Caspase 3 活性检测试剂盒(比色法)
Caspase活性检测说明书
Caspase活性检测（基于p NA标记底物的比色法）在caspase 的底物多肽上标记发色团如：p NA，可用于检测凋亡细胞中的caspase活性及筛选caspases的激活剂或抑制剂。
本操作步骤主要针对使用酶标仪进行读数而设计。
其中使用的细胞抽提物、底物、抑制剂及p NA的用量为每个样本140ul。
若您希望设计针对分光光度计读数的实验，建议对每种溶液体积进行进一步优化。
所需溶液、试剂及设备• Caspase底物• Caspase抑制剂• 细胞裂解缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 1mM DTT, 100uM EDTA • 检测缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 10mM DTT, 100uM EDTA, 10%Glycerol• PBS：将8g NaCl、200mg KCl和1.44g Na2HPO4溶于800ml蒸馏水；用HCl调至pH7.4；定容至1L• 酶标板和酶标仪其它试剂(推荐)• 纯化的Caspase（阳性对照）• p NA细胞抽提物的制备以适合的凋亡诱导剂对细胞进行诱导（参考前述操作方法），同时做阴性对照，包括未处理细胞、用诱导剂的无诱导活性类似物处理细胞（若可得到），或一个凋亡诱导处理“零时间”样品。
应保证有足够细胞进行重复实验，包含或不含抑制剂的对照以检测蛋白浓度。
一般来说，我们下面推荐的裂解前细胞数量可以产生足够蛋白浓度供酶标仪检测；然而不同大小、体积的细胞及蛋白浓度可能需要增加铺板密度。
当裂解2×107/ml细胞是，产生的蛋白浓度约为1-3mg/ml，体积10ul，含约10-30ug蛋白。
依据其细胞系，最少应有106个细胞，体积50ul的裂解缓冲液进行处理。
• 细胞计数，离心收集细胞。
以PBS缓冲液洗涤一次。
若细胞已被caspase抑制剂处理过，建议多洗几次以防止后继实验中可能造成的不利影响。
焦亡检测指标金标准
焦亡检测指标金标准
细胞焦亡是近年来发现并证实的一种新的程序性细胞死亡方式，其特征为依赖于炎性半胱天冬酶（主要是caspase-1，4，5，11），并伴有大量促炎症因子的释放。
细胞焦亡的形态学特征、发生及调控机制等均不同于凋亡、坏死等其他细胞死亡方式。
研究表明，细胞焦亡广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展，并发挥重要作用，对细胞焦亡的深入研究有助于认识其在相关疾病发生发展和转归中的作用，为临床防治提供新思路。
证明细胞程序性死亡是否为细胞焦亡，建议至少验证如下指标：
1.Gasdermin D
细胞焦亡发生时，Gasdermin D（GSDMD，53KD）被切割，产生30KD左右的片段，可以购买GSDMD一抗，用Western blot（WB）来验证。
2.Caspase-1、Caspase-4
细胞焦亡发生时，caspase-1和caspase-4被激活，可以通过检测caspase-1和caspase-4的活性来验证。
Abbkine Caspase-1 活性分析试剂盒(比色法)（货号：
#KTA3020）和Caspase-4 活性分析试剂盒(比色法)（货号：
#KTA3023）
3. IL-1β、IL-18
细胞焦亡发生时，IL-1β和IL-18会释放到细胞中，可以通过ELISA方法检测细胞上清中的IL-1β和IL-18的含量来验证。
EliKine™Human IL-1βELISA Kit（货号：#KET6013）和EliKine™Human IL-18 ELISA Kit（#KET6023）
同时，可以用扫描电镜观察细胞形态（细胞膜破裂、细胞膨大&变形、细胞器变形）。
细胞凋亡中Caspase-3活性的检测
细胞凋亡中Caspase-3活性的检测关键词：细胞凋亡活性检测执行分子 2012-09-27 18:04 来源：互联网点击次数：5249Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。
Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。
但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
方法：收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→H RP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。
结果如下图2 荧光分光光度计分析原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。
根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。
在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。
根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?制备细胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC （caspase-3四肽荧光底物）?37°C反应1h?荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。
碧云天生物技术活细胞Caspase-3活性与Annexin V细胞凋亡检测试剂盒说明书
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology订货热线: 400-1683301或800-8283301订货e-mail:******************技术咨询: *****************网址: 碧云天网站 微信公众号活细胞Caspase-3活性与Annexin V细胞凋亡检测试剂盒产品编号产品名称包装C1077S 活细胞Caspase-3活性与Annexin V细胞凋亡检测试剂盒20次C1077M 活细胞Caspase-3活性与Annexin V细胞凋亡检测试剂盒50次产品简介：碧云天生产的活细胞Caspase-3活性与Annexin V细胞凋亡检测试剂盒(Caspase-3 Activity and Apoptosis Detection Kit for Live Cell)是基于新型的具有细胞膜通透性的Caspase-3/7绿色荧光底物GreenNuc™Caspase-3 Substrate联合细胞凋亡红色荧光探针Annexin V-mCherry来检测培养细胞中Caspase-3活性和细胞凋亡的红绿荧光双染试剂盒，可用于实时监测活细胞中Caspase-3活性和凋亡情况。
本试剂盒适用于流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测系统进行检测。
细胞凋亡(Apoptosis)是生物体发育等生命过程中普遍存在的、由基因决定的细胞主动有序的死亡方式。
当细胞遇到内、外环境因子刺激时，启动基因调控的自杀保护措施，去除体内非必需细胞或即将发生特化的细胞。
在这一过程中，细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，并迅速被巨噬细胞或邻近细胞清除，这是一种由基因控制、高度有序的细胞自主死亡，包含一系列信号事件组成的通路。
细胞凋亡失调与多种疾病有关，例如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)和癌症等。
Caspase (cysteine-dependent aspartate-specific proteases)的全称为天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶，存在于蛋白质中，主要利用半胱氨酸(cysteine)侧链选择性地高效切割含有天冬氨酸(aspartate)的多肽底物，在介导细胞凋亡(apoptosis)过程中起重要作用，并参与细胞的炎症、生长和分化等过程。
活细胞死细胞的染色方法
使用方法：
使用方法： 1、 染色工作液的配制：
根据样品数按下列比例配制染色工作液。 取 1ml 试剂 C 加 9ml 无菌去离子水稀释，混匀即成 1X 染色缓冲液。每 10ml 1X 染色缓 冲液中加入 10ul 染色液 A 和 3-10ul 染色液 B，充分混匀，即成染色工作液。 2、 收集样本细胞，细胞数量在 1X106 个以内。 3、 用 PBS 洗涤细胞两次。 4、 用 200ul 染色工作液将细胞重悬。 5、 4℃避光孵育 15-30 分钟。 6、 用 PBS 洗涤细胞。 7、 用适量 PBS 重悬细胞。 8、 用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。染料-DNA 复合物的最大激发 490±10nm，最大发 射波长分别为 515nm 和 617nm。
产品号 BB-4101 BB-4102 BB-4201 BB-4202 BB-4203 BB-4204 BB-4131 BB-4133 BB-4122
产品 细胞周期检测试剂盒 JC-1 线粒体膜电位试剂盒 Caspase 3 活性检测试剂盒 Caspase 8 活性检测试剂盒 Caspase 9 活性检测试剂盒 Caspase 10 活性检测试剂盒 细胞凋亡形态学检测试剂盒 Rhodamine 123 染色试剂盒 AO/EB 双染试剂盒
产品简介： BestBio 贝博活细胞/死细胞染色试剂盒是采用 Calcein-AM/PI 双染细胞的方法染色活细
胞和死细胞。 Calcein-AM 是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM 由于在
Calcein 的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶 会将其水解为 Calcein 留在细胞内，发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如 BCECF-AM 和 Carboxy-fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM 是最适合作为荧光探针去染活细胞的， 因为它的细胞毒性很低。Calcein 的激发和发射波长分别为 490 nm 和 515 nm。Calcein -AM 仅对活细胞染色。
Caspase 3 活性检测试剂盒(比色法)
Caspase 3 活性检测试剂盒(比色法)产品简介：Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)家族在介导细胞凋亡过程的起着极其重要的作用，其成员包括Caspase1~11等,均属于蛋白酶家族。
Caspase 3又称CPP32、Yama、apopain、Caspase-3，属于CED-3亚家族，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。
Caspase 3 可以剪切procaspase 2、6、7和9，可直接特异性剪切许多Caspase底物（如PARP、ICAD等），并在细胞核凋亡过程中起到重要作用。
Jimei Caspase 3活性检测试剂盒（比色法）(Caspase 3 Colorimetric A ssay Kit)的检测原理是利用Caspase 3催化底物acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide(Ac-DEVD-pNA)产生黄色的游离硝基笨胺pNA (p-nitroaniline)，通过测定分光光度比色法测定pNA在400~410nm处吸光值，从而间接获得Caspase 3的活性。
自备材料：1、水浴锅或恒温箱2、96孔板3、酶标仪或分光光度操作步骤（仅供参考）：1、制备标准曲线：①按照Caspase Lysis buffer：Assay buffer=1：9的比例配制适量的标准品稀释液。
②用标准品稀释液稀释pNA(10mM)，使pNA分别达到200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM，另外设置一般不加pNA仅含标准品稀释液作为零管，把以上系列浓度物质作为标准品。
③取pNA浓度分别为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、0的标准品各100μl加入至96孔板或取适量体积加入至容量不超过100μl的比色杯，测定405nm处吸光值即A405。
④用每一个标准品的A405 减去不含pNA的空白对照的A405，计算出实际的吸光值。
乳腺癌中caspase-3和caspase-9的表达及其意义
乳腺癌中caspase-3和caspase-9的表达及其意义王进京;孙保存【摘要】目的探讨caspase-3和caspase-9在乳腺癌发生、发展中的作用.方法采用免疫组化SP法和原位杂交(ISH)技术检测80例乳腺浸润性导管癌(invasive duct carcinoma,IDC)、23例导管内癌(ductal carcinoma in situ,DCIS)、37例增生症和9例癌旁组织中caspase-3、caspase-9 mRNA和蛋白的表达.结果caspase-3 mRNA在各组中的表达差异无统计学意义(P>0.05).caspase-3蛋白在IDC、DCIS、增生症中的表达均高于癌旁组织(P<0.05),在IDC、DCIS中的表达均高于增生症组(P<0.05).caspase-9 mRNA和蛋白在IDC、DCIS、增生症中的表达均低于癌旁组织(P<0.05),IDC、DCIS中的表达均低于增生症组(P<0.05).caspase-3、caspase-9蛋白在IDC与DCIS中的表达差异均无统计学意义(P>0.05).caspase-3蛋白与mRNA在DCIS和增生症中的表达呈正相关(r=0.429,r=0.563,P<0.05).caspase-9 mRNA与蛋白在各组中的表达均存在相关性(r=0.94,r=0.414,r=0.391,r=0.827,P<0.05).caspase-3、caspase-9 mRNA和蛋白的表达与肿瘤大小等临床病理参数无相关性(P>0.05).结论 caspase-3和caspase-9均参与乳腺导管癌的发生、发展.caspase-9蛋白表达降低,而caspase-3表达增高在乳腺癌的发生、发展过程中较常见;caspase-9表达降低可能与乳腺组织恶性转化有关.【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2012(028)004【总页数】5页(P378-381,389)【关键词】乳腺肿瘤;凋亡;caspase-3;caspase-9【作者】王进京;孙保存【作者单位】天津医科大学病理学教研室,天津,300070;天津医科大学病理学教研室,天津,300070【正文语种】中文【中图分类】R737.9细胞凋亡异常在多种恶性肿瘤的发生、发展中占有十分重要的地位。
比色法检测Caspase-3相对活性
材料和方法11试剂caspase3底物acdevdpna购自biomol公司4羟乙基哌嗪乙磺酸hepes33胆酰胺基丙基二甲氨基丙磺酸盐chaps乙二胺四乙酸edta二硫苏糖醇dtt聚乙二醇辛基苯基醚tritonx100二甲基亚砜dmso购自amresco公司达氏修正依氏dmem高糖培养基购自gibco公司胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司bradford蛋白定量试剂盒购自南京建成生物工程研究所氯化钠nacl甘油glycerol碳酸氢钠nahco等试剂均购自天津市化学试剂三厂
Caspase-3活性测定试剂盒
北京索莱宝科技有限公司
反应缓冲液μl
无样品 空白对照
95
待测样品μl
－
底物 μl
5
总体积μl
100
高酶活性 样品 85 10 5 100
低酶活性 样品 60 35 5 100
产品说明： 1、Caspase酶活力单位定义：参考 One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37 ºC under saturated substrate concentrations。即当底 物饱和时,一个Caspase酶活力单位定义为37 ºC 1小时水解pNA底物，产生1nmol游离pNA。根据pNA标准曲线 和样品OD值，可计算出Caspase酶活力单位。 2、除了处理组外，可设置阳性凋亡诱导剂组，阴性实验对照可包括不具有凋亡诱导作用的试剂(如 果能 得到)处理组、溶剂对照组、或凋亡诱导零时间点。
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北京索莱宝科技有限公司
×105个细胞或2个孔的12孔板细胞。勿用丝氨酸蛋白酶抑制剂如E-64和leupeptin以免抑制Caspase活性。 1、（1）细胞裂解：1000g 5分钟收集细胞，吸尽上清。每2~10×106细胞加50~100µl裂解液震荡裂解，冰浴 10分钟，再次震荡。
(2) 组织裂解：3~10mg组织加100 µl裂解液放入小型玻璃匀浆器，上下匀浆30次。转移匀浆液于离心管。 2、4 ºC 12,000g 10分钟，取上清测定，或-70 ºC保存。 3、蛋白定量：用Bradford法测定蛋白浓度。裂解液含还原剂不宜采用BCA法。应使蛋白浓度达到1-3 mg/ml， 相当于每10 μl待测样品含10-30μg蛋白，否则应增加细胞用量。
C1115 Caspase 3 活性检测试剂盒 说明书
A. 对于悬浮细胞：把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品，600g 4℃离心5分钟收集细胞，小心吸除上清，同时
确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解
液，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。下转液，备用。用胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。600g 4℃离心5分钟
2. Liu C, Yu K, Shi X, Wang J, Lam P, Wu R, Zhou, B. Induction of oxidative stress and apoptosis by PFOS and PFOA in primary cultured hepatocytes of freshwater tilapia (Oreochromis niloticus). Aquatic Toxicology. (2007), doi:10.1016/j.aquatox.2007.02.006.
5. Qian YF, Yao WB, Wang H, Gao XD. The Mechanism of Kaixin San Inhibiting Apoptosis in Hydrogen Peroxide2induced PC12 Cells. Chin J Nat Med. Sep.2007 Vol.5 No.5.
F. 用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT，不适合采用BCA法进行蛋白浓度测 定)。这样就可以计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 3的酶活力单位。
常见问题：
1. 测定出的A405过低： A. 样品中蛋白含量太低，裂解样品时需设法使样品中的蛋白浓度接近1-3mg/ml。 B. 样品中激活的caspase水平很低。首先确认凋亡现象是否明显，如果凋亡比较明显并且确认该caspase是可以被激活 的，可以适当调节诱导细胞凋亡的时间，希望能找到一个caspase激活比较强的时间点，这样就可以检测出该caspase 的激活。可以作一时间曲线，例如诱导凋亡0、2、4、8、16和24小时，或0、1、2、4、8和16小时，或0、1、2、4、 6和8小时等。具体的诱导凋亡时间需根据具体情况而定。 C. 通过上述优化后A405还是比较低，或浓缩样品或做时间曲线比较困难，可以在测定样品时加大样品的用量，最多可 达40µl。 假设每次测定样品的用量为xµl，则： C1. 此时标准品稀释液需按如下方法配制：按照xµl裂解液加入检测缓冲液至最终体积为100µl的比例配制适量的标 准品稀释液。例如样品用量为40µl，则按照40µl裂解液加入60µl检测缓冲液，即0.4ml裂解液加入0.6ml检测缓冲液的 比例配制标准品稀释液。其余标准曲线的测定方法同上面的使用说明所述。
Caspase1活性检测试剂盒比色法
本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过 100µL 的分光光度检测杯检测时，除标准曲线外可以 检测 20 个样品。
试剂准备 1. 裂解液融化后混匀并置于冰浴上备用。 2. 检测缓冲液融化后混匀并置于冰浴上备用。
气泡。随后再加入 10µL Ac-YVAD-pNA(2mM)。
3. 加入 Ac-YVAD-pNA (2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37°C 孵育 60-120min。发
ห้องสมุดไป่ตู้
现颜色变化比较明显时即可测定 A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可
以孵育过夜。
4. 样品的 A405 减去空白对照的 A405，即为样品中 caspase 1 催化产生的 pNA 产生的吸光度
二. 样品的收集： 1. 对于悬浮细胞：将没有诱导凋亡的对照品和诱导凋亡的样品，在 4°C 下，600g 离心 5min 后， 收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS 洗涤一次。同前吸尽上清后，2×106 细胞加入 100µL 裂解液（建议加入 1%蛋白酶抑制剂（CC088）），重悬沉淀，冰浴裂解 15~20min。 下接步骤 4。 2. 对于贴壁细胞：将没有诱导凋亡的对照品和诱导凋亡的样品，吸取细胞培养液，备用。用胰 酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。在 4°C 下，600g 离心 5min 后，收集细胞，
1
小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS 洗涤一次。同前吸尽上清后，2×106 细胞加
入 100µL 裂解液（建议加入 1%蛋白酶抑制剂（CC088）），重悬沉淀，冰浴裂解 15~20min。
Caspase3 活性检测试剂盒
3. Wang Q, Luo W, Zhang W, Dai Z, Chen Y, Chen J. Iron supplementation protects against lead-induced apoptosis through MAPK pathway in weanling rat cortex. Neurotoxicology. 2007 Jul;28(4):850-9.
10µl
Ac-DEVD-pNA (2mM)
10µl
10µl
总体积
100µl
100µl
注意：在设置反应体系时先加检测缓冲液，再加待测样品，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡。随后再加入
10µl Ac-DEVD-pNA (2mM)。
C. 加入Ac-DEVD-pNA (2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育60-120分钟。发现颜色变化比较明显时即
可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。
D. 样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中caspase 3催化产生的pNA产生的吸光度。通过同步骤1中获得的标准
曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。
E. 参考Chemicon公司的caspase 3酶活力单位的定义：One unit is the amபைடு நூலகம்unt of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the
常用细胞凋亡检测方法
常用细胞凋亡检测方法细胞凋亡是一种基本的细胞程序性死亡过程，对于维护正常组织结构和功能发挥重要作用。
因此，准确检测凋亡是研究细胞生物学、药物作用以及疾病发生机制的关键。
以下是几种常用的细胞凋亡检测方法。
1.同步体细胞凋亡分析法同步体细胞凋亡分析法基于DNA片段化的原理，通过载荷量测定等手段评估细胞死亡。
其中，凝胶电泳法可以评估DNA的片段化，而在DNA降解过程中也会释放核酸碱基和低分子量的寡糖，可以通过典型的化学制剂检测其蓄积量。
2.DAPI染色法4',6-二胺-2-苯并咪唑（DAPI）是一种DNA特异性荧光染料，它可以与DNA结合并发射蓝色荧光。
细胞凋亡时，DNA会发生片段化并形成形态特异的核质凝块，称为凝胶体(GC)。
DAPI染色后，健康细胞呈现规则形状的核，而凋亡细胞则呈现出碎裂的DNA染色残基。
3.DNA碎片检测法DNA碎片检测法利用凋亡细胞释放到细胞外的DNA碎片，通过测量DNA浓度的改变以评估细胞凋亡。
可以通过比色法、荧光染料测量或特定酶的检测来定量DNA。
4. Annexin V-PI（propidium iodide）双荧光染色法Annexin V是一种能够选择性结合凋亡细胞的磷脂。
同时，PI可以穿透受损的细胞膜并与细胞核DNA结合。
所以，通过联合使用这两种染料，可以区分正常细胞、凋亡细胞以及坏死细胞。
5. TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling）法TUNEL法是一种特异的DNA断裂终端标记法，它能够用于检测细胞死亡领域的DNA片段化。
具体而言，该方法依赖于终端脱氧核苷酸转移酶（TdT），它能够与DNA链上的未配对的碱基发生共价连接。
通过在DNA 链的断裂末端引入二脱氧尿嘧啶三磷酸（dUTP），再使用碱性棕榈酸蓝（APB）进行染色，TUNEL法可以在荧光显微镜下检测出碎片化的DNA。
caspase-3
caspase-3Caspase家族Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，相当于线虫中的ced-3，这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。
它们均有以下特点：①酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性；②总是在天冬氨酸之后切断底物，所以命名为caspase（cysteine aspartate-specific protease），方便起见本文称之为凋亡酶；③都是由两大、两小亚基组成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基。
最早发现人类中与线虫ced-3同源的基因[1]是ICE，即：白介素-1 β转换酶（Interleukin-1 β-converting enzyme）基因，因该酶能将白介素前体切割为活性分子，故名。
通过cDNA杂交和查找基因组数据库，在人类细胞中已发现11个ICE同源物[2]，分为2个亚族（subgroup）：ICE亚族和CED-3家族（图15-6），前者参与炎症反应，后者参与细胞凋亡，又分为两类：一类为执行者（executioner 或effector），如caspase-3、6、7，它们可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通过自催化（autocatalytic）或自剪接的方式激活；另一类为启动者（initiator），如caspase-8、9，受到信号后，能通过自剪接而激活，然后引起caspase级联反应，如caspase-8可依次激活caspase-3、6、7。
细胞中还具有caspase的抑制因子，称为IAPs（inhibitors of apoptosis proteins），属于一个庞大的蛋白家族。
它们能通过BIR结构域（baculovirus IAP repeats domain）[3]与caspase结合，抑制其活性，如XIAP。
非活性状态的pro-Caspase-3和活性状态的cleaved-caspase-3存在于细胞质中，当pro-caspase-3被剪切后剩下p17和p12 2个亚基，而产生活性。
流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 - Active Caspase-3 检测细胞凋亡
A c t i v e C a s p a s e-3检测细胞凋亡实验原理Caspase-3 在早期凋亡细胞中就已经活化，是凋亡程序中的重要的Caspase 酶。
凋亡细胞中，32kD 的原酶(Pro-caspase-3)裂解为一个17-21kD 亚单位和一个12kD 亚单位，两个亚单位形成二聚体，即为活化的Caspase-3，活化的Caspase-3 又水解、活化其它Caspase 酶和多种胞浆内成分（如D4-GDI，Bcl-2）和核内成分（如PARP）。
PharMingen 多克隆或单克隆Caspase-3 抗体可以识别Caspase-3 活化形式，它特异性识别由无活性的Pro-Caspase-3 活化水解后的暴露的断裂端，C92 单克隆抗体与Pro-Caspase-3 无交叉反应。
Active Caspase-3 Apoptosis Kit 特为流式细胞术分析凋亡细胞的Caspase-3 而设计。
包括荧光标记多克隆兔抗Active-Caspase-3 抗体（Anti-Active Caspase-3 FITC 或Anti-Active Caspase-3 PE）、固定/破膜剂、破膜/冲洗缓冲液。
实验步骤1Camptothecin 诱导细胞凋亡在DNA 合成中，需要拓扑异构酶I。
Camptothecin 是拓扑异构酶I 的抑制剂，它在体外依剂量不同而影响凋亡的发生。
在此，Camptothecin 做为常规的凋亡诱导方案，辅助细胞凋亡分析。
凋亡诱导试验用品1.用DMSO 制备1.0mM 的Camptothecin 储备液2.Jurkat T 细胞（ATCC TIB-152）凋亡诱导试验步骤1.1⨯106cells/ml 增殖的Jurkat T 细胞加入Camptothecin，Camptothecin 终浓度为4-6μM。
2.细胞37︒C 孵育4 小时。
2Active Caspase-3 染色步骤试验用品：1.12⨯75mm 的Falcon 管2.PBS 缓冲液3.凋亡检测试剂盒染色步骤：。
碧云天Casapase 3活性检测试剂盒说明书
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology订货热线：400-168-3301或800-8283301订货e-mail：******************技术咨询：*****************碧云天网站微信公众号网址：Caspase 3活性检测试剂盒产品编号产品名称包装C1115 Caspase 3活性检测试剂盒20次产品简介：Caspase 3活性检测试剂盒(Caspase 3 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中caspase 3酶活性或纯化的caspase 3酶活性的试剂盒。
Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。
Caspase 3也称CPP32、Yama或apopain，有时被写作caspase-3或caspase 3，属于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3 subfamily)，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。
Caspase 3是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。
Caspase 3可以剪切procaspase 2、6、7和9，并可以直接特异性剪切许多caspase底物，包括PARP (poly(ADP-ribose) polymerase)，ICAD (Inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease)，gelsolin和fodrin等。
这些由caspase 3介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。
另外，caspase 3在细胞核凋亡过程中也起到了关键作用，包括染色质固缩(chromatin condensation)，DNA片段化(DNA fragmentation)等。
同时caspase 3对细胞起泡(cell blebbing)也起到关键作用。
细胞粘附的检测方法
包被： 1、 96 孔板每孔加入 100ul 包被液。 2、 将培养板置 2-8°C 过夜。 3、 移除包被液，用洗涤液洗涤 2-3 次。
细胞接种： 1、 待测定细胞处理好后，用胰酶消化，PBS 洗涤，然后用相应培养基重悬，制成细胞
悬液。 2、 按 5×104 细胞/孔接种 96 孔板，建议设 3-5 个复孔。同时设立对照组，即孵育后不
体损失导致试剂量不够用。 ● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。离心力在不损失细胞的前提下尽可能小，重悬
细胞是动作要轻柔，避免多次反复的激烈吹打。不用涡旋振荡器。 ● 染色培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。一般情况下，白细胞较难染色，
因此需要较长的培养时间。培养时间一般为 1- 4 小时，但在培养 30 分钟左右即可取出肉眼观察 染色程度 (根据细胞种类而定，需要摸索一下条件)。当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞的最小接 种量至少为 1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不 低于 2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。如果要使用 24 孔板或 6 孔板实验，请先计算每孔相应的接 种量，并按照每孔培养基总体积的 10%加入染色液 B。 ● 有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加染色液 B 试剂时，建议斜
产品说明书
细胞粘附检测试剂盒
货号：BB-48120
V2.16
试剂盒储存条件： 2-8℃保存。
开盖后组份按要求条件保存。 Nhomakorabea试剂盒组成：
产品组成
BB-48120-1
BB-48120-2
规格
100 T
250 T
试剂 A：包被液 A
Caspase3_测定
Caspase3 测定caspase-3的检测方法：(1)免疫细胞化学检测caspase-3蛋白的表达，用悬浮的细胞；(2)western blot 理想结果：caspase-3有32ＫＤ的条带外，还出现了20ＫＤ和10ＫＤ大小的条带，表明caspase- 3被活化；(3)RT-PCR检测mRNA的表达，用凝胶成像分析系统处理，可以半定量。
Caspases可以在哺乳动物细胞内启动凋亡，caspase3比色蛋白酶试剂盒通过简单、方便的测定caspases活性的方法这种方法通过识别序列DEVD，这种方法基于用分光光度计测定从标记底物DEVD-pNA分开的发色团（pNA) 此时游离的pNA的发射光谱可用分光光度计或酶标仪或微量滴定板在400或405nm 检测,通过样本和背景的吸光度比较来测定caspase3活性的增加，进而推知Caspases的活性。
原理：在Caspase的底物多肽(如Caspase-3的底物为DEVD)上标记pNA (p-nitroanilide, 对硝基苯胺).当活化的Caspase剪切标记的底物多肽后, pNA被释放出来,此时游离的pNA的发射光谱可用分光光度计或酶标仪在400或405nm 检测,进而推知Caspases的活性.一．实验前准备：消毒的EP管、枪头、三蒸水、冰、水浴箱、实验组及对照组心肌组织、超速低温离心机、酶标仪、721分光光度计二．活性测定操作步骤（一）每组试剂组成Samples（lysis buffer）2×Reaction buffer DEVD-PNA 总Sample well （标本组）30ul 65ul 5ul 100ul Sample control（背景组）30ul（lysis buffer）70ul 0 100ulSample well（样本组）Sample control（背景组）3小时组N3 30ul样本30ul样本65ul Reaction buffer 70ul Reaction buffer5ul DEVD-PNAC3 30ul样本＋65ul Reaction buffer5ul IETD-PNA 30ul样本＋70ul Reaction buffer R3 30ul样＋65ul Reaction buffer5ul LEHD-PNA 30ul样本＋70ul Reaction buffer6小时组N6 30ul对照样本30ul样本65ul Reaction buffer 70ul Reaction buffer5ul DEVD-PNAC6 30ul样本＋65ul Reaction buffer5ul IETD-PNA 30ul样本＋70ul Reaction buffer R6 30ul样本＋65ul Reaction buffer5ul LEHD-PNA 30ul样本＋70ul Reaction buffer 共需2×Reaction buffer810 ul，配制2×830ul以防不够，用前加入8.3ul DTT活性表示为＝样本OD1－背景OD1（实验组）/样本OD2－背景OD2（对照组）（二）．操作步骤——酶标仪 1.取标记好的EP管（已消毒）2.取已冻好的冰块加点水，置插EP管的座于冰水中3. 放转子，打开高速离心机电源，时间、速度都在零位置先开机将至4摄氏度注意要配平套管A、B、C、D注意：1.速度、时间均为0时，才能开电源2.设置温度降温10min（夏天时间可以稍微长一些）3.开电源前先把转子放入4.定时－启动－慢慢调速10000转（显示为1000转）未配平－停机－重新配平－再开机5.停机灯亮，开盖（复位：速度、时间均为0)1．从低温冰箱中取出用锡铂纸包着的组织（已称重标记好的），取2-3块（30mg/块），放在EP管中，一直浸在冰水中2．锡铂纸剥去，组织直接置于EP管中，加裂解buffer（溶后4摄氏度保存）约700ul 冰上EP管中，用小弯剪将心脏组织剪碎，越碎越好组织、裂解buffer比例：1：10冰上操作3．开匀浆机取几块冰块于小烧杯中，接自来水成冰水液将EP管置于盛有冰水的小烧杯中，固定于匀浆机上先做对照组将转头插于组织液面下，打开电源，逐渐调大速度至max，上下搅动，直至浑浊，基本无小的组织块为止调小速度至零，关电源，取出转头，EP管放回冰水底座用蒸馏水冲洗转头，液冲至废烧杯中依次以同样方法将样本组进行匀浆注意：放空转，慢慢加速，别转别上下移动轴4．匀浆后置于离心机内先设时间10min “起动”；缓慢增大离心速度至1000×10r/min；缓慢减小离心速度，降至30×10r/min时，“停机”灯亮，即可取出注配平：套管A、B、C、D配平5．取Reaction buffer 6ml，用前加入60ul DTT（稀释100倍）吸取上清至小EP管依次加Reaction buffer、上清、底物至ELISA板，加底物时，每加一次换一个枪头（因为要混匀）注：底物每取完一次都要盖盖，避光；加完底物后，混匀。
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Caspase 2活性检测试剂盒(比色法)
简介：
Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)家族在介导细胞凋亡过程的起着极其重要的作用，其成员包括Caspase1～11等，均属于蛋白酶家族。
Caspase 2又称Ich-1、Nedd-2或caspase-2，在细胞凋亡信号转导过程中被激活。
Caspase 2 mRNA 具有两种不同长度的剪切体，其全长mRNA 翻译的蛋白可促进凋亡，而短蛋白产物则可抑制凋亡。
Caspase 2可以被Caspase 1、3和granzyme B 激活。
Leagene Caspase 2活性检测试剂盒(比色法) (Caspase 2 Colorimetric Assay Kit) 的检测原理是利用Caspase 2催化底物acetyl-Val-Asp-Gln-Gln-Asp p -nitroanilide (Ac-VDQQD-p NA)产生黄色的游离硝基苯胺p NA(p -nitroaniline)，通过分光光度比色法测定p NA 在吸光值，从而间接获得caspase 2的活性。
组成：
自备材料：
1、 水浴锅或恒温箱
2、 96孔板
3、 酶标仪或分光光度计
操作步骤(仅供参考)：
1、 制备标准曲线：
① 按照Caspase Lysis buffer ：Assay buffer=1:9的比例配制适量的标准品稀释液。
② 用标准品稀释液稀释p NA(10mM)，使p NA 分别达到200μM 、100μM 、50μM 、
25μM 、12.5μM 、6.25μM ，另外设置一管不加p NA 仅含标准品稀释液作为零管，把以上系列浓度物质作为标准品。
③ 取p NA 浓度分别为200μM 、100μM 、50μM 、25μM 、12.5μM 、6.25μM 、0
的标准品各100 μl 加入至96孔板或取适量体积加入至容量不超过100μl 的比色杯，测定吸光值即A 405。
编号 名称
CT0106 50T CT0106 100T Storage
试剂(A): Caspase Lysis buffer 10ml 20ml 4℃ 试剂(B): Assay buffer
10ml
20ml
4℃
试剂(C): Ac-VDQQD-p NA(2mM) 0.25ml ×2 0.25ml ×4 -20℃ 避光 试剂(D): p NA(10mM) 0.25ml ×2 0.25ml ×4 -20℃ 避光
使用说明书
1份
④用每一个标准品的A405减去不含p NA的空白对照的A405，计算出实际的吸光值。
以每个浓度的标准品A405为x轴，以对应的p NA浓度为y轴，用Excel制作p NA 浓度对A405值的标准曲线。
2、样品裂解：
①悬浮细胞：取实验样品和对照样品，离心收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量
没有细胞被吸除，PBS洗涤一次，再次小心吸除上清。
按每2~10×106细胞加入l Caspase Lysis buffer的比例加入Caspase Lysis buffer，重悬细胞沉淀，冰浴裂解。
②贴壁细胞：弃细胞培养液，用胰蛋白酶消化贴壁细胞，收集至细胞培养液，离心，
小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次，再次小心吸除上清。
按照每2~10×106细胞加入l Caspase Lysis buffer的比例加入Caspase Lysis buffer，重悬细胞沉淀，冰浴裂解。
③组织样品：按每组织加入Caspase Lysis buffer的比例加入Caspase Lysis buffer，
冰浴上用玻璃匀浆器匀浆并转移至离心管中，冰浴裂解。
④离心，取上清至新的离心管。
立即测定Caspase 2的酶活性或-70℃保存样品。
⑤蛋白定量：由于Caspase Lysis buffer含还原剂不宜采用BCA法，可采用Bradford
法测定蛋白浓度。
以蛋白浓度达到1～3mg/ml为佳，否则应增加细胞或组织的量。
3、样品检测：
①按照下表设置96孔板反应体系，溶液应按照顺序依次加入，即Assay buffer→待
测样品→Ac-VDQQD-p NA(2mM)。
同时应设置不加待测样品的反应孔作为空白对照。
酶活性过低或过高，可增加或减少待测样品的用量，大多数情况下，每个反应体系加入10～15μl待测样品即可，并注意避免产生气泡。
空白对照高酶活性样品低酶活性样品Assay buffer 90μl 85μl 65μl
待测样品0μl 5μl 25μl
Ac-VDQQD-p NA(2mM) 10μl 10μl 10μl
总体积100μl 100μl 100μl
②孵育：盖紧96孔板，孵育。
肉眼可见颜色发生变化时，即可进行A405检测；如果
颜色变化不明显，可适当延长孵育时间甚至过夜。
③待测样品A405分别减去空白对照A405即为样品Caspase 2水解底物产生的p NA
吸光值，根据标准曲线即可获得酶的含量。
④用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT，不
适合采用BCA法进行蛋白浓度测定)，进而计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 2的酶活力单位即Caspase 2酶活力单位/mg protein。
计算结果：
①Caspase 2酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will
cleave 1.0 nmol of the colorimetric substrate Ac-VDQQD-p NA per hour at
37℃under saturated substrate concentrations，即当底物饱和时，在37℃一个小时内可以剪切1nmol Ac-VDQQD-p NA产生1nmol p NA的caspase 2的酶量。
根据p NA标准曲线和样品A405值，可计算出Caspase 2酶活力单位。
说明：底物的起始浓度为0.2mM，此时底物是饱和的，对于许多样品而言在37℃孵育2个小时以内底物都是饱和的；对于样品中Caspase 2酶活力特别高的情况，须用
Caspase Lysis buffer适当稀释样品后再进行测定。
②Caspase 2酶活性的另外一种表示方法是Caspase活性增加的百分比即实验处理
组A405/实验对照组A405×100%，简单而可靠，可粗略的反应酶活性情况。
注意事项：
1、建议每次测定时都做标准曲线，以使标准更准确，另外标准品需避免反复冻融。
2、如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的最小检
测体积，尽量采用100μl体积以内的比色杯。
3、所测样本的值高于标准曲线的上限，应用裂解液稀释样品后重新测定。
4、样品蛋白有效含量过低或Caspase激活水平过低都会导致实际测得的A405过低，应注
意使蛋白浓度尽量达到1～3μg/ml，调整诱导凋亡的时间和条件。
5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12个月有效。
相关：
编号名称
CC0007 磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁)
DC0032 Masson三色染色液
NR0001 DEPC处理水(0.1%)
PW0082 丽春红S染色液(1×Ponceau S)。