土壤脲酶活性测定(改良靛酚蓝比色法)

土壤脲酶的测定方法（改良靛酚蓝比色法）

一、原理

以尿素为底物，经培养后根据脲酶酶促产物--氨（忽略硝化过程造成的氨氮损失）在碱性介质中与苯酚、次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚。该生成物数量与氨浓度成正比。后即称为靛酚蓝比色法，其结果精确性较高，重现性较好，在脲酶活性测定中的应用最为广泛。

二、试剂

1）甲苯

1ml/ps

注：甲苯易挥发，要在通风条件好的地方操作。

2）5%尿素：称取5g尿素，用水溶至100ml。

10ml/ps

3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。

20ml/ps

注：柠檬酸和氢氧化钾混合时大量放热，需小心缓慢混合，冷却后定容。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

4ml/ps

注：实际配比为：125g苯酚+4ml甲醇+37ml丙酮+25ml乙醇，混合溶解为A液。54g氢氧化钠溶解为B液，冷却后备用。A+B,定容至1000ml即得苯酚钠溶液。

苯酚有毒，常温下凝固，不宜称取，需小心。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

3ml/ps

注:一般次氯酸钠溶液瓶上标注为活性≥5.5%，163.64ml次氯酸钠定容至1000ml。

6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至500ml，得到1ml含有0.2mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取5ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。

二、器材

50ml三角瓶，50ml容量瓶，漏斗，25ml试管，定量滤纸，振荡器，分光光度器

四、操作步骤

1）称取5g过1mm筛的风干土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，盖好；

注：实际称取2g土。

2）15min后加10ml 5%尿素溶液和20ml pH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时；

注:实际使用烘箱，温度控制不稳定，最好采用恒温培养箱。

3）取出后加入20ml的2mol/L KCl溶液，用摇床摇动30min后再离心（4000r/min，20min）。将离心得到的上清液用无氮滤纸过滤；

注：实际加入10ml氯化钾溶液；文献描述水土比为4:1。

4）取滤液３ml于50ml比色管中过滤，加蒸馏水至20ml，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀；

注：实际吸取滤液2ml。

5）20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）；

标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

注意事项:

1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质（尿素），其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。

2、整个实验设置一个无土对照（尿素＋柠檬酸盐），不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。

3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样

四、结果计算：

以24小时后1g土壤中NH3-N的毫克数表示土壤脲酶活性（Ure）。

Ure=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m

式中：a样品：样品吸光值由标准曲线求得的NH3-N毫克数；

a无土：无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3-N毫克数；

a无基质：无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3-N毫克数；

V：显色液体积；

n：分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积；

m：烘干土重。