土壤脲酶活性测定(改良靛酚蓝比色法)
土壤脲酶活性测定(改良靛酚蓝比色法)
土壤脲酶的测定方法（改良靛酚蓝比色法）一、原理以尿素为底物，经培养后根据脲酶酶促产物--氨（忽略硝化过程造成的氨氮损失）在碱性介质中与苯酚、次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚。
该生成物数量与氨浓度成正比。
后即称为靛酚蓝比色法，其结果精确性较高，重现性较好，在脲酶活性测定中的应用最为广泛。
二、试剂1）甲苯1ml/ps注：甲苯易挥发，要在通风条件好的地方操作。
2）5%尿素：称取5g尿素，用水溶至100ml。
10ml/ps3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。
将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。
20ml/ps注：柠檬酸和氢氧化钾混合时大量放热，需小心缓慢混合，冷却后定容。
4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。
将A、B溶液保存在冰箱中。
使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
4ml/ps注：实际配比为：125g苯酚+4ml甲醇+37ml丙酮+25ml乙醇，混合溶解为A液。
54g氢氧化钠溶解为B液，冷却后备用。
A+B,定容至1000ml即得苯酚钠溶液。
苯酚有毒，常温下凝固，不宜称取，需小心。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
3ml/ps注:一般次氯酸钠溶液瓶上标注为活性≥5.5%，163.64ml次氯酸钠定容至1000ml。
6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至500ml，得到1ml含有0.2mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取5ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。
二、器材50ml三角瓶，50ml容量瓶，漏斗，25ml试管，定量滤纸，振荡器，分光光度器四、操作步骤1）称取5g过1mm筛的风干土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，盖好；注：实际称取2g土。
土壤脲酶(S-UE)活性检测试剂盒说明书__微量法UPLC-MS-4045
微量法土壤脲酶（S-UE）活性检测试剂盒说明书注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：UPLC-MS-4045规格：100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称规格保存条件试剂一液体2mL×1瓶（自备）2-8℃保存试剂二粉剂×2瓶2-8℃保存试剂三液体20mL×1瓶2-8℃保存试剂四A液液体1mL×1支2-8℃保存试剂四B液液体4mL×1瓶2-8℃保存试剂五液体0.3mL×1瓶2-8℃保存标准品液体1mL×1支2-8℃保存溶液的配制：1、试剂一：自备甲苯；2、试剂二：临用前取1瓶加入2.7mL蒸馏水，充分溶解待用，用不完的试剂2-8℃保存4周；3、试剂四：临用前将A液和B液按体积比1：4混合待用；用多少配多少；4、试剂五：液体置于试剂瓶内EP管中，使用前需先离心。
临用前加入5.7mL蒸馏水，混匀，待用；用不完的试剂2-8℃保存两周；5、标准品：1mg/mL氮标准液。
产品说明：S-UE能够水解尿素，产生氨和碳酸。
土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关。
土壤脲酶活性反应了土壤的氮素状况。
利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的NH3-N。
Urea S-U E NH4++H2CO3NH4++ClO-+Phenol Alkaline solution Indophenol Blue(630nm)注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、30-50目筛、研钵、冰、甲苯（不允许快递）和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）新鲜土样自然风干或37℃烘箱风干，过30~50目筛。
实验一 土壤脲酶活性测定
3、在过滤的间隙时间取两个50ml比色管，各加入10,00ml 4%硼酸溶液。现将50ml比色管在冷凝管下，使冷凝管出口 尖端插入硼酸溶液中，准备蒸馏。 4、过滤完毕后，迅速往蒸氨瓶内注入20ml 4N 的NaOH溶液， 立即塞上塞子。接通冷凝水，加热蒸馏。 5、当馏出液达到50ml左右，停止蒸馏。取下比色管，将管 内接收液定量转入到50ml锥形瓶中加4-5滴指示剂（甲基 红-亚甲基蓝混合液），用0.1N HCL滴定瓶内的氨，滴定 到淡紫色为终点。记录试样和对照消耗的HCL体积V和V0 （ml）。
对于脲酶，它能促使尿素水解转化成氨、二氧化碳，反 应如下 :
在土壤中，在pH值为6.5~7.0是脲酶活性最大，通过测 定释放出的NH3量，可以确定脲酶的活性。土壤中脲酶活 性一般以37℃培养48小时每克土壤释放出的NH二个250ml锥形瓶，各加入10.0克土壤，再各加入10ml 混合磷酸盐缓冲溶液（pH6.8）。摇动处理15分钟，使均 匀。在往第一瓶内加入10ml浓度10%的尿素溶液，再经屏 内容物充分混匀，作为试样。第二瓶内加入10ml蒸馏水， 作为对照。将两个瓶置于37℃培养箱中培养48小时（要塞 上纱布塞子）。 2、培养结束后，往两个瓶内各加入50ml 2N KCL 溶液。塞 紧后再振荡30分钟。到时立即将试样过滤（滤纸可以用蒸 馏水润湿）到蒸氨瓶内。
实验一 土壤脲酶活性测定
一、实验目的
1. 掌握土壤脲酶活性测定第一种方法，了解所取土壤的脲酶 活性。 2. 了解尿素这一有机物在土壤环境中的降解转化。
二、简单原理
酶是一类具有蛋白质性质的、高分子的生物催化剂。土 壤酶 是活的有机体所合成的，或者在其生长过程中分泌 与体外，或者在其死亡后自溶而释放出。所有的酶均能显 示其活性。显著的酶的特征之一是其催化反应的专一性。 例如，脲酶对尿素的催化降解就及其专一。土壤中的酶的 来源有二种。一是来自于高等植物根系分泌及土壤中动植 物残体分解。二是来源于土壤微生物的生命活动。土壤酶 可分为胞内酶和胞外酶两种。胞外酶或溶出后的胞内酶进 入土壤结构后，均具有相对稳定性，如能抗微生物分解和 抗热稳定性等。它们以三种形式存在于土壤中，一是以吸 附状态贮积于土壤中。二是于土壤腐殖质复合存在。三是 以游离状态存在。
土壤酶活活性测定方法
土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。
（二）试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100mL。
3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。
将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。
4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。
将A、B溶液保存在冰箱中。
使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg氮的标准液。
（三）测定步骤（1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。
将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。
（2）土壤中脲酶活性的测定称取10 g土壤置于100mL容量瓶中。
用2mL甲苯处理15分钟。
往瓶中加入10mL 10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液（pH6.7）。
仔细混合后，将瓶放在37℃恒温箱中，放置3 h。
与此同时，进行以水代替基质，及无土壤的基质对照测定。
培养结束后，用热至38℃的水稀释至刻度。
摇匀，将悬液过滤。
吸取1mL 滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水加至10mL。
然后按标准曲线绘制的操作加入苯酚钠等试剂，显色，比色，最后根据标准曲线求出氨态氮含量。
土壤酶测定方法
土壤磷酸酶（酸性）——磷酸苯二钠比色法（一）试剂1. pH5醋酸盐缓冲液：A:0.2mol/L 醋酸溶液（11.55ml稀释至1000ml）B:0.2mol/L醋酸钠溶液 A液14.8ml+B液35.2ml稀释至100ml 若使用无水乙酸及乙酸钠配制1升0.2M PH为5.0的乙酸盐缓冲液，则需要无水乙酸及乙酸钠的量计算如下：①无水乙酸用量的计算：无水乙酸的浓度为17.5M，则需无水乙酸的体积为0.071×1000/17.5=4.1（毫升）；②乙酸钠用量的计算：查表知，无水乙酸钠的摩尔质量为82，则需无水乙酸钠的质量为0.13×82×1=11（克）。
使用无水乙酸及乙酸钠配制1升0.2M PH为5.0的乙酸盐缓冲液的方法如下：用量筒量取4.1毫升无水乙酸至1000毫升烧杯内，再用台秤称取无水乙酸钠11克至该烧杯，然后用量筒量取1000-4.1=996毫升蒸馏水至该烧杯内，搅拌至乙酸钠溶解并呈均匀的溶液即为1升0.2M PH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液。
或者：量7ml 0.2M醋酸钠液+3ml 0.2M醋酸液混合即得。
2. 0.5%磷酸苯二钠：pH5醋酸缓冲液3. 氯代二溴对苯醌亚胺：称取0.125g 2，6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇（48ml乙醇+2ml水）溶解，贮存于棕色瓶中，存放在冰箱中，保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
4. 酚标准溶液：酚原液---取1g苯酚溶于蒸馏水中，定容至1000ml水中，保存于棕色瓶中。
酚工作液---取10 ml酚原液稀释至1000ml水中，每毫升含0.01mg 酚5. 甲苯6.0.3%硫酸铝溶液，称取0.3g硫酸铝，定容至100ml。
（二）实验步骤1. 标线制作取0，1，3，5，7，9，11，13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。
脲酶测定试剂盒说明书
脲酶（Urease，UE）测定试剂盒说明书分光光度法50管/24样注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：UE能够水解尿素，产生氨和碳酸。
UE活性与有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关，反应了氮素状况。
测定原理：利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的NH3-N。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1ml比色皿、研钵、冰、和蒸馏水。
试剂的组成和配制：提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；试剂一：粉剂×1瓶，临用前加入5mL蒸馏水，充分溶解待用，4℃保存；用不完的试剂4℃保存；试剂二：液体12mL×1瓶，4℃保存；试剂三A液：液体×1支，4℃保存；试剂三B液：液体×1瓶，4℃保存；临用前将A液倒入B液中混合，待用；用不完的试剂4℃保存一周；试剂四：液体5mL×1瓶，4℃保存；样本的前处理：1、细菌、细胞或组织样品的制备：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至578nm，蒸馏水调零。
2、酶促反应试剂名称测定管对照管样本（μL）20 20试剂一（μL）90蒸馏水（μL）90试剂二（μL）190 190混匀，放入37℃水浴1h后，10000g 25℃离心10min，取上清液。
土壤脲酶活性的比色法测定
土壤脲酶活性的比色法测定是一种常用的方法，它可以测量土壤中脲酶的存在和活性。
这种方法通常使用一种叫做脲酶试剂盒的工具，该试剂盒中包含了所需的试剂和比色剂。
具体的测试步骤如下：
取一定量的土壤样品，并加入适量的水，搅拌均匀。
将混合物加入试剂盒中，加入脲酶试剂。
按照试剂盒中的说明，在一定的时间内进行反应。
比较样品的颜色和标准对照物的颜色，并记录下来。
根据脲酶试剂盒的不同，颜色的变化可能会有所不同。
一般来说，脲酶的存在和活性越高，样品的颜色就会越深。
通过对样品颜色的比较，就可以知道土壤中脲酶的存在和活性水平。
请注意，这种方法只能测量土壤中脲酶的活性水平，并不能测量脲酶的种类和数量。
土壤脲酶活性的比色法测定是一种常用的测量土壤中脲酶存在和活性的方法。
它使用脲酶试剂盒，包含所需试剂和比色剂。
测试步骤包括取样、加水搅拌、加入试剂盒、反应并比较颜色。
结果表明，脲酶存在和活性越高，样品颜色越深。
注意，这种方法只能测量脲酶活性水平，不能测量脲酶种类和数量。
土壤酶活性测定
土壤与环境微生物研究法／李振高，骆永明，滕应编著．一北京：科学出版社，2008过氧化氢酶（398-399）脲酶（404-405）磷酸酶（412-413）关松荫/土壤酶及其研究法农业出版社 1986年七月第一版蔗糖酶274-276土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。
（二）试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，加蒸馏水90ml。
3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：取184g柠檬酸溶于300ml蒸馏水中，另取147.5g KOH 溶于蒸馏水，再将二种溶液合并，用1N NaOH将pH调节至6.7，用水稀释至1L。
4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A 液），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B液）,存于冰箱中。
将A、B溶液保存在冰箱中。
使用前将两种溶液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg 氮的标准液（100ppm）。
（三）测定步骤（1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即为10ppm，吸取0、1、2、3、4、5、10、15、20 mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。
即为0、0.2ppm、0.4ppm、0.6ppm、0.8ppm、1ppm、2ppm、3ppm、4ppm的标准曲线。
将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。
土壤酶活性测定方法
土壤酶活性测定方法土壤酶活性测定方法一、蔗糖酶: 3，5-二硝基水杨酸比色法1. 试剂配制（1）2N氢氧化钠200mL：称取16g 氢氧化钠，用蒸馏水溶解，定溶于200mL容量瓶中。
（2）3，5-二硝基水杨酸溶液1000mL：称5g二硝基水杨酸，溶于200mL2N氢氧化钠和500mL蒸馏水中，再加300g酒石酸钾钠，用蒸馏水稀释至1000mL（不超过7天）。
（3）1/15M 磷酸氢二钠1000mL：23.867g N a2HPO4·12H2O 溶于1000mL蒸馏水中。
（4）1/15M 磷酸二氢钾1000mL：9.078g KH2PO4溶于1000mL蒸馏水中。
（5）pH5.5磷酸缓冲液100mL：5 mL磷酸氢二钠(1/15M)加95mL磷酸二氢钾(1/15M) （6）8%蔗糖1000mL：称取80g蔗糖，用水溶解，稀释至1000mL。
（7）甲苯。
（8）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）1000mL：取少量葡萄糖在真空干燥箱中，于55℃条件下真空干燥至恒重。
然后取1.00g葡萄糖溶于100ml蒸馏水中成标准葡萄糖母液（10mg还原糖/ml）。
取此母液10ml, 用蒸馏水定容至100mL即成标准葡萄糖液（1mg/ml）；2. 操作步骤（1）标准曲线绘制：分别取标准葡萄糖液0.4mL，0.8 mL，1.2mL, 1.6mL, 2.0mL,2.8mL, 3.2mL于50 mL比色管中，另取一管做空白对照。
用蒸馏水补足至10mL。
加入3.0mL 3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5min，随即在自来水流下冷却。
最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。
比色后，以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。
（2）土壤蔗糖酶活性测定：称5.00g土样，置于50mL三角瓶中，注入15.0mL 8%蔗糖溶液，5.0mL pH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。
摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。
沉积物中酶的测定方法
沉积物中酶的测定方法水解酶一、脲酶（靛酚比色法）大多数细菌、真菌和高等植物均具有脲酶（urease）。
它是一种酰胺酶（amidase），能酶促有机质分子中肽键的水解。
土壤的脲酶活性与土壤的微生物数量、有机质含量、全氮和速效氮含量呈正相关。
人们常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素状况。
根据脲酶水解时生成的氨与苯酚钠及次氯酸钠反应，形成兰色靛酚这一原理。
此法的精确性较高，重现性较好。
试剂配制：1．甲苯（分析纯）2．10%尿素：尿素（分析纯）10g溶于100ml蒸馏水中。
3．柠檬酸盐缓冲液：368g柠檬酸（分析纯）溶于600ml蒸馏水中；295g氢氧化钾溶于1000ml蒸馏水；将二种溶液合并，用1mol/L氢氧化钠调pH至6.7，并用蒸馏水稀释至2L。
4．苯酚钠溶液：A.62.5g苯酚溶于少量95%乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml，存于冰箱中。
B.27g氢氧化钠溶于100ml水中保存于冰箱中。
使用前，将溶液A、B各吸取20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml备用。
5．次氯酸钠溶液：用蒸馏水稀释试剂，至活性氯浓度为0.9%。
（次氯酸钠活性氯浓度为5.2%）。
标准溶液：氮的标准溶液：精确称取称0.4717g硫酸铵（105℃烘干）溶于水，稀释至1L，则得1ml含0.1mg氮的标准溶液，即100ppm。
将100ppm的标准溶液稀释为10ppm。
标准曲线绘制：分别吸取0.5ml、1.5ml、2.5ml、3.5ml、4.5ml、5.5ml、6.5ml、7.5ml稀释后的标准溶液于50ml容量瓶或刻度试管中，然后加蒸馏水至25ml。
再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。
20min后显色，定容至50ml。
1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。
根据吸光度和溶液浓度绘制标准曲线。
（溶液浓度为：0.1ppm、0.3ppm、0.5ppm、0.7ppm、0.9ppm、1.1ppm、1.3ppm、1.5ppm。
土壤脲酶(Solid-Urease,S-UE)测定试剂盒说明书
货号：MS2933 规格：100管/48样土壤脲酶（Solid-Urease，S-UE）测定试剂盒说明书微量法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：S-UE能够水解尿素，产生氨和碳酸。
土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关。
土壤脲酶活性反应了土壤的氮素状况。
测定原理：-N。
利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的NH3自备实验用品及仪器：可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、甲苯（不允许快递）和蒸馏水。
试剂的组成和配制：试剂一：甲苯2mL×1瓶，4℃保存；（自备）试剂二：粉剂×1瓶，临用前加入9mL蒸馏水，充分溶解待用，4℃保存；用不完的试剂4℃保存；试剂三：液体22mL×1瓶，4℃保存；试剂四A液：液体×1支，4℃保存；试剂四B液：液体×1瓶，4℃保存；临用前将A液倒入B液中混合，待用；用不完的试剂4℃保存一周；试剂五：液体2mL×1瓶，4℃保存；样品处理：新鲜土样自然风干或37度烘箱风干，过30~50目筛。
测定步骤：2、将培养结束的上清液稀释10倍（取0.1mL上清液，加入0.9mL蒸馏水）。
第1页，共2页个对照管。
脲酶活力计算：a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准条件下测定的回归方程为y = 0.0915x +0.0373；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值A。
单位的定义：每天每g土样中产生1μg NH-N定义为一个酶活力单位。
3脲酶活力（μg/d/g 土样）＝(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反总÷W÷T =656×(ΔA -0.0373) 10：稀释倍数；T：反应时间，1d； V反总：反应体系总体积：0.3mL；W：样本质量，0.05g。
b.用96孔板测定的计算公式如下标准条件下测定的回归方程为y = 0.04575x +0.0373；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值A。
土脲酶测定实验报告
一、实验目的1. 了解土脲酶的概念和作用；2. 掌握土脲酶的测定方法；3. 分析土脲酶在土壤环境中的分布和影响因素。
二、实验原理土脲酶是一种水解脲的酶，能将土壤中的尿素分解成氨和二氧化碳，从而释放出氮素。
土脲酶的活性是土壤氮素循环的重要指标，对土壤肥力、作物生长及环境质量具有重要意义。
本实验采用酚酞比色法测定土脲酶活性。
在碱性条件下，脲酶将尿素分解成氨，氨与酚酞指示剂发生反应，生成红色络合物，通过测定红色络合物的吸光度，可以计算出氨的浓度，进而推算出土脲酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：土壤样品、尿素、酚酞指示剂、氢氧化钠、硫酸、无水碳酸钠、硫酸钾、蒸馏水等；2. 实验仪器：分光光度计、电子天平、锥形瓶、移液管、烧杯、漏斗、玻璃棒、容量瓶等。
四、实验步骤1. 土壤样品的制备：取一定量的土壤样品，加入适量的蒸馏水，充分振荡，过滤，收集滤液；2. 标准曲线的制作：配制一系列不同浓度的氨标准溶液，分别加入酚酞指示剂，用氢氧化钠溶液滴定至终点，记录滴定数据，绘制标准曲线；3. 土脲酶活性的测定：a. 将土壤样品与适量的尿素溶液混合，加入酚酞指示剂，在一定的温度下反应一定时间；b. 反应结束后，用氢氧化钠溶液滴定至终点，记录滴定数据；c. 根据标准曲线，计算氨的浓度，进而推算出土脲酶的活性。
五、实验结果与分析1. 标准曲线的制作：绘制标准曲线，线性范围为0.1-1.0mg/L；2. 土脲酶活性的测定：根据实验数据，计算出不同土壤样品的土脲酶活性，并进行分析。
（此处省略实验数据及分析）六、实验结论1. 土脲酶在土壤环境中具有重要作用，其活性受土壤类型、温度、水分、有机质等因素的影响；2. 本实验采用酚酞比色法测定土脲酶活性，操作简便，结果准确；3. 通过对土壤样品的测定，可以了解土壤中土脲酶的分布及影响因素，为土壤改良和作物生长提供依据。
七、实验注意事项1. 实验过程中要严格控制温度、时间等因素，确保实验结果的准确性；2. 使用移液管、滴定管等精密仪器时，要注意操作规范，避免误差；3. 实验过程中要妥善处理废弃物，确保实验安全。
脲酶的测定方法
一、脲酶测定比色法脲酶是对尿素转化起关键作用的酶,它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源,它的活性可以用来表示土壤供氮能力;1、试剂配制：（1）柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中,另取295g氢氧化钾溶于水,再将两种溶液合并,用1N氢氧化钠将pH调至,并用水稀释至2L;（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中,加2mL甲醇和丙酮,后用乙醇稀释至100mLA液,保存再冰箱中;称取27g氢氧化钠溶于100mL水中B液,保存于冰箱中;使用前,取A、B两液各20mL混和,并用蒸馏水稀释至100mL备用;（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为％,次氯酸钠溶于1L 水中溶液稳定;（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中;（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L,则得1mL 含的标液,再将此液稀释10倍制成氮工作液mL;2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液ｐＨ,仔细混匀;在37℃恒温箱中培养24ｈ;然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度甲苯应浮在刻度以上,摇荡,将悬液过滤;取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液,加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值;脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量;标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中,加蒸馏水至20mL,再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液,随加随摇匀,20min后显色,定容;1h内再分光光度计上于578nm处比色;3、结果计算以24小时后1g土壤中NH3－N的质量mg表示脲酶活性UreUre＝a·V·n/m式中：a为由标准曲线求得的NH3－N浓度mg/mL；V为显色液体积50mL；n 为分取倍数；m为烘干土重g;补充：1 1h内在青定酚的蓝色在1h内保持稳定在分光光度计上用1cm液槽,于578nm 处将显色液进行比色测定;2 无土对照：不加土样,其他操作与样品实验相同;以检验试剂纯度,整个实验设置一个对照3无基质对照：以等体积的水代替基质,其他操作与样品实验相同;每个土样都设此对照;。
草莓连坐土壤脲酶活性结题报告
《草莓连作过程中土壤脲酶活性的检测》大学生创新训练计划项目结题报告项目组成员：黄涛邵健敏李佳杨指导老师：刘小林教授学院:生命科学与资源环境学院摘要：土壤脲酶是土壤中一种重要的酶，其作用是催化土壤中的尿素水解，其活性变化与土壤中的氮素含量与理化性质有关。
因此测定草莓连作各个时期脲酶的活性变化对研究草莓连作土壤脲酶活性的影响有重要理论意义和实践意义。
本实验是采用靛酚蓝比色法测定土壤中的脲酶活性，目前，对土壤中的脲酶研究较多，但对作物连作中土壤脲酶活性变化的研究较少，尤其对草莓连作过程中脲酶变化及其对草莓连作自毒障碍影响的研究则更少。
关键词：土壤脲酶、靛酚蓝比色法、草莓连作、酶活性。
一、实验研究内容1.标准曲线的测定吸取10ml氮的标准溶液定容至100ml，摇匀。
从其中分别吸取0，1.00，3.00，5.00，7.00，10.00ml 13.00ml移至50ml比色管中，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠的溶液，充分混合。
紧接着加入3ml次氯酸钠，随加随摇匀，放置20分钟,用水稀释至刻度。
将显色液在可见分光光度计上于578nm处，以1cm比色皿进行比色测定，以试剂空白为参比。
以标准溶液氮含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线：图1 氮的标准曲线2.土样中脲酶活性的测定分别称取2g过1mm筛的风干土样于50ml锥形瓶中，向其中加入1ml甲苯，以使土样全部湿润为宜。
放置15分钟后，加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（pH=6.7），并摇匀。
将锥形瓶放入37℃恒温箱中，培养24h。
培养结束后，加热至38℃水稀释至刻度，充分摇荡，并将悬液用滤纸过滤到锥形瓶中。
设置有土无基质对照，即考察各种溶液和土壤中氨氮存在带来的影响。
分别吸取（1-3ml）滤液于50ml容量瓶中，加蒸馏水至20ml，充分震荡，然后加入4ml 苯酚钠，充分混合，再加入3ml次氯酸钠充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现靛酚的蓝色（在1h内保持稳定）。
土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶活性的测定
土壤酶活性的测定方法及部分样品配制详细请参考《土壤微生物分析方法手册》，《土壤酶及其研究法》土壤样品采集与制备土壤样品取样后混匀，用于土壤酶活性测定的土壤磨细过2mm筛后，置于4℃冰箱内保存备测。
1.土壤酶活性的测定方法1.1.脲酶采用靛酚蓝比色法方法原理：本法基于以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，用于尿酶活性的测定。
操作步骤：取10g风干土，置于100ml三角瓶中，加2ml甲苯，15min后加10ml 10%尿素液和20ml pH6.7柠檬酸盐缓冲液。
摇匀后在37℃恒温箱中培养3h。
按此操作，进行以水代替基质，及无土壤的基质对照测定，过滤后取0.5ml滤液于50ml比色管中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。
氮的标液：精确称取0.4717g硫酸按溶于水并稀释至1000ml，则得1ml含0.1mg氮的标准液。
绘制标准曲线时，可将此液稀释10倍供用。
pH6.7柠檬酸盐缓冲液：用368g柠檬酸溶于600ml水，另取295g氢氧化钾溶于水，再将二种溶液混合，然后用1M的氢氧化钠调节pH到6.7，定容到2L。
苯酚溶液：称取苯酚（C6H5OH）10g和硝基铁氰化钠[Na2Fe(CN)5NO2H2O]100mg稀释至1L。
此试剂不稳定，须贮于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存。
次氯酸钠碱性溶液：称取氢氧化钠（化学纯）10g、磷酸氢二钠（Na2HPO4·7H2O, 化学纯）7.06g、磷酸钠（Na3PO4·12H2O, 化学纯）31.8g 和52.5g·L-1次氯酸钠(NaOCl，化学纯，即含5%有效氯的漂白粉溶液)10mL 溶于水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存。
标线绘制：取稀释的标准液0、l、2、4、6、8、10ml，移于50rnl容量瓶中，然后加入蒸馏水至20mL。
再加4mL苯酸钠溶液和4mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。
土壤酶活性的测定
土壤酶活性的测定1.土壤样品采集与制备取根际土壤为土壤样品，同时挖取根系周围0-20cm和20-40cm土样，分层充分混合后作为非根际土壤样品。
充分混匀后取样，用于土壤酶活性测定的土壤经风干后，过1mm筛，测定多酚氧化酶活性土样过0.25mm筛。
供微生物分析的鲜土样装入已消毒过的密封塑料袋，带回实验室，磨细过2mm筛后，置于4℃冰箱内保存备测土壤微生物种群、数量等。
2.土壤酶活性的测定方法2.1.土壤脲酶比色法测定多酚氧化酶、过氧化物酶活性采用邻苯三酚比色法测定；过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法；碱性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法（2）测定操作步骤：称2g过1mm筛风干土，置于100mL三角瓶中，注入40mL蒸馏水和5mL 0.3%过氧化氢溶液，振荡(120次/分钟)20分钟。
随即加入3N硫酸5mL，稳定未分解的过氧化氢并终止反应。
用慢速型滤纸过滤瓶中的土壤悬浊液，吸取25nil滤液，用0.01N高锰敏钾滴定至淡粉红色终点。
结果计算：设滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量(mL数)为B滴定25而原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量(mL数)为A高锰酸钾滴定度的校正值为T=(A-B)×T/2等于20分钟土壤的过氧化氢酶活性(mL 0.lmol KMnO4/g)2.2.脲酶采用靛酚蓝比色法操作步骤：取2.5g风干土，置于50mL三角瓶中，加0.5mL甲苯，15min后加5mL 10%尿素液和10mL pH6.7柠檬酸盐缓冲液。
摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。
过滤后取0.5mL滤液注入25mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。
氮的标液：精确称取0.4717g硫酸按溶于水并稀释至1000mL，则得1mL含0.1mg氮的标准液。
绘制标准曲线时，可将此液稀释10倍供用。
标线绘制：取稀释的标准液l、3、5、7、9、11、13mL，移于50rnl容量瓶中，然后加入蒸馏水至20mL。
再加4mL苯酸钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
土壤脲酶的测定方法（改良靛酚蓝比色法）
一、原理
以尿素为底物，经培养后根据脲酶酶促产物--氨（忽略硝化过程造成的氨氮损失）在碱性介质中与苯酚、次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚。
该生成物数量与氨浓度成正比。
后即称为靛酚蓝比色法，其结果精确性较高，重现性较好，在脲酶活性测定中的应用最为广泛。
二、试剂
1）甲苯
1ml/ps
注：甲苯易挥发，要在通风条件好的地方操作。
2）5%尿素：称取5g尿素，用水溶至100ml。
10ml/ps
3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。
将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。
20ml/ps
注：柠檬酸和氢氧化钾混合时大量放热，需小心缓慢混合，冷却后定容。
4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。
将A、B溶液保存在冰箱中。
使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
4ml/ps
注：实际配比为：125g苯酚+4ml甲醇+37ml丙酮+25ml乙醇，混合溶解为A液。
54g氢氧化钠溶解为B液，冷却后备用。
A+B,定容至1000ml即得苯酚钠溶液。
苯酚有毒，常温下凝固，不宜称取，需小心。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
3ml/ps
注:一般次氯酸钠溶液瓶上标注为活性≥5.5%，163.64ml次氯酸钠定容至1000ml。
6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至500ml，得到1ml含有0.2mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取5ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。
二、器材
50ml三角瓶，50ml容量瓶，漏斗，25ml试管，定量滤纸，振荡器，分光光度器
四、操作步骤
1）称取5g过1mm筛的风干土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，盖好；
注：实际称取2g土。
2）15min后加10ml 5%尿素溶液和20ml pH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时；
注:实际使用烘箱，温度控制不稳定，最好采用恒温培养箱。
3）取出后加入20ml的2mol/L KCl溶液，用摇床摇动30min后再离心（4000r/min，20min）。
将离心得到的上清液用无氮滤纸过滤；
注：实际加入10ml氯化钾溶液；文献描述水土比为4:1。
4）取滤液３ml于50ml比色管中过滤，加蒸馏水至20ml，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀；
注：实际吸取滤液2ml。
5）20min后显色，定容。
1h内在分光光度计与578nm波长处比色。
（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）；
标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。
再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。
20min后显色，定容。
1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。
然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
注意事项:
1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质（尿素），其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。
2、整个实验设置一个无土对照（尿素＋柠檬酸盐），不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。
3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样
四、结果计算：
以24小时后1g土壤中NH3-N的毫克数表示土壤脲酶活性（Ure）。
Ure=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m
式中：a样品：样品吸光值由标准曲线求得的NH3-N毫克数；
a无土：无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3-N毫克数；
a无基质：无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3-N毫克数；
V：显色液体积；
n：分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积；
m：烘干土重。