CRISPR英雄谱
基因编辑技术CRISPR
基因编辑技术CRISPR基因编辑技术CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种革命性的基因工程技术，它可以精准地修改生物体的基因组，为科学研究、医学治疗和农业发展带来了巨大的希望和机遇。
CRISPR技术的出现改变了基因编辑领域的格局，被誉为“基因剪刀”，具有高效、精准、便捷等特点，受到广泛关注和应用。
一、CRISPR技术原理CRISPR技术是受到细菌天然免疫系统的启发而发展起来的一种基因编辑技术。
细菌通过CRISPR/Cas系统来抵御病毒入侵，其中CRISPR是一段DNA序列，记录了细菌曾经感染过的病毒基因信息，Cas蛋白则能识别并切割这些病毒基因。
科学家们发现，通过改造CRISPR/Cas系统，可以实现对生物体基因组的精准编辑。
CRISPR技术的基本原理是利用一种叫做“引导RNA”的分子，它能够将CRISPR/Cas系统导向到特定的基因组位置，然后Cas蛋白就会在这个位置上进行切割或编辑操作。
通过设计合适的引导RNA序列，科学家可以实现对基因组的精准编辑，包括基因敲除、基因插入、基因修饰等操作。
二、CRISPR技术在科学研究中的应用CRISPR技术在科学研究领域发挥着重要作用，它为科学家们提供了一种高效、精准的基因编辑工具，帮助他们研究基因功能、疾病机制等重要科学问题。
通过CRISPR技术，科学家们可以快速生成基因敲除或基因突变的细胞系或动物模型，从而揭示基因在生物体内的功能和作用机制。
此外，CRISPR技术还被广泛应用于基因组筛选、基因组编辑、疾病模型构建等方面。
科学家们利用CRISPR技术可以精准地编辑细胞的基因组，研究基因与疾病之间的关系，为疾病的治疗和预防提供新的思路和方法。
三、CRISPR技术在医学治疗中的应用CRISPR技术在医学治疗领域具有巨大的潜力，可以用于治疗各种遗传性疾病、癌症、传染病等疾病。
CRISPR技术和治疗多种疾病
CRISPR技术和治疗多种疾病CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）技术，又称为基因编辑技术，是一种利用程序化的DNA断裂修复机制，直接在基因序列中切割、删除、插入或替换DNA片段的技术。
自从2012年CRISPR的发现以来，人们对这种基因编辑技术持续关注。
CRISPR技术被广泛看作是生命科学领域中最具有变革性和创新性的技术之一，且已经被应用于治疗多种疾病，包括癌症、遗传病和传染病等。
CRISPR技术是一种新型、快速且高效的基因编辑技术，其成功运用的前提是对目标基因序列有足够的了解。
CRISPR技术由分子生物学家Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier等人发明，其利用CRISPR-Cas9酶作为工具进行基因编辑。
CRISPR-Cas9技术将Cas9酶带入人体细胞中，利用其识别DNA特异序列和特定结构域的能力，将Cas9直接引入细胞核中，必要时会产生DNA片段的间断，使得基因序列在缺乏外源介导的生化反应条件下进行改变和修复。
以往的基因编辑方法，如Zinc Finger Nuclease（ZFN）和Transcription Activator-Like Effector Nucleases（TALENs）等，虽然已经获得了一定的成功，但是它们仍然存在许多的限制和通用性问题。
CRISPR技术的出现解决了这些问题，使得基因编辑技术在生命科学领域取得了更大的进展。
CRISPR技术被广泛应用于治疗各种疾病，特别是癌症治疗。
现代医学将基因编辑技术应用于癌症治疗中，无论是治疗胰腺癌、肺癌还是其他各种类型的癌症，CRISPR技术都被证明是非常有效的处理方式之一。
CRISPR技术可针对癌细胞的突变基因进行编辑，以减小癌症的风险和细胞增殖率。
同时，CRISPR技术还被应用于治疗遗传性疾病。
基因编辑技术CRISPR
基因编辑技术CRISPR在21世纪的科学舞台上，一个名为CRISPR的基因编辑技术如同一颗耀眼的新星迅速升起，它不仅为生物学研究带来了革命性的突破，更在医学、农业等领域展现出广泛的应用潜力。
本文旨在深入探讨CRISPR技术的原理、发展及其对未来的影响。
CRISPR技术的基本原理CRISPR，全称为“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”，即规律成簇的短回文重复序列，是一种源自细菌的自然防御系统。
科学家们发现，通过改造这一系统，可以精确地定位并编辑生物体内的特定基因序列。
CRISPR系统的核心是指导RNA（gRNA）和Cas蛋白。
gRNA能够识别目标DNA序列并与之结合，而Cas蛋白则负责切割DNA。
一旦目标DNA被切割，细胞会试图修复这一损伤，但在修复过程中可能会引入错误，从而实现对基因的编辑。
CRISPR技术的发展与应用自2012年首次应用于哺乳动物细胞以来，CRISPR技术经历了飞速的发展。
它不仅简化了基因编辑的流程，降低了成本，还提高了编辑的准确性和效率。
在医学领域，CRISPR技术被用于研究遗传疾病的治疗，如通过编辑致病基因来治疗某些类型的遗传性失明和血液疾病。
此外，它还在癌症治疗、免疫疗法等方面展现出巨大潜力。
在农业方面，通过CRISPR技术改良作物，可以提高作物的抗病性和产量，同时减少农药的使用，对环境保护也大有裨益。
CRISPR技术的挑战与未来尽管CRISPR技术充满希望，但它也面临着伦理和安全上的挑战。
如何确保技术的安全性、避免滥用以及如何处理由此引发的社会伦理问题，都是亟待解决的难题。
未来，随着研究的深入和技术的完善，CRISPR有望在更多领域发挥其独特的优势。
同时，全球科学家和政策制定者需要共同努力，建立相应的规范和监管机制，确保这项技术的健康和可持续发展。
结语CRISPR技术作为一种革命性的基因编辑工具，正引领着生命科学进入一个全新的时代。
CRISPR基因编辑技术教程
01
畜禽品种改良
通过CRISPR技术改良畜禽的生长速度 、肉质品质、繁殖性能等性状，培育优 良品种。
02
03
转基因育种
将CRISPR技术与转基因技术相结合， 实现基因的精确编辑和定向转移，加 速育种进程。
04
CRISPR技术挑战与问题
脱靶效应及安全性问题
脱靶效应
CRISPR技术在基因编辑过程中，有时会 出现非特异性切割，导致基因组其他位 置的突变，即脱靶效应。这可能会引发 不可预测的基因功能变化，甚至产生安 全隐患。
通过测序等方法验证表达载体的 正确性和完整性。
转化细胞系或组织
准备细胞系或组织
选择需要编辑的细胞系或组织，并进行适当的预 处理。
转化方法选择
根据细胞类型和组织特性选择合适的转化方法， 如脂质体转染、电穿孔等。
转化效率检测
检测转化效率，确保足够数量的细胞被成功转化 。
验证基因编辑效果
DNA水平验证
通过改进Cas9蛋白的特异性，降低脱靶率，提高基因编辑 的精确度。
开发新型CRISPR系统
探索除CRISPR-Cas9外的其他CRISPR系统，如CRISPRCas12a、CRISPR-Cas13等，以提高编辑效率和特异性。
结合其他基因编辑技术
将CRISPR技术与其他基因编辑技术（如碱基编辑器、先导 编辑器）相结合，实现更高效、更精确的基因编辑。
提取转化后的细胞DNA，通过 PCR、测序等方法检测目标基
因是否被成功编辑。
RNA水平验证
提取转化后的细胞RNA，通过 RT-PCR等方法检测目标基因的 表达水平是否发生变化。
蛋白质水平验证
提取转化后的细胞蛋白质，通 过Western blot等方法检测目 标蛋白质的表达水平是否发生 变化。
crispr原理解析经典实用
Natronobacterium gregoryi Argonaute （NgAgo）是一种DNA导向的可用于人类细胞基因编辑 的核酸内切酶，与Cas9不同，NgAgo–gDNA系统不需 要PAM，初步鉴定表明，该系统对导向-靶向 （guide–target）错配耐受低，且对编辑富含G+C的 基因组更加有效。据介绍，Cas9只存在于原核生物中， 而Argonautes几乎存在于所有的有机体中。要想与 Cas9正确绑定，导向RNA必须有3′RNA-RNA杂化结构， 而与Argonaute绑定不需要导向分子有任何特定的二 级结构。另一方面，Cas9只能切割PAM上游的序列， 而Argonaute不需要靶标有特定的序列。 NgAgo有望 成为编辑哺乳动物基因组的精准有效的工具。
crispr原理解析
• crRNA：当细菌抵御噬菌体等外源DNA （ protospacers ）入侵时，在前导区的调控下， CRISPR被转录为长的RNA前体(pre-crRNA)，然后加 工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成 熟crRNA，pre-crRNA转录的同时，与其重复序列 互补的反式激活crRNA (Trans-activating crRNA， tracrRNA)也转录出来。
crispr原理解析
• 敲除AIP1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统,成 功获得AIP1敲除的人(胚肾细胞株)293T稳定 细胞株（广州医科大学）
• 在一个黑素瘤模型中，筛选出了涉及药物 维罗非尼（Vemurafenib）耐药性的基因 （麻省理工学院 张峰）
crispr原理解析
CRISPR/Cas9的靶向特异性是由两部分决定的， 一部分是RNA嵌合体和靶DNA之间的碱基配对，另一 部分是Cas9蛋白和一个短DNA基序（DNA motif）的结 合，这个短DNA基序通常在靶DNA的3‘末端发现，被 称为前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif， PAM）
CRISPR研究先锋张峰博士
Nature 2013十大科学人物：CRISPR研究先锋张峰博士英国著名杂志Nature周刊是世界上最早的国际性科技期刊，自从1869年创刊以来，始终如一地报道和评论全球科技领域里最重要的突破。
其办刊宗旨是“将科学发现的重要结果介绍给公众，让公众尽早知道全世界自然知识的每一分支中取得的所有进展”。
近日，Nature杂志对过去一年里在生命科学领域发布的重要成果及风云人物进行了盘点，来自来自中国农业科学院的陈化兰（Hualan Chen，延伸阅读：《自然》评年度十大科学人物陈化兰研究员入选）研究员，以及麻省理工学院的张峰（Feng Zhang）博士入选十大科学人物。
在2013年张峰完成了2篇Science，2篇Cell论文发表，这是少见的。
张锋：DNA的掌控编辑者这位生物学家借鉴细菌，构建出了一种强大的定制DNA工具细菌利用来保护自身抵御病毒的一种DNA切割机制，在2013年成为了生物医学研究最热门的课题之一。
一位对开发新工具抱有强烈热情的年轻神经科学家帮助使其变为现实。
麻省理工学院32岁的张峰是率先利用称作为CRISPR/Cas的系统，以廉价、简易和准确的方式编辑基因组的科研人员之一。
在2013年1月，他的研究小组证实了这些系统能够在真核细胞中起作用。
表明了它有潜力调整小鼠、大鼠和甚至灵长类动物的基因组帮助研究，改善人类疾病建模和开发治疗(L. Cong et al. Science 339, 819–823; 2013)。
北卡罗来纳州立大学微生物学家RodolpheBarrangou说：“作为今年的热点故事，CRISPR的热潮可能才刚刚开始。
”CRISPR（成簇的规律间隔短回文重复序列，clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是许多细菌和古细菌利用来保护自身的一些DN A序列。
它们编码的RNAs可以特异性地识别病毒基因组中的靶序列。
基因工程中的CRISPR技术研究与应用
基因工程中的CRISPR技术研究与应用CRISPR技术是一项革命性的基因编辑技术，被广泛认为是基因工程领域的重大突破。
它的全称为“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”，即“簇状规律间隔的短回文重复序列”，是一种存在于细菌和古细菌中的天然防御机制。
这项技术允许科学家改变生物体的遗传信息，对人类健康和生物科学领域的研究具有广阔的应用前景。
CRISPR技术的核心是一种酶-核酸复合物，名为Cas9。
Cas9是一种核酸内切酶，能够与特定的RNA序列结合，并根据这个序列定位到基因组DNA的特定位置。
它可用来剪切DNA双链，使得科学家能够精确地编辑目标基因。
CRISPR技术的第一步是设计和合成一种称为“指南RNA”的分子，它与目标DNA序列互补配对，并将Cas9酶引导到基因组的特定位置。
在准确到达目标位置之后，Cas9酶将剪切该地点的DNA双链，从而在细胞中引发DNA修复。
此后，细胞会借助内源性修复过程如非同源末端连接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）或同源重组修复（Homology-Directed Repair，HDR）来修复被剪切的DNA 链。
CRISPR技术具有许多显著的优势。
首先，相比于传统的基因编辑工具，如锌指核酸或转录激活因子，CRISPR技术更加灵活、高效且易于操作。
其次，CRISPR技术允许精确、快速和经济地编辑基因组，使科学家们能够更好地了解基因与特定性状之间的关系。
此外，CRISPR技术还可以在短时间内改变多个基因，实现靶向性基因组工程和疾病治疗。
在基因工程中，CRISPR技术已经取得了许多突破。
通过直接编辑基因组，CRISPR技术可以用来研究基因功能和调控机制，了解疾病的发生发展过程，并为治疗疾病提供新的方法。
例如，研究人员在动物模型中利用CRISPR技术成功地模拟了人类遗传性疾病，如囊性纤维化和遗传性视网膜病变，为新药开发和疾病治疗提供了有力的实验依据。
基因编辑技术CRISPR背后的无名英雄
基因编辑技术CRISPR背后的无名英雄2016年08月25日讯当Blake Wiedenheft开始研究微生物时，他的工作目标遥远而模糊。
他的博士研究项目是采集美国黄石国家公园的温泉样本，然后在实验室建立人工模型并研究生活在那些不宜居的水中的微生物。
“我们希望了解生命如何在沸腾的强酸中生存。
”他说。
随着时间推移，Wiedenheft对微生物如何规避病毒变得日益感兴趣。
他阅读了相关资料，遇到了一个叫作CRISPR的特殊细菌免疫系统。
2007年，他认识了加州大学伯克利分校分子生物学家Jennifer Doudna，发现后者和他有着同样的兴趣。
Doudna邀请他加入了实验室。
接下来的5年，Wiedenheft研究了CRISPR系统的结构和生化特征，并在《自然》杂志以第一作者形式发表了论文。
今天，CRISPR已经成为全世界范围内的分子生物学家众所周知的一个名字。
研究人员在热切地使用该系统在生命王国中嵌入或删除基因组中的DNA序列。
CRIPSR正被用于生成经过基因编辑的新作物品系以及未来有一天可用于治疗人类遗传疾病的疗法。
Doudna和其他在该领域做出开创性工作的领衔研究人员已经成了科学领域的“明星”：他们的报道出现在新闻报纸、名人纪录片中，并有传言认为他们将是诺贝尔奖有力的竞争者。
“当初进入实验室的时候，只有我一个人在研究CRIPSR。
”Wiedenheft说，“但当我离开实验室的时候，几乎所有人都在研究它。
”然而，Wiedenheft远没有获得像导师一样的名气，其他坐着“冷板凳”辛苦工作从而让CRISPR基因编辑得以实现的研究生和博士后也是如此。
他们当然也会从工作中有所收获，比如导师的支持和反馈以及令其他人垂涎的技能。
但是当他们计划在这个竞争高度激烈的领域安身立命、转变为独立科学家时，却也碰到了过渡期中的阵痛。
荣誉“雷池”CRISPR-Cas9基因编辑的历史已经成为一个存在激烈争议和高风险专利战争的话题。
炫酷3D动画带你了解CRISPR
炫酷3D动画带你了解CRISPR
编辑：解螺旋.小米视频来自腾讯视频
转载请注明来源：解螺旋，医生科研助手
CRISPR/Cas9技术是近两年新涌现的一种基因组编辑工具，能够完成RNA导向的DNA识别及编辑，为构建更高效的基因定点修饰技术提供了全新的平台，由于其易操作性和极强的扩展性，迅速成为了科研领域的新宠。
CRISPR/Cas9灵魂人物，年仅32岁的麻省理工学院助理教授张峰参与制作的视频，用3D动画形象展示了CRISPR/Cas9基因编辑的原理，敬请收看！
此系统的工作原理是crRNA (CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与tracrRNA (trans-activating RNA) 结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点处剪切双链DNA，从而实现对基因组DNA序列进行编辑；而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的gRNA (guide RNA)，足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。
作为一种 RNA导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子 (unifying factor)，能够共定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。
将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9 nuclease-null)融合，并表达适当的 gRNA，即可靶定任何 dsDNA 序列，而RNA 可连接到gRNA 的末端，不影响Cas9 的结合。
因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及 RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。
CRISPR：从DNA测序到基因改写的故事及启示
CRISPR：从DNA测序到基因改写的故事及启示2020年诺贝尔化学奖，颁给了两位开发CRISPR/Cas9“基因剪刀”工具的科学家：德国柏林马克斯·普朗克病原体科学研究所主任Emmanuelle Charpentier（法籍），和加州大学伯克利分校教授Jennifer Doudna（美籍）。
CRISPR是细菌进化产生的特殊“免疫适应工具”，这些间隔重复片段中藏着与曾经侵害过细菌祖先的病毒相同的DNA序列，当病毒再次进入细菌，CRISPR基因启动，转录成CRISPR－RNA及先导RNA，并联合核酸酶Cas9，成为“基因剪刀”，在先导RNA的引导下，找到目标DNA片段，将其切除。
现在，任何一个实验室都可以用CRISPR技术精准地进行靶向修饰，剪掉靶基因，并修复。
这种技术已经带来一场革命。
CRISPR的发现及应用可以实现精准改写DNA，利用它，人类或许可以祛除风险基因、植入长寿基因，甚至设计完美胎儿，但也由此引发了伦理及法律问题。
现在，已经有人用基因剪刀来治疗艾滋病——把CCR5基因剪掉，让艾滋病病人对艾滋病病毒免疫。
下面这篇文章原载于《康复·生命新知》杂志（2016），讲述了CRISPR的故事及启示。
2003年，时任美国总统克林顿向全世界宣布，经全世界科学家的努力，人类DNA测序完成。
这个堪比登月计划的“人类基因组计划工程”（HGP），启动于1990年，聚七国之力，耗资30亿美元，几乎是每一个DNA的碱基测定耗费一美元。
这一研究成果，给人们带了来无限的想象空间：科学家们揭示了人类基因的密码，我们可以得到更精准的诊断及治疗，甚至梦想改变不良基因，让我们变得更优秀。
这是一个正常的反应，每每在重大科学发现之后，媒体为了吸引眼球，煽情地超科学解读，形成全社会超预期的期盼。
13年过去了，DNA测序技术不断提高，价格不断下降，一次全基因测序仅需1000美元。
但是，面对天文数字般的测序结果，我们的解读能力还处于婴儿阶段，大量的DNA变异与疾病的相关性研究仅仅是统计学的数字游戏，成为学者们发表文章的工具，超过一半的此类研究沦为毫无价值的垃圾。
CRISPR英雄谱
汇 报 人：周文慧 组 员 ：庄学梅，李海霞，周文慧，张姝，代泽宝，杨少娟 指导教师：牛雪梅 研究员
目录
CONTENTS
CRISPR/Cas9技术发展史 及启发
CRISPR/Cas9技术
技术发展史---CRISPR的发现
20 世纪50年代微生物遗传学、生物化学和基因组学，三位大师级
RNA(tracrRNA) 不仅仅涉及处理 crRNA，它还对 Cas9核酸酶复合 体剪切DNA是必
需的
纯粹好奇心 无假设驱动 个人兴趣
Jennifer Doudna
与Charpentier 合作证明两种RNA在 被融合为单一的导向 RNA（sgRNA）时也 可以在体外发挥作用
纯粹好奇心 无假设驱动 个人兴趣
2014年5月 Jennifer Doudna启动专利抵触程序。
2017年2月 美国专利局裁决MIT获得专利。
CRISPR发展背后的启发
新颖的 视角和 深厚的 专业知
识
灵感与 规划
科研环 境与 假设驱
动
CRISPR发展背后的思考
首先，重视微生物研究 其次，重视基础科学研究 最后，重视科学发展规律
编辑基因成为可能
张峰
纯粹好奇心 无假设驱动 深厚的专业知识
通过表达Cas9基因和一个设计过的靶向携带荧光 素酶的质粒的CRISPR RNA，他可以在人胚胎肾
细胞（HEK）内降低荧光度
发现一个由三部分组成的强有效的系统，包含来自 化脓性链球菌和嗜热链球菌两者之一的Cas9、 tracerRNA和CRISPR阵列
可利用多个 sgRNA而实现多基因同时敲除，从而 极大提升编辑效率和适用范围。
1987 CRISPR 的发现
环境生物技术(CRISPR张锋)
创业者一样的科学家
01 03
正是得益于这个项目，张锋的辅导老师把他引荐到了他的第一位人生导师 约翰•利维（John Levy）的实验室。在这里，他利用病毒把水母中可以发光 的基因注入到了一个人体黑素瘤细胞中，这是他第一次把一个物种的基因转 移在另一物种上。这时的他还在读高二。
到斯坦福读博士的张锋遇到了他的另外一个重要导师，卡尔·代塞尔罗思（ Karl Deisseroth ）。张锋阴差阳错的进入了这个刚刚成立的实验室，成为了他的首个学 生。就是这样的一对组合，在几年后，创造出了一个可以用光来精准的控制脑神经 的全新技术。这项技术因为其可能带来的巨大影响而被《自然》杂志选为年度技术。
张锋
CRISPR“上帝的剪刀” 领军人物
No object is mysterious. The mystery is in our eyes.
生平经历
基因编辑技术
CRISPR 系统 专利之争
01
生平经历
低调的80后
1983年出生于河北石家庄，美国麻省理工学院 博士，是当今最为人所关注的华人生物学家之 一。从诺贝尔奖有力得主，福布斯40岁以下最 有成就的40人，《自然》杂志十大科学人物， 到华裔新移民和80后。张锋这个并不出彩的名 字，因为CRISPR-CAS9站到了时代和舆论的风口 浪尖。 这项被誉为“上帝的剪刀”的技术让人们拥有 了前所未有的基因编辑能力，让我们有机会以 低廉的成本精确的替换掉病变的DNA片段，从 而达到治疗或者缓解疾病的目的。
基因编辑技术 具体治疗手段与成功案例
体外 治疗
体外治疗为将病人体内需要被改造的细胞取出，在体外进行 培养与改造，然后将改造后的细胞导入体内。 例子：将HIV携带者体内的CD4阳性T细胞表面的CCR5受体 进行突变，然后导入体内，发现这一做法能够有效提高患者 CD4阳性T细胞数量与减轻HIV恶化程度。
CRISPR英雄谱
CRISPR英雄谱
埃里克·兰德;小鹿
【期刊名称】《科技中国》
【年(卷),期】2016(0)5
【摘要】三年之前科学家们宣布，CRISPR技术能够对真核活细胞进行精准与有
效的基因组编辑。
自此，这项技术手段己然震撼了科学界，数以干计的实验室正在将其运用于从生物医药到农业的各个领域。
然而，从一种奇特的细菌重复序列现象的发现开始，剑确认这种现象为适应性免疫系统，进而对它的生物功能特性的了解，直至开发为一项基因工程的技术，这此前二十载相关的研究历程却不为人所知。
【总页数】11页(P64-74)
【作者】埃里克·兰德;小鹿
【作者单位】美国哈佛-MIT Broad研究所
【正文语种】中文
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姿势CRISPR研究中的幕后英雄们
姿势CRISPR研究中的幕后英雄们作者：解螺旋.叶子转载请注明来源：解螺旋，医生科研助手CRISPR-Cas9 的基因组编辑技术给整个学术界和工业界带来革命性的变化，随之而来的还有CRISPR专利之争。
然而，我们知道一项科学技术的发展不是一蹴而就的，往往要经历了前后多辈及多个团队的努力才能有所突破。
科学家报告说，CRISPR技术可实现精确，高效的在活的真核细胞中进行基因组编辑，从那时开始，这项技术像风暴一般席卷科学界，有数以千计的实验室在用它进行生物医药或者农业方面的研究。
而这所有的一切都开始于一项微生物的研究……古微生物实验的惊奇发现故事发生在西班牙的科斯塔布兰卡，Francisco Mojica在当地的一个实验室研究古微生物。
他发现培养基中的盐浓度影响着限制酶切断该微生物基因组的方式，他决定试着改变这些片段的特征。
在他检查的第一个DNA片段中，发现了一个令人惊奇的结构，多份近乎完美的回文结构，重复着30个碱基序列，由大约36个碱基间隔开。
之前没有任何微生物是这样的。
一开始这个现象被称为短规则间隔重复（SSR），后来在Mojica的建议下，它被叫做Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats（CRISPR）。
但依照Mojica的假说，CRISPR能够参与基因调控、复制子分区、DNA修复以及其他许多功能。
但现在大多数的假设都鲜有证据，还有一些被证明是错误的。
荷兰科学家与编程CRISPRJohn van der Oost是一位荷兰科学家。
他和他的同事们将大肠杆菌CRISPR系统插入另一株大肠杆菌中。
这让他们通过得到了一个5个Cas蛋白的复合物，称为Cascade。
通过单独的敲除每一个组件，他们发现Cascade需要切割很长的前体DNA，要从CRISPR基因转录到61个核苷酸长度的CRISPR RNA （crRNAs）。
他们在克隆和测序了一组与Cascade共纯化的crRNAs，结果发现所有的序列都开始于最后8对碱基的重复序列，后面跟着完整的碱基间隔和下个重复区域，这一发现证实了重复的回文序列会导致crRNA二级结构的形成。
CRISPR基因编辑技术原理及其应用前景
CRISPR基因编辑技术原理及其应用前景CRISPR基因编辑技术是一种革命性的生命科学工具，它利用细菌天然免疫系统中的一部分机制，可以在基因组中对特定基因进行定点修饰。
CRISPR是“聚簇规则间隔短回文重复”（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）的简称，它是一种特殊的DNA序列，细菌通过利用CRISPR序列可以识别并抵御病毒侵袭。
科学家们发现了CRISPR的潜力，并将其转化为一种经济高效且高精确性的基因编辑技术。
CRISPR技术的原理主要包括两个关键成分：CRISPR-Cas9系统和导向RNA。
CRISPR-Cas9系统主要由两个部分组成，Cas9酶和导向RNA（gRNA）。
Cas9酶是一种蛋白质，它在CRISPR系统中起到“剪刀”的作用，能够切割DNA分子。
导向RNA是一种特殊的RNA分子，它能够与目标基因序列互补配对，并将Cas9酶引导至目标基因的特定位置。
在CRISPR基因编辑过程中，首先需要设计和合成导向RNA，使其能够与目标基因的序列匹配。
导向RNA与Cas9酶形成复合物后，复合物会扫描细菌基因组，直到找到与导向RNA配对的基因区域。
随后，Cas9酶将目标基因分子剪切并形成DNA双链断裂。
细胞会尽力修复断裂，但通常会引入突变，这导致了基因编辑的实现。
CRISPR基因编辑技术的应用前景非常广阔，涵盖了包括农业、医学和生物研究等多个领域。
在农业领域，CRISPR技术可以用于改良作物，增强它们的抗病性、适应性和产量。
通过精确地编辑作物基因组，科学家可以使传统育种无法实现的特征得以表达，从而提高作物的产量和质量。
此外，CRISPR技术还可以用于疾病防治，例如通过编辑患有遗传病的胚胎基因，从而防止这些疾病在后代中传播。
在医学领域，CRISPR基因编辑技术具有革命性的潜力。
它可以被用于治疗一系列遗传性疾病，如囊性纤维化、亨廷顿舞蹈症等。
【高中生物】引领基因编辑时代的革命
【高中生物】引领基因编辑时代的革命一场“风暴”几乎席卷了整个生物医学研究领域，而这场“风暴”的中心就是crispr/cas9基因编辑技术。
4月，美国批准了首个crispr/cas9技术的专利申请。
11月，美国加州大学伯克利分校的杜德纳(doudna)和德国亥姆霍兹传染研究中心的卡彭特(charpentier)因在crispr研究方面做出了突出的贡献而获得了今年的科学突破奖。
crispr/cas9技术究竟是什么?它有着什么样的“魔力”能够让世界范围内生命科学领域的专家学者们对它钟爱有加?让我们一起来揭开它神秘的面纱。
起源和发展1987年，日本学者发现，在大肠杆菌的基因末端(碱性磷酸酶基因的3’侧翼区)有一段间隔重复的dna序列。
之后更多的研究证实，这种重复序列广泛存在于细菌中。
2002年，将其命名为crispr(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)，即成簇的规律间隔的短回文重复序列区域(图1)。
2021年，美国等国家展开的多项研究表明，crispr中的间隔序列和噬菌体或质粒的序列之间存有同源性，有些甚至超过100%。
这说明这些间隔序列可能将源于噬菌体基因组。
2021年，科学家通过实验证实了该观点，并在链球菌中(图2)通过多寡crispr中的序列改变了其对噬菌体的免疫力。
在crispr序列位点的周围存在着一组序列(cas蛋白组)，这其中包含有核酸内切酶、核酸外切酶和dna-结合区等结构域。
随着对不同细菌的基因组的测序和更多相关研究的积累，越来越多不同细菌中的crispr系统和cas基因被发现，其作用机理也逐渐清晰。
而cas蛋白就是其中位点的关键作用点，研究者们根据其作用方法的不同，将其分为了三类(ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型)。
crispr/cas9技术已经开始崭露头角，来源于杜德纳(doudna)和其同事辨认出了一个比较简单的crispr(ⅱ型)系统并对其展开了改建。
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1.2 CRISPR英雄谱背后的故事 启发
The Heroes of CRISPR 科学家的科研环境
“无假设驱动” 与“假设驱动” 的研究方法
纯粹好奇心与
实践运用
个人与团队
灵感与规划
科研环
境
新颖的视角 和深厚的专 业知识
科学家 Francisco Mojica Giles Vergnaud及同事 Alexander Bolotin
卡彭蒂耶和杜德娜的发现既是细菌获得性免疫系统领域研究的里程碑，又是基因编辑领 域的里程碑。
技术发展史---CRISPR-Cas9技术的发展与应用
2013年，哈佛大学张锋和丘齐(George Church)则进一步在哺乳动物细胞内完成特 定基因的编辑，特别是可利用多个sgRNA 而实现多基因同时敲除，从而极大提升了编 辑效率和适用范围。
Cas9蛋白由 spacer sequencos和 cleaves引导 识别靶序列进 行切割造成 DSB Bolotin et al.
2010
体外证实 Cas能够对 DNA切割
Charpentier Doudna
2012
证实编程 CRISPR/Cas9 蛋白复合物在 序列特异性的 靶位点识别并 切割RNA 2014
技术发展史---CRISPR-Cas9技术的发展与应用
ZFN（锌指核酸酶)：由FokI限制性 核酸内切酶当中的非特异性DNA切
割结构域和锌指蛋白组合而成的。
DNA识别域：由一系列 Cys2His2锌指蛋白串联组成（一般3-4 个），每个锌指蛋白识别并结合一 个特异的三联体碱基。
技术发展史---CRISPR-Cas9技术的发展与应用
技术发展史---CRISPR-Cas9基因编辑技术
2005年，原核生物CRISPRCas系 统的获悉
杜德娜
已有推测：采用RNA干扰方式 杀死病毒，但详细机制可能不 同于真核细胞 2007年，巴兰古等CRISPRCas系统的细菌免疫作用的发 现 借助结构生物学方法探索 这一新型“ RNA干扰”中 酶的作用机制
能够为自身提供一种特异性免疫保护机制，抵御外来病毒、质粒等遗传元件的入侵。
技术发展史---CRISPR-Cas9技术的发展与应用
CRISPR-Cas9技术本身不仅取得巨大成功，还推动基因编辑新工具的层出不穷，出现 了一系列改进版和更新版。 Cpf1与Cas9类似，也是一种RNA依赖的DNA核酸内切酶，但在剪切靶DNA时只需crRNA参 与，而无需tracrRNA辅助，用做基因编辑时可大大缩短引导RNA长度，因此CRISPR-Cpf1 系统将更为简单。 Argonaute蛋白(Ago)系统(不同于CRISPR/Cas系统只存在于原核生物，Argonaute蛋白 从原核生物到真核生物都普遍存在，并且在真核生物RNA干扰过程中的作用机制已得到全 面研究)也可发挥免疫作用以抵御质粒等外源DNA入侵，暗示着也可被改造为基因编辑工具。
CRISPR研 究的根本转 折：
2005年，来自西班牙和法国的三个研究 小组几乎同时报道了一个重大发现：通 过对CRISPR居间序列的系统分析，意外 发现它们并非原核生物自身序列，而是 来自病毒或质粒。
NCBI进化生物学家库宁（Eugene Koonin) 很获悉CRISPR的居间序列来自病毒DNA后， 库宁立刻意识到细菌可利用 CRISPR作为一 种防御病毒侵染的重要武器。
莱德伯格奠定细菌遗传学基础，从而使简单的细菌成为分子生物学模式生物；
科恩伯格则奠定细菌分子生物学酶学基础，开创酶学研究科学范式；
桑格则于1977年发明基因测序方法，从而使基因测序成为常规研究内容。
CRISPR-Cas系统的发现则开始于细菌测序。
技术发展史---CRISPR的发现
1987年，日本微生物学家石野良纯(Yoshizumi Ishino)实验室对大肠杆菌的碱性磷酸酶同 工酶(alkaline phosphatase isozyme, iap)进行测序，意外地发现终止密码子后的非编码 区存在一些异常重复序列。异常原因：一方面原核生物如细菌的DNA利用率较高，重复序 列较少；另一方面传统的重复序列常为串联重复，而这次发现却是“重复-居间序列 (spacer)-重复”这一排列特征.
技术发展史---CRISPR-Cas系统的作用机制
2011年，卡彭蒂耶首次阐明 tracrRNA在crRNA加工中的作用：tracrRNA与转录出的CRISPR重复 序列互补结合，这种结合在Cas9因子存在前提下被RNA酶Ⅲ识别和剪切，最终产生成熟crRNA。这 一发现具有十分重要的意义，相对于其他CRISPR系统往往需要一种crRNA但同时需多种Cas9蛋白参 与，这一系统(Ⅱ 型)则需两种RNA(crRNA和tracrRNA)， 虽增加RNA数量，却只需一种Cas9蛋白 完成。这个系统如此简单，卡彭蒂耶意识到可将其改造为一种强有力的遗传操作工具用作基因编辑。
技术发展史---CRISPR-Cas系统的生物学作用
库宁提出解释CRISPR-Cas作为获得性免疫系统的作用机制：细菌通过特定方式获取 噬菌体DNA片段并将其整合到自身CRISPR重复序列之间形成居间（间隔）序列，从 而对外源入侵病毒产生“记忆”；这些序列可被转录出非编码RNA；当噬菌体再次感 染时，这些RNA可依靠居间序列信息识别并破坏入侵者。
杜德娜小组确定CRISPR-Cas 是一种可对特定DNA序列进行 定向剪切的细菌防御系统
细菌CRIS PR-Cas系统的青年研究小组
先后确定Cas蛋白拥有 DNA酶活性、RNA序列依 赖的DNA核酸内切酶活性、 crRNA加工活性等。
技术发展史---CRISPR-Cas9基因编辑技术
2011年，杜德娜对这种简单的Ⅱ型系统特别是tracrRNA很着迷，而卡彭蒂耶则对Cas9作用 机制更感兴趣。一位RNA专家(卡彭蒂耶 )与一位酶学专家(杜德娜)的鼎力合作实现了最大程 度的优势互补，而CRISPR-Cas9技术简单而言就是RNA(sgRNA)和酶(Cas9)。
TALEN（转录激活样效应因子核酸酶）：主要 由FokI内切酶结构域和TALE蛋白的DNA结合 结构域组合而成。
DNA识别域：由一系列TAL蛋白串联组成（一 般20个左右），每个TAL蛋白识别并结合一个 对应的碱基。
技术发展史---CRISPR-Cas9技术的发展与应用
CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat 即成簇的、有规律的、间隔短回文重复序列； 研究大肠杆菌编码的碱性磷酸酶基因时发现； 存在于细菌和古细菌基因组中含有多个短重复序列的基因位点；
CRISPR广 泛存在与原 核生物中 Mojica et al. 2000
间隔序列 适应性免疫 系统 确定PAM Pourcel et al. Mojica et al. 2005
Spacers转录 形成crRNA 指导Cas靶向 性 CRISPR靶点 是DNA Brouns et al. Marraffini et al.
The Heroes of CRISPR
主讲人：王敏
组号：第五组
组员：黄勇、祝菁、张喆、杨爱玲、万娟、陈志毅、陶娅迪
主讲内容 1. 文献解读
CRISPR/Cas9技术发展史 CRISPR英雄谱背后的故事启 发
2. CRISPR-Cas9技术
1.1 CRISPR/Cas9技术发展史
CRISPR的发现 CRISPR/Cas系统的生物学作用 CRISPR/Cas系统的作用机制
CRISPR/Cas9基因编辑技术
CRISPR/Cas9技术的发展与应用
技术发展史---CRISPR的发现 20世纪50年代开始的微生物遗传学、生物化学和基因组学，三位大 师级科学家莱德伯格(Joshua Lederberg)、科恩伯格(Arthur Kornberg)和桑格(Frederick Sanger)为此做出了奠基性贡献。
技术发展史---CRISPR-Cas系统的生物学作用
巴兰古在霍瓦特(Philippe Horvath)等协助下首先利用两株噬菌体(P1和P2)侵染链球菌， 结果杀 死大部分细菌，但仍有部分“幸运”细菌保留下来，且当它们被进一步培养时会获得噬菌体抗性。 对这些抗性细菌的基因组分析表明，其CRISPR居间序列中出现噬菌体序列，与P1序列一致则对 P1产生抗性，若与P2序列一致则对P2产生抗性，而如果为两株噬菌体公用序列，则对两株噬菌体 均产生抗性。当将抗性细菌去除噬菌体序列则导致抗性消失，相反直接将噬菌体序列整合到未感 染过噬菌体的细菌CRISPR中，细菌对首次噬菌体感染产生抗性。这是首次在实验上证实CRISPRCas是一种细菌获得性免疫系统。 巴兰古等的发现既是CRISPR-Cas系统研究的一个里程碑，也是一个转折点和分水岭
CRISPR-Cas9技术的应用
基因 检测 单/多重 基因敲 除
基因 敲入
应 用
基因 标记
大片段 删除
转录 调控
1987 CRISPR 的发现
2002 CRISPR的命 名 Cas基因的定 义 Jansen et al.
2007 第一次证实 CRISPR的 作用：获得 性免疫 Barrangou et al.
技术发展史---CRISPR-Cas9技术的发展与应用
主要应用领域
特异性DNA识别域 + 非特异性核酸内切酶
第一代1996：ZFN（锌指核酸酶） （Zinc Finger Nuclease）
Genome Editing 的三大工具
第二代2011：TALEN（转录激活样效应因子核酸酶） (Transcription activator-like effector nuclease） 第三代2013：CRISPR（成簇规律间隔短回文重复技术）
2009
2011 tracrRNA 与crRNA 形成二聚体 并与Cas9 组成复合体 Jarneau et al.