量染色体DNA，实验中加入蛋白质水解酶和核糖核酸酶，可以使它们分解，通过碱性酚（pH8.0）和氯仿－异戊醇混合液的抽提可以除去蛋白质等等。
异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少抽提过程中产生的泡沫，并能使离心后水层、变性蛋白层和有机层维持稳定。
含有质粒DNA的上清液用乙醇或异丙醇沉淀，获得质粒DNA。
质粒DNA中含有限制性核酸内切酶的切割位点，用适宜的核酸内切酶作用后，使环状DNA 降解成小片断。
质粒DNA的小量制备
质粒DNA的小量制备1.收获1）将2ml含相应抗生素的LB（10ml5xLB+40mlH2O+50ul氨苄）加入到标记好的15ml并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于37度恒温箱振荡培养过夜。
2）将培养好色泽浑浊的培养物倒入标记好的微量离心管中，用离心机在室温以13000g离心1min。
3）吸取培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
（除去上清的最简便方法是用一次性的吸头接触液面轻缓吸取。
尽可能使吸头远离细菌沉淀）2.裂解1）在细菌沉淀上先加入250ul 冰箱保存的solution1，剧烈振荡（在微量离心管里加一根牙签，再在震荡机上使细菌沉淀迅速分散）（50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris.Cl,10mmol/L EDTA）2）然后加入250ul新配制solution2 盖紧管口，温和颠倒离心管5次，以混合内容物。
（应确保离心管整个内表面均与溶液接触）（0.2mol/L NaOH,1%SDS）3）加入350ul solution3盖紧管口，温和倒置振荡10秒钟，使粘稠的细菌裂解物分散均匀（5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml）4）再用离心机20000g离心10min，将上清液转移到标记好的2ml收集管中。
5）把收集管离心过柱1min后，倒掉滤液，再加500ul HBC Buffer清洗，离心1min倒掉滤液6）再用700ul DNA Wash Buffer清洗过柱离心1min倒掉滤液，重复2次。
7）再空离心2min后，将收集管过到新标记好的微量离心管·中，打开挥干2min8）最后再加入30-50ul 预热好的Elution Buffer溶解1min后，再离心机13000g离心1min 后，去掉收集柱，保留溶解液。
dna提取个步骤作用原理
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA 分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA 已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH ，10mM EDTA(pH ）。
1M Tris-HCl<!--[if !supportAnnotations]-->[t1]<!--[endif]--> (pH ），EDTA（pH ）10ml，葡萄糖，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。
50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
质粒DNA的微量制备及电泳检测
实验报告课程名称：生物化学及实验 指导老师： 成绩：同组学生姓名：一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得 二、实验内容和原理四、实验方法和步骤六、实验结果和分析一、实验目的和要求1、学习并掌握质粒DNA 的提取原理和方法2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作3、学习并掌握对电泳检测结果的初步分析二、实验内容和原理 1、质粒质粒是一种染色体（核质体）外的寄生性的自主复制子，存在于细菌等细胞中，为双链闭环的DNA 分子，大小在1-200kb 之间，具有自主复制和转录功能, 能表达例如抗性、菌毒素等细胞非必需的遗传信息，但其复制和转录必须要利用依赖宿主细胞（细菌）基因组DNA 编码的一些酶和蛋白质。
质粒能够自发的或人为的在细胞间转移，因此是基因工程技术中将外源基因导入受体细胞的重要载体。
从细菌细胞中抽提质粒DNA 分为三个步骤：①细菌培养使质粒大量扩增；②收集和裂解细胞,并去掉细菌碎片和核质体DNA ；③进一步除去蛋白、脂类、RNA 等杂质，分离和纯化质粒DNA 。
2、碱裂解法分离纯化质粒DNA在EDTA 存在下，经过SDS 处理使细胞膜裂解，从而使菌体充分裂解，利用在碱性条件下（NaOH ），使核质体DNA 与质粒DNA 的变性；加入乙酸钾，在中性条件下，核质体DNA 与质粒DNA 又存在复性的差异，质粒DNA 很快得以复性，而细菌核质体DNA 分子难以复性，核质体DNA 会缠绕附着在细胞膜碎片上通过离心被沉淀下来，质粒DNA 则留在上清液内；上清液中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量核质体DNA 以及脂质类杂质等，可通过碱性酚-氯仿-异戊醇混合液的抽提去除；含有质粒DNA实验名称：质粒DNA 的微量制备及电泳检测 姓名： 吴逸璇 学号：当加入无水乙醇时，其会夺去核酸周围的水分子，使其失水而易于聚合。
一般用2倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀DNA和RNA。
综合性实验一 质粒DNA的小量制备和电泳鉴定
■ 影响电泳迁移率的因素：
外加电流、电压
ANODE
+
-
+
Voltage
CATHODE
-
Friction
Charge
分子量 分子形状 分子的等电点
琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术
在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移 率与其分子量的常用对数成反比；
分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环DNA＞直线DNA ＞开环双链DNA。
3) 等凝胶温度降至大约50－60℃以下时，加入1 mg/L溴 化乙锭（EB）至终浓度为0.5µg/mL ；摇匀并轻快地倒 入水平板中，除掉气泡。
4) 凝固后，将梳子轻轻拔出。 5) 去掉胶带，将水平板放入加有1×TAE电泳缓冲液的 电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶约1mm。
6) 上样Buffer 和DNA 混匀后点样，记录点样次序。 7) 在水平板两边的点样孔中分别加入marker即分子量 标记。
二．实验原理
质粒提取原理
质粒提取有多种方法，但都包含三个基本步骤：
1. 培养细菌使质粒扩增 2. 收集裂解细菌 3. 分离纯化质粒DNA
✓去除蛋白质 ✓去除RNA ✓去除基因组DNA
苯酚-氯仿抽提法 Rnase消化法
？？？
质粒DNA和基因组DNA的区别
1. 大小不同 2. 变性与复性有差异
质粒DNA较小，通常只 有基因组DNA分子量的 百分之一。 基因组DNA容易断裂线 性化。
✓ 基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异 而达到分离目的。
原理：
1. 强碱NaOH和SDS裂解细菌，细菌中的质粒DNA和基因组 DNA在强碱条件下发生变性。
2. 怎样去除基因组DNA？ 当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性，而 染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起，难以复性， 并形成沉淀，经过离心随细胞碎片一起去除。
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质粒DNA的小量制备、电泳检测及细菌转化
Ⅰ.质粒DNA的小量制备
一实验目的
学习并掌握质粒的小量制备技术。
二实验材料和用具
菌种：E.coliDH5/pUC19 Extract0.5%，NaCl1%，pH7.2
(Agar2%)；120℃灭菌20min。
四实验内容
1.细菌培养及菌体的收获。
2.用试剂盒进行小量质粒制备。
五实验步骤
1.将E.coli菌株接种到液体LB培养基中，加入氨苄青霉素至100g/ml，150rpm振荡16h；
2.吸取1.5ml培养菌液与1.5ml离心管中，13000rpm室温下离心2min。倒掉上清，然后倒置于吸水纸上，使液体流尽；
D0001碧云天质粒小量抽提试剂盒（或其它公司的产品）
恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式高速离心机、台式小型振荡仪、EP管（Eppendorf管，1.5ml微量离心管）、加样器、吸头等。
三原理
实验采用国产的质粒小量抽提试剂盒。它是一种新型的离子交换柱，在特定的条件下，使质粒能在离心过柱的瞬间，结合到质粒纯化柱上，在一定条件下又能将质粒充分洗脱，从而实现质粒的快速纯化。而且在提取过程中，无需酚-氯仿抽提、无需酒精沉淀，可在较短时间内完成质粒的提取和纯化。