靛酚蓝_分光光度法测定胃肠道内容物中氨态...

表 1 氨态氮工作曲线的制定
Tab. 1 Establishment of linear work curve of N H4+ 2N
试剂 对照
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
溶液 A/ mL 5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
溶液 B/ mL 5
5
5
5
5
5
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5
5
5
5
标准液/μL 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0. 321
0. 353
0. 333
0. 372
0. 345
0. 379
0. 336
0. 371
Abstract : The impact facto r s of determinatio n of N H4+ 2N co ntent in gast rointestinal co ntent s were
screened wit h indop henol blue spect rop hoto met ric met hod. The result s showed t hat t he optimum factor s were reactio n temperat ure at 40 ℃,reactio n time fo r 20 min ,catalyst at 25 mg/ L and determinate at 640 nm ,respectively. A linear wo rk curve of N H4+ 2N wit h R2 = 0. 999 1 had been achieved ,wit h 0～5. 0 μg of linearit y extensio n andε640 = 1. 26 ×103 L/ ( mol ·cm) . No significant difference in determinatio n result s was fo und bet ween t his met hod and colorimet ry met hod. It was suggested t hat indop henol blue spect rop ho2 to met ric met ho d can be used as a met ho d to determine N H4+ 2N co ntent in gast rointestinal co ntent s. Key words : indop henol blue spect rop hoto met ric met hod ;gast rointestinal co ntent ;ammo nia nit rogen
(BRF060303) . 收稿日期 : 2008203205
前 ,在临床上用于快速测定肠道内容物中氨态氮的 方法主要为粪污计法 、电导法 、氨电极法 、粪污氮含 量计量仪法 、反射计法等[1 ,2] ,这些方法检测速度快 但准确性稍低 ,适合于临床快速检验. 实验室的检测 手段主要有氧化镁直接蒸馏法[3] 和比色法[429 ] . 蒸馏 法操作较为繁琐 ,比色法操作简单 、快速 ,但该法对 检测的显色时间 、温度及催化剂浓度等条件都没有 进一步的研究报道 ,检测的结果就可能会因人而异. 靛酚蓝 - 分光光度法作为一种操作方便 、重现性和 准确度都比较高的分析方法 ,原理与比色法相近 ,常
第 5 期 蒲万霞等 :靛酚蓝2分光光度法测定胃肠道内容物中氨态氮含量研究 15
2 结果
2. 1 确定检测波长 由图 1 可知 ,波长在 620～650 nm 范围内 OD 值变化不大 ,640 nm 最高 ,因此 ,确定 640 nm 为最
佳波长. 2. 2 催化剂浓度和反应温度的确定 由表 2 和图 2 可知 ,催化剂浓度为 25 mg/ L ,温 度 40 ℃为最佳反应条件.
(1. College of Veterinary Medicine , Gansu Agricult ural U niversity ,Lanzho u 730070 ,China ; 2. Lanzho u Instit ute of Animal Husbandry & Veterinary Pharmaceutics Science , Chinese Academy of Agricult ural Sciences ,Lanzho u 730050 ,China)
(1. 甘肃农业大学动物医学院 ,甘肃 兰州 730070 ; 2. 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 ,甘肃 兰州 730050)
摘要 : 对靛酚蓝2分光光度法检测胃肠道内容物中氮含量的试验条件进行了筛选 ,结果表明 :催化剂质量浓度 25 mg/ L ,在 640 nm 的波长下 ,40 ℃水溶显色 20 min 为最佳检测试验条件 ;氨态氮标准曲线相关系数为 0. 999 1 , 线性范围为 0～5. 0μg ,摩尔吸光系数ε640 = 1. 26 ×103 L/ (mol ·cm) ,最低检出限为 0. 127μg ;该方法与比色法的 测定结果间无显著性差异 ,可用于胃肠道内容物中氨态氮含量的检测. 关键词 : 靛酚蓝2分光光度法 ;胃肠道内容物 ;氨氮 中图分类号 : Q 5233 文献标识码 : A 文章编号 : 100324315 (2008) 0520013205
1 材料与方法
1. 1 材料 1. 1. 1 样品及处理 将猪肠道内容物样品按固液 比 1 ∶5 ( W/ V ,以干质量计) 加入一定量的去离子 水 ,在 150 r/ min 的速度下振荡浸提 1 h ,在 4 ℃的 低温条件下 ,以 12 000 r/ min 的速度离心 20 min , 0. 45μm 纤维树脂滤膜抽滤 ,收集滤液以水溶性指 标测定. 1. 1. 2 仪器 日本津岛紫外可见分光光度计 1. 1. 3 试剂 苯酚 ,分析纯 (白银化学试剂厂) ; (N H4 ) 2 SO4 , 分 析 纯 ( 天 津 市 巴 斯 夫 化 工 有 限 公 司) ;亚硝基铁氰化钠 ,分析纯 (天津市化学试剂研究 所) ;NaClO ,分析纯 (天津市德恩化学试剂有限公 司 ,有效氯不少于 10 %) . 1. 2 方法 1. 2. 1 氨态氮标准溶液 原液 :精确称取 0. 235 8
14 甘 肃 农 业 大 学 学 报 2008 年
用于检测相对简单体系中氨的浓度 ,如水中氨态氮 的检测[10 ,11 ] ,也有用于发酵液中氨氮含量检测[12 ,13 ] 以及血液中氨态氮的检测[14] 的报道 ,而对于胃肠道 内容物这样比较复杂的系统而言则鲜有报道. 该方 法实验原理是 : 在强碱性介质中 ,N H4+ 与次氯酸和
100
水/μL 100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
氨氮量/μg 0
0. 5
1. 0
1. 5
2. 0
2. 5
3. 0
3. 5
4. 0
4. 5
5. 0
表 2 温度与催化剂浓度的选择 Tab. 2 Selection of temperat ure and co ncent ration of catalyst
苯酚作用生成水溶性染料靛酚蓝 ,蓝色的深浅在一 定范围内与 N H4+ 的浓度 ( 3. 57 ×10 - 9 ～ 3. 57 × 10 - 8 mo如下 :
反应以 Na2 Fe (CN) 5 NO 作催化剂 ,反应体系的 p H 在 10. 5～11. 7 之间 ,这个反应最早是由 Ber2 t helot 于 1895 年发现的 ,而后则通过逐步改进而用 于氨态氮的测定. 本文是在比色法和靛酚蓝 - 分光光度法的基础 上 ,进行了进一步优化 、完善 ,对于该方法用于肠道 内容物氨氮检测过程中可能影响靛酚蓝显色的一些 因素进行了研究 ,并由此确定了该方法的最佳检测 波长 、水浴显色温度 、时间及催化剂浓度等条件 ,为 胃肠道内容物氨态氮监测寻找了一种较为简便 、切 实可行的方法.
Determinatio n of N H4+ 2N co ntent in cast rointestinal wit h indop henol blue spect rop hoto met ric met hod
PU Wan2xia1 ,2 ,W EI Yun2xia2 ,M EN G Xiao2qin1 ,WAN G Ling2 ,C H EN J io ng2ran2 , YAN G ZHi2qiang2
胃肠道内容物中氨态氮是反映胃肠道营养代 谢 、微生态环境状况的重要指标之一 ,随着动物营 养 、疾病与胃肠道微生态关系的进一步深入研究 ,胃 肠道内容物中 N H32N 的监测就显得更加重要. 目
作者简介 : 蒲万霞 (19642) ,女 ,在读博士 ,主要研究方向为肠道微生 态与免疫学.
通讯作者 : 杨志强 ,男 ,研究员 ,主要研究动物营养与代谢病. 资助基金 : 中 央 级 公 益 性 科 研 院 所 基 本 科 研 业 务 费 专 项 资 金
2008 年 10 月 第 5 期 13～17
甘 肃 农 业 大 学 学 报 J OU RNAL O F GANSU A GRICUL TU RAL UN IV ERSIT Y
第43卷 双月刊
靛酚蓝2分光光度法测定胃肠道内容 物中氨态氮含量研究
蒲万霞1 ,2 ,魏云霞2 ,孟晓琴1 ,王 玲2 ,陈炅然2 ,杨志强2
g (N H4 ) 2 SO4 溶于双蒸水 ,稀释至 100 mL ,其氨态 氮含量为 500 μg/ mL . 标准液 : 精确吸取 1 mL 原 液 ,稀释至 10 mL ,则其氨态氮含量为 50μg/ mL . 1. 2. 2 检测试剂的配制 亚硝基铁氰化钠溶液 (1. 27 %) :精确称取 0. 362 2 g 含 2 个结晶水的亚 硝基铁氰化钠 ,溶于去离子水并定容至 25 mL ,4 ℃ 保存 (可保存 1 个月) . 溶液 A :精确称取 5. 00 g 苯 酚 ,溶于 400 mL 去离子水 ,加入 2. 0 mL 的亚硝基 铁氰化钠溶液 (1. 27 %) ,定容至 500 mL ;用棕色试 剂瓶 4 ℃保存 ,若溶液变为红棕色则不能使用. 溶液 B :称取 2. 50 g NaO H ,2. 0 g 柠檬酸三钠和 3. 5 mL NaClO 溶于 400 mL 水中 ,并定容至 500 mL ,用棕 色试剂瓶 4 ℃可保存 1 个月左右. 1. 2. 3 确定检测波长 选择 3 个已知浓度样品 ,依 次在 400～800 nm 的波长下测定 OD 值 ,然后选择 3 个样品中 OD 值最大的为测定波长. 1. 2. 4 催化剂浓度和反应温度的测定 催化剂浓 度选择 10 、15 、25 、40 、50 mg/ L , 温度选择 25 、30 、 35 、37 、40 、50 、60 、70 ℃,筛选最佳反应温度和催化 剂浓度. 1. 2. 5 测定最佳水浴显色时间 选一标准样品浓 度 ,在 10 、20 、30 、40 、50 、60 、70 min 下测定其 OD 值 ,选择当 OD 值达到平衡不变时的时间作为最佳 水浴显色时间. 1. 2. 6 氨态氮工作曲线的制作 待确定波长 、时 间 、催化剂浓度及水浴显色温度后按照表 1 依次加 入各种试剂 ,充分混合后 ,按照已确定的条件进行反 应 ,测定其吸光值.