Caspase 3 活性检测试剂盒(比色法)
Caspase活性检测说明书
Caspase活性检测（基于p NA标记底物的比色法）在caspase 的底物多肽上标记发色团如：p NA，可用于检测凋亡细胞中的caspase活性及筛选caspases的激活剂或抑制剂。
本操作步骤主要针对使用酶标仪进行读数而设计。
其中使用的细胞抽提物、底物、抑制剂及p NA的用量为每个样本140ul。
若您希望设计针对分光光度计读数的实验，建议对每种溶液体积进行进一步优化。
所需溶液、试剂及设备• Caspase底物• Caspase抑制剂• 细胞裂解缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 1mM DTT, 100uM EDTA • 检测缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 10mM DTT, 100uM EDTA, 10%Glycerol• PBS：将8g NaCl、200mg KCl和1.44g Na2HPO4溶于800ml蒸馏水；用HCl调至pH7.4；定容至1L• 酶标板和酶标仪其它试剂(推荐)• 纯化的Caspase（阳性对照）• p NA细胞抽提物的制备以适合的凋亡诱导剂对细胞进行诱导（参考前述操作方法），同时做阴性对照，包括未处理细胞、用诱导剂的无诱导活性类似物处理细胞（若可得到），或一个凋亡诱导处理“零时间”样品。
应保证有足够细胞进行重复实验，包含或不含抑制剂的对照以检测蛋白浓度。
一般来说，我们下面推荐的裂解前细胞数量可以产生足够蛋白浓度供酶标仪检测；然而不同大小、体积的细胞及蛋白浓度可能需要增加铺板密度。
当裂解2×107/ml细胞是，产生的蛋白浓度约为1-3mg/ml，体积10ul，含约10-30ug蛋白。
依据其细胞系，最少应有106个细胞，体积50ul的裂解缓冲液进行处理。
• 细胞计数，离心收集细胞。
以PBS缓冲液洗涤一次。
若细胞已被caspase抑制剂处理过，建议多洗几次以防止后继实验中可能造成的不利影响。
NucView488 caspase-3活性检测双功能试剂盒
NucView TM488 CASPASE-3主要特点：在活细胞中检测Caspase-3并染色细胞核DNA直接加入细胞培液,孵育15-30分钟后即可检测，无需清洗残余染料兼容使用荧光素滤光片的流式细胞仪和荧光显微镜可固定染色NucView TM488 CASPASE-3底物是一种新型的细胞膜渗透性用于检测活细胞内caspase-3的实时活动的荧光蛋白酶底物。
细胞凋亡率从细胞到细胞会有典型的变化，即使在相同的细胞数。
结果导致各种凋亡事件或凋亡标志物，伴随着细胞凋亡过程会出现在不同的细胞中。
因此，关键是要能够探测到在单个细胞基础上的这些凋亡事件。
传统上，caspase活性使用防渗膜荧光酶底物DEVD-R110，或荧光标记抑制物如FLICA试剂等检测。
在前一种情况下，细胞需裂解，从而排除在活细胞caspase活性的检测。
此外，这种蛋白酶检测方法只能在特定时间段的高度异质性细胞群中检测平均caspase活性。
在后一种情况下，虽然FLICA试剂可以进入活细胞检测caspase的活性，但只有最初的荧光信号，可以真实地反映酶的活性或细胞凋亡的状态，因为初始“快照”后的任何检测到的信号都需要考虑酶和细胞凋亡本身抑制剂的潜在干扰。
与传统的caspase检测不同，NucViewTM 488 Caspase-3底物以互不影响的方式检测完整单个细胞内caspase-3活性。
基底由一个荧光的DNA染料和caspase-3特异性的DEVD底物组成。
基底，一种无荧光及功能的DNA染料，可以迅速穿过细胞膜进入细胞质中，经过caspase-3酶的裂解作用，形成一个高亲和力的DNA染料。
释放的DNA染料迁移到细胞核染色细胞核成明亮的绿色。
这样的NucViewTM 488 caspase-3的基板是双向功能，能够在检测细胞内的caspase-3的同时染色细胞核，即可以观察细胞凋亡中细胞核的形态学变化。
caspase-3活性荧光染色是通过标准的固定方法（在3.75％，甲醛PBS用于固定，0.5％的Triton X-100PBS用于细胞通透性），从而促进后续的染色研究。
焦亡检测指标金标准
焦亡检测指标金标准
细胞焦亡是近年来发现并证实的一种新的程序性细胞死亡方式，其特征为依赖于炎性半胱天冬酶（主要是caspase-1，4，5，11），并伴有大量促炎症因子的释放。
细胞焦亡的形态学特征、发生及调控机制等均不同于凋亡、坏死等其他细胞死亡方式。
研究表明，细胞焦亡广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展，并发挥重要作用，对细胞焦亡的深入研究有助于认识其在相关疾病发生发展和转归中的作用，为临床防治提供新思路。
证明细胞程序性死亡是否为细胞焦亡，建议至少验证如下指标：
1.Gasdermin D
细胞焦亡发生时，Gasdermin D（GSDMD，53KD）被切割，产生30KD左右的片段，可以购买GSDMD一抗，用Western blot（WB）来验证。
2.Caspase-1、Caspase-4
细胞焦亡发生时，caspase-1和caspase-4被激活，可以通过检测caspase-1和caspase-4的活性来验证。
Abbkine Caspase-1 活性分析试剂盒(比色法)（货号：
#KTA3020）和Caspase-4 活性分析试剂盒(比色法)（货号：
#KTA3023）
3. IL-1β、IL-18
细胞焦亡发生时，IL-1β和IL-18会释放到细胞中，可以通过ELISA方法检测细胞上清中的IL-1β和IL-18的含量来验证。
EliKine™Human IL-1βELISA Kit（货号：#KET6013）和EliKine™Human IL-18 ELISA Kit（#KET6023）
同时，可以用扫描电镜观察细胞形态（细胞膜破裂、细胞膨大&变形、细胞器变形）。
细胞凋亡中Caspase-3活性的检测
细胞凋亡中Caspase-3活性的检测关键词：细胞凋亡活性检测执行分子 2012-09-27 18:04 来源：互联网点击次数：5249Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。
Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。
但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
方法：收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→H RP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。
结果如下图2 荧光分光光度计分析原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。
根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。
在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。
根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?制备细胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC （caspase-3四肽荧光底物）?37°C反应1h?荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。
活细胞死细胞的染色方法
使用方法：
使用方法： 1、 染色工作液的配制：
根据样品数按下列比例配制染色工作液。 取 1ml 试剂 C 加 9ml 无菌去离子水稀释，混匀即成 1X 染色缓冲液。每 10ml 1X 染色缓 冲液中加入 10ul 染色液 A 和 3-10ul 染色液 B，充分混匀，即成染色工作液。 2、 收集样本细胞，细胞数量在 1X106 个以内。 3、 用 PBS 洗涤细胞两次。 4、 用 200ul 染色工作液将细胞重悬。 5、 4℃避光孵育 15-30 分钟。 6、 用 PBS 洗涤细胞。 7、 用适量 PBS 重悬细胞。 8、 用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。染料-DNA 复合物的最大激发 490±10nm，最大发 射波长分别为 515nm 和 617nm。
产品号 BB-4101 BB-4102 BB-4201 BB-4202 BB-4203 BB-4204 BB-4131 BB-4133 BB-4122
产品 细胞周期检测试剂盒 JC-1 线粒体膜电位试剂盒 Caspase 3 活性检测试剂盒 Caspase 8 活性检测试剂盒 Caspase 9 活性检测试剂盒 Caspase 10 活性检测试剂盒 细胞凋亡形态学检测试剂盒 Rhodamine 123 染色试剂盒 AO/EB 双染试剂盒
产品简介： BestBio 贝博活细胞/死细胞染色试剂盒是采用 Calcein-AM/PI 双染细胞的方法染色活细
胞和死细胞。 Calcein-AM 是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM 由于在
Calcein 的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶 会将其水解为 Calcein 留在细胞内，发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如 BCECF-AM 和 Carboxy-fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM 是最适合作为荧光探针去染活细胞的， 因为它的细胞毒性很低。Calcein 的激发和发射波长分别为 490 nm 和 515 nm。Calcein -AM 仅对活细胞染色。
乳腺癌中caspase-3和caspase-9的表达及其意义
乳腺癌中caspase-3和caspase-9的表达及其意义王进京;孙保存【摘要】目的探讨caspase-3和caspase-9在乳腺癌发生、发展中的作用.方法采用免疫组化SP法和原位杂交(ISH)技术检测80例乳腺浸润性导管癌(invasive duct carcinoma,IDC)、23例导管内癌(ductal carcinoma in situ,DCIS)、37例增生症和9例癌旁组织中caspase-3、caspase-9 mRNA和蛋白的表达.结果caspase-3 mRNA在各组中的表达差异无统计学意义(P>0.05).caspase-3蛋白在IDC、DCIS、增生症中的表达均高于癌旁组织(P<0.05),在IDC、DCIS中的表达均高于增生症组(P<0.05).caspase-9 mRNA和蛋白在IDC、DCIS、增生症中的表达均低于癌旁组织(P<0.05),IDC、DCIS中的表达均低于增生症组(P<0.05).caspase-3、caspase-9蛋白在IDC与DCIS中的表达差异均无统计学意义(P>0.05).caspase-3蛋白与mRNA在DCIS和增生症中的表达呈正相关(r=0.429,r=0.563,P<0.05).caspase-9 mRNA与蛋白在各组中的表达均存在相关性(r=0.94,r=0.414,r=0.391,r=0.827,P<0.05).caspase-3、caspase-9 mRNA和蛋白的表达与肿瘤大小等临床病理参数无相关性(P>0.05).结论 caspase-3和caspase-9均参与乳腺导管癌的发生、发展.caspase-9蛋白表达降低,而caspase-3表达增高在乳腺癌的发生、发展过程中较常见;caspase-9表达降低可能与乳腺组织恶性转化有关.【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2012(028)004【总页数】5页(P378-381,389)【关键词】乳腺肿瘤;凋亡;caspase-3;caspase-9【作者】王进京;孙保存【作者单位】天津医科大学病理学教研室,天津,300070;天津医科大学病理学教研室,天津,300070【正文语种】中文【中图分类】R737.9细胞凋亡异常在多种恶性肿瘤的发生、发展中占有十分重要的地位。
比色法检测Caspase-3相对活性
材料和方法11试剂caspase3底物acdevdpna购自biomol公司4羟乙基哌嗪乙磺酸hepes33胆酰胺基丙基二甲氨基丙磺酸盐chaps乙二胺四乙酸edta二硫苏糖醇dtt聚乙二醇辛基苯基醚tritonx100二甲基亚砜dmso购自amresco公司达氏修正依氏dmem高糖培养基购自gibco公司胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司bradford蛋白定量试剂盒购自南京建成生物工程研究所氯化钠nacl甘油glycerol碳酸氢钠nahco等试剂均购自天津市化学试剂三厂
葛根素对HeLa细胞生长的抑制作用机制
1. 3. 4 流式细胞仪检测细胞周期的变化 取对照组和葛根素 （ 终浓度为 220 和 440 μg / ml） 处理 48 h 后的 HeLa 细胞单细胞悬 液（ 1 × 106 / ml） 1 ml，HeLa 细胞上清倒入标记试管中，培养瓶中 加 0. 25 % 胰酶消化，消化的 HeLa 细胞加入对应的试管中，离心 1 500 r / min、5 min，去 上 清。0. 01 mol / L pH7. 2 PBS 洗 2 次， 1 500 r / min、5 min。将 70 % 乙醇缓慢滴入试管中，边滴边摇动 试管，使 HeLa 细胞分散、固定，置 4 ℃ 备检。将上述固定的 HeLa 细胞离心去上清，0. 01 mol / L pH7. 2 PBS 洗 2 次，1 500 r / min、 5 min。取 200 μl 单细胞样品（ 1 × 106 / ml） ，加200 μl RNase 溶液 （ 10 μg / ml） ，置 37 ℃ 水浴摇床 30 min。将细胞过滤，去除聚积 成团细胞，加入异硫氰酸荧光素（ Annexin V-FITC） 5 μl 和碘化丙 啶（ PI） 液 10 μl，混匀，室温避光染色 15 min。PBS 洗 2 次，去除 多余染料，流式细胞仪检测（ 激发波长 488 nm） 。
利奈唑胺对人血小板细胞的凋亡作用研究_王天琳
利奈唑胺对人血小板细胞的凋亡作用研究王天琳1，郭代红1，柴 栋1，张 波2，王 睿3（1.解放军总医院药品保障中心，北京 100853；2.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，辽宁沈阳 110016；3.解放军总医院转化医学中心，北京 100853）[摘要] 目的：研究利奈唑胺对人血小板的凋亡作用。
方法：用两步离心法制备人富血小板血浆并纯化血小板，用酶联免疫吸附法检测乳酸脱氢酶（LDH）评价血小板损伤程度，用Annexin V法检测磷酯酰丝氨酸外翻，用比色法检测Caspase-3活性。
结果：与空白对照组相比，利奈唑胺剂给药4 h可剂量依赖性引起磷酯酰丝氨酸外翻增加，Caspase-3活性增加。
150 μg·mL-1利奈唑胺给药4 h可引起血小板LDH释放增加。
结论：利奈唑胺可引起人血小板凋亡。
[关键词] 利奈唑胺；血小板；凋亡；乳酸脱氢酶；Caspase-3[中图分类号] R977.1+5 [文献标识码] A [文章编号] 1672 – 8157(2015)04 – 0209 – 03Effect of linezolid on the apoptosis of human platelet in vitroWANG Tian-lin1, GUO Dai-hong1, CHAI Dong1, ZHANG Bo2, WANG Rui3(1. Department of Pharmaceutical Care, PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2. School of Life Sciences and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China;3. Translational Medical Center, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)[ABSTRACT] Objective: To study the effect of linezolid on the apoptosis of human platelet. Methods: Two-step centrifugation was used for platelet enrichment and purifi cation. LDH concentration in the supernatant was determined by ELISA, phosphatidylserine (PS) exposure by Annexin V-binding, and the activation of Caspase-3 by colorimetry. Results: Four hours exposure to linezolid triggered Annexin V-binding, activated Caspase-3 in dose dependent manner. Linezolid 150 μg·mL-1·4 h-1 can stimulate the release of LDH. Conclusion: Linezolid can induce the apoptosis of human platelet.[KEY WORDS] Linezolid; Platelet; Apoptosis; Lactic dehydrogenase; Caspase-3利奈唑胺（linezolid）是第一个应用于临床的新型唑烷酮类抗生素[1]。
Caspase1活性检测试剂盒比色法
本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过 100µL 的分光光度检测杯检测时，除标准曲线外可以 检测 20 个样品。
试剂准备 1. 裂解液融化后混匀并置于冰浴上备用。 2. 检测缓冲液融化后混匀并置于冰浴上备用。
气泡。随后再加入 10µL Ac-YVAD-pNA(2mM)。
3. 加入 Ac-YVAD-pNA (2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37°C 孵育 60-120min。发
ห้องสมุดไป่ตู้
现颜色变化比较明显时即可测定 A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可
以孵育过夜。
4. 样品的 A405 减去空白对照的 A405，即为样品中 caspase 1 催化产生的 pNA 产生的吸光度
二. 样品的收集： 1. 对于悬浮细胞：将没有诱导凋亡的对照品和诱导凋亡的样品，在 4°C 下，600g 离心 5min 后， 收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS 洗涤一次。同前吸尽上清后，2×106 细胞加入 100µL 裂解液（建议加入 1%蛋白酶抑制剂（CC088）），重悬沉淀，冰浴裂解 15~20min。 下接步骤 4。 2. 对于贴壁细胞：将没有诱导凋亡的对照品和诱导凋亡的样品，吸取细胞培养液，备用。用胰 酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。在 4°C 下，600g 离心 5min 后，收集细胞，
1
小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS 洗涤一次。同前吸尽上清后，2×106 细胞加
入 100µL 裂解液（建议加入 1%蛋白酶抑制剂（CC088）），重悬沉淀，冰浴裂解 15~20min。
Caspase3_测定
Caspase3 测定caspase-3的检测方法：(1)免疫细胞化学检测caspase-3蛋白的表达，用悬浮的细胞；(2)western blot 理想结果：caspase-3有32ＫＤ的条带外，还出现了20ＫＤ和10ＫＤ大小的条带，表明caspase- 3被活化；(3)RT-PCR检测mRNA的表达，用凝胶成像分析系统处理，可以半定量。
Caspases可以在哺乳动物细胞内启动凋亡，caspase3比色蛋白酶试剂盒通过简单、方便的测定caspases活性的方法这种方法通过识别序列DEVD，这种方法基于用分光光度计测定从标记底物DEVD-pNA分开的发色团（pNA) 此时游离的pNA的发射光谱可用分光光度计或酶标仪或微量滴定板在400或405nm 检测,通过样本和背景的吸光度比较来测定caspase3活性的增加，进而推知Caspases的活性。
原理：在Caspase的底物多肽(如Caspase-3的底物为DEVD)上标记pNA (p-nitroanilide, 对硝基苯胺).当活化的Caspase剪切标记的底物多肽后, pNA被释放出来,此时游离的pNA的发射光谱可用分光光度计或酶标仪在400或405nm 检测,进而推知Caspases的活性.一．实验前准备：消毒的EP管、枪头、三蒸水、冰、水浴箱、实验组及对照组心肌组织、超速低温离心机、酶标仪、721分光光度计二．活性测定操作步骤（一）每组试剂组成Samples（lysis buffer）2×Reaction buffer DEVD-PNA 总Sample well （标本组）30ul 65ul 5ul 100ul Sample control（背景组）30ul（lysis buffer）70ul 0 100ulSample well（样本组）Sample control（背景组）3小时组N3 30ul样本30ul样本65ul Reaction buffer 70ul Reaction buffer5ul DEVD-PNAC3 30ul样本＋65ul Reaction buffer5ul IETD-PNA 30ul样本＋70ul Reaction buffer R3 30ul样＋65ul Reaction buffer5ul LEHD-PNA 30ul样本＋70ul Reaction buffer6小时组N6 30ul对照样本30ul样本65ul Reaction buffer 70ul Reaction buffer5ul DEVD-PNAC6 30ul样本＋65ul Reaction buffer5ul IETD-PNA 30ul样本＋70ul Reaction buffer R6 30ul样本＋65ul Reaction buffer5ul LEHD-PNA 30ul样本＋70ul Reaction buffer 共需2×Reaction buffer810 ul，配制2×830ul以防不够，用前加入8.3ul DTT活性表示为＝样本OD1－背景OD1（实验组）/样本OD2－背景OD2（对照组）（二）．操作步骤——酶标仪 1.取标记好的EP管（已消毒）2.取已冻好的冰块加点水，置插EP管的座于冰水中3. 放转子，打开高速离心机电源，时间、速度都在零位置先开机将至4摄氏度注意要配平套管A、B、C、D注意：1.速度、时间均为0时，才能开电源2.设置温度降温10min（夏天时间可以稍微长一些）3.开电源前先把转子放入4.定时－启动－慢慢调速10000转（显示为1000转）未配平－停机－重新配平－再开机5.停机灯亮，开盖（复位：速度、时间均为0)1．从低温冰箱中取出用锡铂纸包着的组织（已称重标记好的），取2-3块（30mg/块），放在EP管中，一直浸在冰水中2．锡铂纸剥去，组织直接置于EP管中，加裂解buffer（溶后4摄氏度保存）约700ul 冰上EP管中，用小弯剪将心脏组织剪碎，越碎越好组织、裂解buffer比例：1：10冰上操作3．开匀浆机取几块冰块于小烧杯中，接自来水成冰水液将EP管置于盛有冰水的小烧杯中，固定于匀浆机上先做对照组将转头插于组织液面下，打开电源，逐渐调大速度至max，上下搅动，直至浑浊，基本无小的组织块为止调小速度至零，关电源，取出转头，EP管放回冰水底座用蒸馏水冲洗转头，液冲至废烧杯中依次以同样方法将样本组进行匀浆注意：放空转，慢慢加速，别转别上下移动轴4．匀浆后置于离心机内先设时间10min “起动”；缓慢增大离心速度至1000×10r/min；缓慢减小离心速度，降至30×10r/min时，“停机”灯亮，即可取出注配平：套管A、B、C、D配平5．取Reaction buffer 6ml，用前加入60ul DTT（稀释100倍）吸取上清至小EP管依次加Reaction buffer、上清、底物至ELISA板，加底物时，每加一次换一个枪头（因为要混匀）注：底物每取完一次都要盖盖，避光；加完底物后，混匀。
流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 - Active Caspase-3 检测细胞凋亡
A c t i v e C a s p a s e-3检测细胞凋亡实验原理Caspase-3 在早期凋亡细胞中就已经活化，是凋亡程序中的重要的Caspase 酶。
凋亡细胞中，32kD 的原酶(Pro-caspase-3)裂解为一个17-21kD 亚单位和一个12kD 亚单位，两个亚单位形成二聚体，即为活化的Caspase-3，活化的Caspase-3 又水解、活化其它Caspase 酶和多种胞浆内成分（如D4-GDI，Bcl-2）和核内成分（如PARP）。
PharMingen 多克隆或单克隆Caspase-3 抗体可以识别Caspase-3 活化形式，它特异性识别由无活性的Pro-Caspase-3 活化水解后的暴露的断裂端，C92 单克隆抗体与Pro-Caspase-3 无交叉反应。
Active Caspase-3 Apoptosis Kit 特为流式细胞术分析凋亡细胞的Caspase-3 而设计。
包括荧光标记多克隆兔抗Active-Caspase-3 抗体（Anti-Active Caspase-3 FITC 或Anti-Active Caspase-3 PE）、固定/破膜剂、破膜/冲洗缓冲液。
实验步骤1Camptothecin 诱导细胞凋亡在DNA 合成中，需要拓扑异构酶I。
Camptothecin 是拓扑异构酶I 的抑制剂，它在体外依剂量不同而影响凋亡的发生。
在此，Camptothecin 做为常规的凋亡诱导方案，辅助细胞凋亡分析。
凋亡诱导试验用品1.用DMSO 制备1.0mM 的Camptothecin 储备液2.Jurkat T 细胞（ATCC TIB-152）凋亡诱导试验步骤1.1⨯106cells/ml 增殖的Jurkat T 细胞加入Camptothecin，Camptothecin 终浓度为4-6μM。
2.细胞37︒C 孵育4 小时。
2Active Caspase-3 染色步骤试验用品：1.12⨯75mm 的Falcon 管2.PBS 缓冲液3.凋亡检测试剂盒染色步骤：。
碧云天Casapase 3活性检测试剂盒说明书
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology订货热线：400-168-3301或800-8283301订货e-mail：******************技术咨询：*****************碧云天网站微信公众号网址：Caspase 3活性检测试剂盒产品编号产品名称包装C1115 Caspase 3活性检测试剂盒20次产品简介：Caspase 3活性检测试剂盒(Caspase 3 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中caspase 3酶活性或纯化的caspase 3酶活性的试剂盒。
Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。
Caspase 3也称CPP32、Yama或apopain，有时被写作caspase-3或caspase 3，属于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3 subfamily)，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。
Caspase 3是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。
Caspase 3可以剪切procaspase 2、6、7和9，并可以直接特异性剪切许多caspase底物，包括PARP (poly(ADP-ribose) polymerase)，ICAD (Inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease)，gelsolin和fodrin等。
这些由caspase 3介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。
另外，caspase 3在细胞核凋亡过程中也起到了关键作用，包括染色质固缩(chromatin condensation)，DNA片段化(DNA fragmentation)等。
同时caspase 3对细胞起泡(cell blebbing)也起到关键作用。
细胞粘附的检测方法
包被： 1、 96 孔板每孔加入 100ul 包被液。 2、 将培养板置 2-8°C 过夜。 3、 移除包被液，用洗涤液洗涤 2-3 次。
细胞接种： 1、 待测定细胞处理好后，用胰酶消化，PBS 洗涤，然后用相应培养基重悬，制成细胞
悬液。 2、 按 5×104 细胞/孔接种 96 孔板，建议设 3-5 个复孔。同时设立对照组，即孵育后不
体损失导致试剂量不够用。 ● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。离心力在不损失细胞的前提下尽可能小，重悬
细胞是动作要轻柔，避免多次反复的激烈吹打。不用涡旋振荡器。 ● 染色培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。一般情况下，白细胞较难染色，
因此需要较长的培养时间。培养时间一般为 1- 4 小时，但在培养 30 分钟左右即可取出肉眼观察 染色程度 (根据细胞种类而定，需要摸索一下条件)。当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞的最小接 种量至少为 1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不 低于 2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。如果要使用 24 孔板或 6 孔板实验，请先计算每孔相应的接 种量，并按照每孔培养基总体积的 10%加入染色液 B。 ● 有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加染色液 B 试剂时，建议斜
产品说明书
细胞粘附检测试剂盒
货号：BB-48120
V2.16
试剂盒储存条件： 2-8℃保存。
开盖后组份按要求条件保存。 Nhomakorabea试剂盒组成：
产品组成
BB-48120-1
BB-48120-2
规格
100 T
250 T
试剂 A：包被液 A
Cell-BasedAssay（细胞活性、毒性和凋亡）
•定量计算某种药物或某 荧光法: 刃天青
种因素对细胞的毒性或 促增殖的作用
生物发光法：ATP法
•作为其他实验的对照
同位素标记：H3Thymidine标记
高灵敏度，高通量，操 作简单
高灵敏度，高通量，操 作时间短
灵敏度高，但是操作复 杂，放射性方法，成本 高
MTT操作步骤
前期培养
加加DDyyeeSSooluluttioionn
Vijaya Ramachandran, Thiruvengadam Arumugam, Huamin Wang, and Craig D. Logsdon Cancer Res., Oct 2008; 68: 7811 - 7818.
5.NADPH Oxidase-dependent Signaling Involved In Endothelial Cell Survival And Proliferation: Role Of Nox2 And Nox4
出？ • 需要叠加其他实验？
如何选择适合的检测方法
• 现有的仪器 • 通量和灵敏度 • 操作简便度和操作时间的要求
对实验效率的要求-高通量药物筛选
实验目的与常用方法
实验目的
方法
•初步观察细胞的生存状 态，镜下计算活细胞和死 台盼蓝染料排斥法 细胞比例
特点
镜下观察计数细胞
比色法：MTT,MTS 中低通量，操作简单
Lan H. Ly, Xiao-Yan Zhao, Leah Holloway, and David Feldman.Endocrinology, May 1999; 140: 2071.
4.Anterior Gradient 2 Is Expressed and Secreted during the Development of Pancreatic Cancer and Promotes Cancer Cell Survival
Western blot检测caspase3 的步骤及原理
蛋白免疫印迹检测caspase-3的活化原理及步骤
【原理】
蛋白免疫印迹技术是以某种抗体作为探针，使之附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原部位发生特异性反应，从而对复杂的混合物中的某些特定蛋白进行鉴别和定量。
基本过程：蛋白质样品先经SDS-PAGE分离，后通过电转移将凝胶上的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上，经封闭后再用抗待检蛋白的特异性抗体作为探针与之结合，经洗涤后，将滤膜与辣根过氧化物酶偶联的抗IgG二抗结合。
辣根过氧化物酶可催化鲁米诺氧化并发光，试剂中的增强剂能使发光增强1000倍。
当加入免疫印迹化学发光剂后，鲁米诺发生氧化发光，并发射波长为428nm的光，此光可经X光胶片感光记录下来。
以此确定抗原-抗体-抗抗体复合物在滤膜上的位置及丰度。
【步骤】。
石花菜提取物对宫颈癌细胞凋亡及Caspase-3活性的影响
ｄａ ａｅ Ｊ ．Ｔａ ｓｌｎａｏ ，１７ ， ８ １ ： ７— ０ ｒｉ ｇ ［ ］ ｒｎｐａｔｔ ｎ ９ ９ ２ （ ） ４ ５ ． ｎ ｉ ［ ］ Ｔ Ａ Ａ Ｍ，ＭＩＡＫ Ａ Ａ ．Ｍａ ｔｎ ｃ ｆ ｅｆ ｏ ５ ＡＮ Ｋ Ｙ ＥＹ， Ｓ ＮＯ Ｋ ｉ ｅａ ｅｏ ｌ—ｔｌ ｎ ｎ ｓ － ｅａｅ ｙａｏｔｔ ｅｌ ｌａａｃ ［ ］ ｒｎ ｉｓｉ ２ ０ ，１ ： ｒ ｅｂ ｐｐｏｉ ｃｌ ｃｅ ｎ ｅ Ｊ ．ＦｏｔＢｏｅ， ０ ８ ３ ｎ ｃ ｒ
探讨石花 菜提取物 对宫颈癌 Ｈ Ｌ 细胞凋亡及 Ｃｓａ 一 ｅａ ａ ｓ ３活性的影响。方法 不同浓度 石 ｐｅ
石花菜提取 物以 时间及 剂量依 赖性 的方式抑制 Ｈ Ｌ ｅ ａ细胞的 生长增殖 ， 降低 细胞 活性 。 石花 菜 乙酸 乙酯提取物可抑制宫颈癌 Ｈ Ｌ 细胞 生长增 ｅａ
参 考 文 献
『 ］ Ｇ Ｅ Ｃ Ｒ ＲＯ １ ＡＮ Ｍ Ｇ． Ａ Ｔ Ｎ Ｇ，ＧＲ Ｎ Ｋ ，ｅ ａ．Ｌｃｌ ｅ ｗ— ＩＩ Ｓ Ｙ Ｔ ｔ １ ｏａｉ ｄｌ ｚ ｏ
ｄ ｓ ａ ｉ ｔ ｅ ａ ｙ ｆｒｆｌｉｕ ａ ｙ ｈ ｍａ：ｈ ｓｏ ｙ ｌ ｉａ ｅ ｕ ｔ ， ｏ ｅ ｒ ｄ ｏ ｈ ｒ ｐ ｏ ｌ ｌ ｒ ｍｐ ｏ ｏ ｃ ｌ ｉ ｒ ，ｃ ｉ ｃ ｒ ｓ ｌ ｔ ｎ ｌ ｓ
１ １ 细胞与试剂 ．
广东医学 ２ １ 年 ９月 第 ３ 卷第 １ 期 Ｇ ａ ｇ ｏ ｇ ｄｃｌ ｏ ｒ ￣ Ｓｐ ２ １ ， ｏ ３ ， ｏ ８ ０１ ２ ８ ｕ ｎ ｄ ｎ Ｍｅｉ ｕｎ ａＪ ｅ． ０ １ Ｖ １ ２ Ｎ ．１ ．
・
２８ ・ ３９
１４ Ｈ ｅｈｔ 测 细胞 凋亡 细胞 爬 片后 ， 别含 不 ． ｏｃｓ检 分 同浓 度石花菜 乙酸 乙酯 提取 物 （ 、． 、 、０ｍ ／ Ｌ ０ ２５ ５ １ ｓ ｍ ） 的 Ｒ Ｍ ６０培养 基 （ ２ ＰＩ ４ １ 含 ％小牛血清 ） 培养 ２ ， ， ４ｈ后 ４ 多聚甲醛 固定 ，． ％Ｔｔ ％ ０２ ｉ ｎＸ一１０渗透 １ ｉ， ｏ ｏ ０ ０ｍ ｎ Ｈ ． ｅｈｔ３５ 染 色液 ， ｃｓ ２８ ３ 染色 ５ｍ ｍ后 ，Ｂ 洗 ３次后 ，０ ｉ ＰＳ ６％ 缓 冲甘油封 片 ， 光显微镜 下观察并拍 照。 荧
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Caspase 3 活性检测试剂盒(比色法)
产品简介：
Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)家族在介导细胞凋亡过程的起着极其重要的作用，其成员包括Caspase1~11等,均属于蛋白酶家族。
Caspase 3又称CPP32、Yama、apopain、Caspase-3，属于CED-3亚家族，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。
Caspase 3 可以剪切procaspase 2、6、7和9，可直接特异性剪切许多Caspase底物（如PARP、ICAD等），并在细胞核凋亡过程中起到重要作用。
Jimei Caspase 3活性检测试剂盒（比色法）(Caspase 3 Colorimetric A ssay Kit)的检测原理是利用Caspase 3催化底物acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide(Ac-DEVD-pNA)产生黄色的游离硝基笨胺pNA (p-nitroaniline)，通过测定分光光度比色法测定pNA在400~410nm处吸光值，从而间接获得Caspase 3的活性。
自备材料：
1、水浴锅或恒温箱
2、96孔板
3、酶标仪或分光光度
操作步骤（仅供参考）：
1、制备标准曲线：
①按照Caspase Lysis buffer：Assay buffer=1：9的比例配制适量的标准品稀释液。
②用标准品稀释液稀释pNA(10mM)，使pNA分别达到200μM、100μM、50
μM、25μM、12.5μM、6.25μM，另外设置一般不加pNA仅含标准品稀释液作为
零管，把以上系列浓度物质作为标准品。
③取pNA浓度分别为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、
0的标准品各100μl加入至96孔板或取适量体积加入至容量不超过100μl的比色
杯，测定405nm处吸光值即A405。
④用每一个标准品的A405 减去不含pNA的空白对照的A405，计算出实际的吸光
值。
以每个浓度的标准品A405 为x轴，以对应的pNA浓度为y轴，用Excel制作
pNA浓度对A405 值的标准曲线。
2、样品裂解：
①悬浮细胞：取实验样品和对照样品，1000g 4。
C离心5min收集细胞，小心吸除
上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次，再次小心吸除上清。
按每
2~10×106细胞加入100μl Caspase Lysis buffer的比例加入Caspase Lysis buffer，重
悬细胞沉淀，冰浴裂解15min。
②贴壁细胞：弃细胞培养液，用胰蛋白酶消化贴壁细胞，收集至细胞培养液，1000g
4。
C离心5min，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次，再
次小心吸除上清。
按照每2~10×106细胞加入100μl Caspase Lysis buffer的比例加
入Caspase Lysis buffer，重悬细胞沉淀，冰浴裂解15min。
③组织样品：按每3~10mg组织加入100μl Caspase Lysis buffer的比例加入
Caspase Lysis buffer，冰浴上用玻璃匀浆器匀浆并转移至1.5ml离心管中，冰浴裂
解5~10 min。
④4。
C 12000g离心10~15 min，取上清至新的1.5ml离心管。
立即测定Caspase 3
的酶活性或者-70。
C保存样品。
⑤蛋白定量：由于Caspase Lysis buffer含还原剂不宜采用BCA法，可采用
Bradford法测定蛋白浓度。
以蛋白浓度达到1~3mg/ml为佳，否则应增加细胞或组
织的量。
3、样品检测：
①按照下表设置96孔板反应体系，溶液应按照顺序依次加入，即Assay buffer
→待测样品→Ac-DEVD-pNA(2mM)。
同时应设置不加待测样品的反应孔作为空
白对照。
酶活性过低或过高，可增加或减少待测样品的用量，大多数情况下，每
C孵育60
进行A405 检测；如果颜色变化不明显，可适当延长孵育时间甚至过夜。
③待测样品A405 分别减去空白对照A405 即为样品Caspase 3水解底物产生的
pNA吸光值，根据标准曲线即可获得酶的含量。
④用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度（由于裂解液中含有较高浓度的
DTT，不适合采用BCA法进行蛋白浓度测定），进而计算出一个样品单位重量蛋
白中所含的Caspase 3的酶活力单位即Caspase 3酶活力单位/mg protein.
计算结果：
①Caspase 3酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0
nmol of the colorimetric substrate Ac-DEVD-pNA per hour at 37。
C under saturated substrate concentrations,即当底物饱和时，在37。
C一个小时内可以剪切1nmol Ac-DEVD-pNA产生1nmol pNA的Caspase 3的酶量。
根据pNA标准曲线和样品A405 值，可计算出Caspase 3酶活力单位。
说明：底物的起始浓度为0.2mM，此时底物是饱和的，对于许多样品而言在37。
C孵育2个小时以内底物都是饱和的；对于样品中Caspase 3酶活力特别高的情况，须用Caspase Lysis buffer适当稀释样品后再进行测定。
②Caspase 3酶活性的另外一种表示方法是Caspase活性增加的百分比即实验处
理组A405/实验对照组A405×100%，简单而可靠，可粗略的反应酶活性情况。
注意事项：
1、建议每次测定时都做标准曲线，以使标准更准确，另外标准品需避免反复冻融。
2、如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的
最小检测体积，尽量采用100μl体积以内的比色环。
3、所测样品的值高于标准曲线的上限，应用裂解液稀释样品后重新测定。
4、样品蛋白有效含量过低或Caspase激活水平过低都会导致实际测得的A405过低，
应注意使蛋白浓度尽量达到1~3μg/ml，调整诱导凋亡的时间和条件。
5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12个月有效。
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