2015.3.9基因工程 胶印

东平明湖中学高三（艺体生）生物学案一、复习目标考查热点：探针（放射性同位素和荧光分子标记的目的基因的一条链），标记基因（如抗生素抗性基因，如四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因，卡那霉素抗性基因），标记基因用于标记成功导入重组质粒的受体细胞,PCR技术中的Taq酶（热稳定的DNA聚合酶）及引物对,基因表达载体（启动子，终止子，复制原点，目的基因，标记基因），限制酶特点 (每种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子) ，用相同两种限制酶切割质粒和目的基因的优点， DNA连接酶与DNA聚合酶的区别。

二、【基础知识梳理】完成《高考领航》上的基础知识梳理填空考点一、基因工程的工具1、基因工程的操作工具（一）限制性核酸内切酶识别的序列的特点：“回文序列”，呈现两侧碱基互补对称，注意：①用限制酶切割DNA分子时，被破坏的是DNA链中的磷酸二酯键（即连接相邻两个脱氧核苷酸的键）。

②黏性末端是指双链DNA分子被限制酶切开后，切口处的两个末端伸出的由若干特定核苷酸组成的单链。

1.（2010天津理综）下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。

图中tet R表示四环素抗性基因，amp R 表示氨苄青霉素抗性基因，BamHI、HindIII、SmaI直线所示为三种限制酶的酶切位点。

据图回答：（1）图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。

2．(2011年山东聊城高三一模)限制酶是一种核酸内切酶，可识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。

如图为四种限制酶Bam HⅠ、Eco R I、Hin d Ⅲ和BglⅡ的识别序列和切割位点。

切割出来的DNA黏性末端可以互补配对的是()Bam H ⅠEco R ⅠHin d ⅢBglⅡ↓↓↓↓GGATCC GAATTC AAGCTTAGATCTCCTAGG CTTAAG TTCGAA TCTAGA↑↑↑↑A．Bam H Ⅰ和Eco R ⅠB．Bam H Ⅰ和Hin d ⅢC．Bam H Ⅰ和BglⅡD．Eco R Ⅰ和Hin d Ⅲ3．(2011年浙江)在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是()A．用限制性核酸内切酶切割烟幕花叶病毒的核酸B．用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体C．将重组DNA分子导入烟草原生质体D．用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞4．(2011年海南单科)回答有关基因工程的问题：构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA 后，可能产生黏性末端，也可能产生________末端。

若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生________(相同、不同)黏性末端的限制酶。

（二）． DNA 连接酶DNA 连接酶有两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E ·coli DNA 连接酶；另一类是从T 4噬菌体中分离出来的．称为T 4 DNA 连接酶。

E ·coli DNA 连接酶只能将双链DNA 片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA 片段平末端之间进行连接。

而T 4-DNA 连接酶既可以连接双链DNA 片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA 片段的平末端，但连接平末端的效率较低（三）．载体 (1)载体具备的条件①对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动； ②具标记基因，用于标记成功导入重组质粒的受体细胞,； ③能自我复制，通过复制进行基因扩增；④具有多个酶切位点，供外源基因插入其中，而且每种酶切位点最好只有一个，避免酶切后环状DNA 打开，丢失某些片段。

(2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA 之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA 分子。

(3)其他载体：λ噬菌体（细菌病毒）（温和噬菌体）的衍生物、动植物病毒等。

考点 二 基因工程的基本操作程序 （一）.获取目的基因的方法这些受体菌群即为基因组文库③人工合成（反转录法，化学合成法）。

反转录法的基因导入受体菌群，这些受体菌群即是部分基因组文库（cDNA 文库），cDNA 是指与mRNA 互补的DNA 。

3.PCR 技术扩增目的基因注意：PCR 技术中的Taq 酶（热稳定的DNA 聚合酶）；引物对 （1）PCR 实质：DNA 复制（2）PCR 过程：加热解链→冷却复性（引物与目的基因互补序列结合）→延伸。

第一步：加热至90～95℃DNA 解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA 链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA 聚合酶即Taq 酶从引物起始催化促进互补链的合成。

5. （2012沈阳调研）下图为利用生物技术获得生物新品种的过程示意图。

据图回答：（1）随着科技发展，获取目的基因的方法也越来越多，若乙图中的“抗虫基因”是利用甲图中的方法获取的，这种获取方法属于__________ ____ ______。

③是在___ ___ ________（填“酶的名称”）作用下进行延伸的。

（二）基因表达载体的构建（目的基因与运载体结合）步骤1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。

2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA 片段，位于基因的首端，是RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA ，最终获得所需的蛋白质。

（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA 片段 ，位于基因的尾端。

能使转录在所需要的地方停下来（3）标记基因的作用：用于标记成功导入重组质粒的受体细胞，便于鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。

常用的标记基因是抗生素抗性基因（如四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因，卡那霉素抗性基因）。

“印章法”介绍目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示。

(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于________。

(2)pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoR Ⅰ只能识别序列—GAATTC —，并只能在G 与A 之间切割。

若在某目的基因的两侧各有1个EcoR Ⅰ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoR Ⅰ切割后所形成的黏性末端。

(3)pBR322分子中另有单个的BamH Ⅰ限制酶作用位点，现将经BamH Ⅰ处理后的质粒与用另一种限制酶Bgl Ⅱ处理得到的目的基因，通过DNA 连接酶作用恢复________键，成功地获得了重组质粒。

说明____________________________________________________。

(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR 和tetR 的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。

再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。

与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是____________，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是________________。

【答案】(1)筛选(鉴别目的基因是否导入受体细胞) (2)(3)磷酸二酯 两种限制酶(BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ)切割得到的黏性末端相同 (4)能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素 pBR322 质粒 【解析】（1）构建人工质粒时要有抗性基因作为标记基因，以便于鉴别目的基因是否导入受体细胞； （2）（3）DNA 连接酶作用是恢复磷酸二酯键；通过题干叙述知，两种限制酶(BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ)切割得到的黏性末端相同，这样才能进行相应的碱基互补配对；（4）与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素；图三结果显示，多数大肠杆菌导入的能抗氨苄青霉素也能抗四环素的人工质粒即pBR322 质粒。

6.（2012沈阳调研）下图为利用生物技术获得生物新品种的过程示意图。

据图回答：（1） C 过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加入 ________________。

7. （2010天津理综）下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。

图中tet R表示四环素抗性基因，amp R表示氨苄青霉素抗性基因，BamHI、HindIII、SmaI直线所示为三种限制酶的酶切位点。

据图回答：（1）筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含的培养基上进行。

（2）能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是（填字母代号）。

A.启动子 B. tet R C.复制原点D.amp R8．(2011年海南单科)回答有关基因工程的问题：利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是______。

9．(2011年安徽理综)家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。

将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。

(1)为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把来自cDNA文库的干扰素基因片段正确插入表达载体的________和________之间。

(2)采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。

该PCR反应体系的主要成分应包含：扩增缓冲液(含Mg2＋)、水、4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、________和________。

10．(2011年浙江理综)将ada (腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒pET28b 导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。

下列叙述错误的是()A. 每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒B．每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点C．每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个adaD．每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子（三）．将目的基因导入受体细胞11.（10分）下图为利用生物技术获得生物新品种的过程示意图。

据图回答：（1）乙图为获得抗虫棉技术的流程,图中将目的基因导入植物受体细胞采用的方法是________________。

12. （2010天津理综）下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。

图中tet R表示四环素抗性基因，amp R表示氨苄青霉素抗性基因，BamHI、HindIII、SmaI直线所示为三种限制酶的酶切位点。

：（1）过程①可采用的操作方法是（填字母代号）。

A.农杆菌转化B. 大肠杆菌转化C.显微注射D. 细胞融合13．(2011年海南单科)回答有关基因工程的问题：在用表达载体转化大肠杆菌时，常用________处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；)如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的________中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA 重组将目的基因插入植物细胞的________上。