一种通用型piggyBac转座子诱导细胞永生化载体的构建及其基本功能验证
PiggyBac 转座子在细胞中的转基因研究
序号： 编码：
燕山大学
第十五届“世纪杯”大学生课外学术科技作品竞赛
作品申报书
作品名称： PiggyBac 转座子在细胞中的转基因研究
所属学院：
环境与化学工程学院
申报者姓名
(集体名称)：
查鑫华
类别：
■自然科学类学术论文 □哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 □科技发明制作 A 类 □科技发明制作 B 类
依据现有资料表明，转座子具有高效的基因组间转移功能，
作品撰写的目 的和基本思路 结合目前国际上已有的一些研究报道，针对来自于昆虫的
PiggyBac 转座子系统进行改建，从基因启动子、靶基因序列
筛选以及转染方法等方面开展研究，探索新型高效的转动物技
术方法。
本课题采用现代先进的分子生物学技术，将 PiggyBac 转座
表情 论文题目 况 宿舍地址
PiggyBac 转座子在细胞中的转基因研610
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姓 名 性别 年龄
学院
专业 年级
刘瑞亮 男 其他 曾凡兴 男 作者 情况 张中峰 男
一种由piggyBac转座子介导高效构建稳定细胞株的策略
实 验 技 术 与 管 理 第38卷 第3期 2021年3月Experimental Technology and Management Vol.38 No.3 Mar. 2021收稿日期: 2020-04-29基金项目: 中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（1507219059）；同济大学第15期实验教改项目（2000104092）作者简介: 盛哲津（1982—），男，上海，硕士，实验师，研究方向为实验室管理与模式生物技术，zhejinsheng@ 。
通信作者: 李利妹（1980—），女，浙江温岭，博士，助理研究员，主要从事表皮干细胞的功能研究，136********@ 。
引文格式: 盛哲津，王亮，周斌，等. 一种由piggyBac 转座子介导高效构建稳定细胞株的策略[J]. 实验技术与管理, 2021, 38(3): 45-50. Cite this article: SHENG Z J, WANG L, ZHOU B, et al. Strategy of efficient construction of stable cell lines mediated by piggyBac transposon[J]. Experimental Technology and Management, 2021, 38(3): 45-50. (in Chinese)ISSN 1002-4956 CN11-2034/TDOI: 10.16791/ki.sjg.2021.03.010一种由piggyBac 转座子介导高效构建稳定细胞株的策略盛哲津1，王 亮2，周 斌3，李利妹4（1. 同济大学 生命科学与技术学院，上海 200092；2. 上海市浦东新区中医医院，上海 200120；3. 同济大学附属东方医院 血管外科，上海 200120；4. 同济大学附属东方医院 医学转化平台，上海 200120）摘 要：构建稳定细胞株的关键是如何提高外源目的基因插入基因组的效率。
piggyBac转座子介导的牛A-FABP表达载体的构建与鉴定
piggyBac转座子介导的牛A-FABP表达载体的构建与鉴定杨宁;昝林森;成功;付常振;李耀坤【摘要】[目的]构建以piggyBac (PB)转座子为载体元件,绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,Neomycin (NEO)为抗性基因,alpha-肌动蛋白(α-actin)为启动子的A-FABP基因特异性表达载体pPB-AFABP,并验证其转座活性.[方法]通过PCR方法合成PB转座子骨架序列、NEO-EGFP、α-actin启动子以及A-FABP基因序列,并将各个序列连接构建成转基因载体pPB-AFABP;用脂质体法将供体质粒pPB-AFABP和辅助质粒pCAG-PBase组成的PB二元系统及质粒pPB-AFABP分别转染牛成纤维细胞,通过G418筛选得到转基因细胞.[结果]经过酶切和测序鉴定,载体pPB-AFABP构建正确；PB二元系统的阳性克隆数明显多于转座子载体pPB-AFABP的克隆数；PCR鉴定结果表明,牛成纤维细胞中存在目的基因A-FABP.[结论]成功构建了转基因表达载体pPB-AFABP,且证实PB转座子在牛成纤维细胞中具有较高的转座活性.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(041)009【总页数】8页(P8-14,20)【关键词】piggyBac转座子;A-FABP基因;表达载体;牛成纤维细胞【作者】杨宁;昝林森;成功;付常振;李耀坤【作者单位】西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;国家肉牛改良中心,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S823.2piggyBac（PB）转座子作为一种非病毒载体，可以整合到宿主染色体上长期稳定地表达，已成为基因功能和转基因动物载体研究的热点。
利用 piggyBac 转座子构建小鼠诱导性多能干细胞及其鉴定
利用 piggyBac 转座子构建小鼠诱导性多能干细胞及其鉴定任丽伟;魏培;杨晓菲;杨璐;邓春艳;齐晖;李富荣【摘要】目的：利用 piggyBac 转座子载体携带鼠源 Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc 4个核转录因子，重编程胎鼠成纤维细胞（MEFs）为诱导性多能干细胞（iPSCs），并探讨其作用效果。
方法：分离 Oct4-GFP 小鼠的MEFs，将携带鼠源 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 等4个基因的 piggyBac 转座子转入至 MEFs；观察 iPSCs 克隆形成过程的形态表现；分析 iPSCs 染色体组成，评价 iPSCs 的核型变化。
RT-PCR 法检测小鼠 iPSCs 中胚胎干细胞（ESCs）相关基因 Oct4、Nanog 和 FGF4的表达；免疫荧光、碱性磷酸酶染色和流式细胞术检测小鼠iPSCs 中SSEA-1和 Nanog 蛋白表达。
将 iPSCs 接种到 NOD-SCID 小鼠腹股沟进行畸胎瘤实验，4周后取畸胎瘤制备组织切片进行HE 染色，观察组织分化情况。
结果：通过 piggyBac 转座子成功构建 iPSCs，其具有正常的核型，形态与小鼠ESCs 相似，克隆边界清晰、呈圆形或卵圆形，克隆内细胞致密、核大。
RT-PCR和免疫荧光染色分析， iPSCs 可表达多能性基因和蛋白（Oct4、Sox2、Kif4和c-Myc）。
在免疫缺陷小鼠体内接种 iPSCs 可形成具有3个胚层组织的畸胎瘤。
结论：以 piggyBac 转座子为载体将 Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc 4个转录因子基因导入MEFs，可以成功诱导 MEFs 成为具有 ESCs 特征的正常核型iPSCs。
%Objective:To investigate the effect of piggyBac transpon,as a carrier of four defined transcription factors Oct4,Sox2,Klf4 and c-Myc,in the reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs)to induced pluripotent stem cells (iPSCs).Methods:The MEFs were isolated from Oct4-GFP fetal mice and transfected by piggyBac transposon with four factors (Oct4,Sox2,Klf4 and c-Myc).The morphological changes of clones weretraced with microscope during the process of induction.The chromosomes were analyzed to evaluate the karyotypic variation of iPSCs.The mRNA expressions of Oct4, Nanog and FGF4 associated with embryonic stem cells (ESCs)in the iPSCs of mice were tested by RT-PCR;the protein expressions of SSEA-1,Nanog and Alkaline phosphatase in the iPSCs of mice were determined by flow cytometry,immunofluorescence and AP staining.The iPSCs were transplanted into the NOD-SCID mouse groin,4 weeks later,the teratomas were removed for HE staining and the differentiation of tissue was observed.Results:The iPSCs were successfully obtained from MEFs by piggyBac carrying Oct4,Sox2,Klf4,and c-Myc.The round or oval iPSCs clones were similar to ESCs with clear boundry and large dense nuleus.The iPSCs showed the normal karyotypic and expressed the marker genes (Oct4,Nanog and FGF4)and proteins (SSEA-1,Nanog and AP)of ESCs.Teratomas containing three germ layers were formed in NOD-SCID mice after tanspalantation of iPSCs.Conclusion:The iPSCs are reprogrammed from MEFs by piggyBac transposon with four transcription factors-Oct4,Sox2,Klf4 and c-Myc,and the iPSCs with normal karyotype possess the characteristics of ESCs.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2016(042)004【总页数】5页(P676-680)【关键词】piggyBac;重编程;小鼠胚胎纤维细胞;诱导性多能干细胞【作者】任丽伟;魏培;杨晓菲;杨璐;邓春艳;齐晖;李富荣【作者单位】暨南大学第二临床医学院广东省深圳市人民医院干细胞与细胞治疗重点实验室，广东深圳 518020;暨南大学第二临床医学院广东省深圳市人民医院干细胞与细胞治疗重点实验室，广东深圳 518020;暨南大学第二临床医学院广东省深圳市人民医院干细胞与细胞治疗重点实验室，广东深圳 518020;暨南大学第二临床医学院广东省深圳市人民医院干细胞与细胞治疗重点实验室，广东深圳518020;暨南大学第二临床医学院广东省深圳市人民医院干细胞与细胞治疗重点实验室，广东深圳 518020;暨南大学第二临床医学院广东省深圳市人民医院干细胞与细胞治疗重点实验室，广东深圳 518020;暨南大学第二临床医学院广东省深圳市人民医院干细胞与细胞治疗重点实验室，广东深圳 518020【正文语种】中文【中图分类】Q813Evans等[1]第一次从小鼠囊胚的内细胞团中分离培养出多潜能性的胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)，随后根据其分化的全能性展开了各项研究。
PiggyBac转座子在肝脏中的活性研究
PiggyBac转座子在肝脏中的活性研究刘华华;缪辉;葛梦芸;吴传芳【摘要】本实验运用高压尾静脉注射的方法将PB转座系统导入小鼠肝脏,研究其在肝脏中的转座活性,系统中PB转座子携带表达红色荧光蛋白的基因以指示转座的发生.注射10个月后取出小鼠肝脏,体视荧光显微镜观察肝脏是否有红色荧光,并通过基因组PCR、splinkerettePCR分析PB转座子在肝脏中的插入情况.实验结果表明,PB转座子在肝脏内发生高效转座,检测的68个PB插入位点中有34个位于基因序列,使得PB系统可以作为有效的基因诱变工具来研究基因功能.【期刊名称】《四川大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(053)005【总页数】5页(P1130-1134)【关键词】PiggyBac(PB)转座子;高压尾静脉注射;Splinkerette PCR;插入突变【作者】刘华华;缪辉;葛梦芸;吴传芳【作者单位】四川大学生命科学学院功能基因组实验室,成都610064;四川大学生命科学学院功能基因组实验室,成都610064;四川大学生命科学学院功能基因组实验室,成都610064;四川大学生命科学学院功能基因组实验室,成都610064【正文语种】中文【中图分类】Q789PB(piggyBac)转座子来源于粉纹夜蛾，可以在哺乳动物细胞中高效转座[1-6]，诱导基因的插入突变来研究基因的功能．作为基因诱变剂，PB有独特的优势[1-6]：1)插入位点广泛分布于基因组中，且倾向于插入基因编码的活跃区；2)PB转座发生后精确切离，原插入位点不会发生突变；3)PBase可以单独克隆，反式调节PB的转座；4)PBase对PB的转座没有过量抑制现象；4)PB可以携带遗传标记基因，方便鉴定PB的插入且不影响其转座活性；5)与逆转录病毒相比操作更加安全、简便．我们使用本实验构建好的PB转座系统，包括供体质粒Donor(PB)和辅助质粒Helper(PBase)，其中PB携带红色荧光蛋白(RFP)标记转座的发生，PBase可以在真核细胞中自主表达．目前，PB多用于转基因的研究[7-11]，本实验主要通过研究PB转座子在体内肝脏细胞中的转座活性，分析其在体内作为插入诱变工具的可行性．将外源基因特异性导入肝脏有多种途径，但都有一定的局限性，如逆转录病毒载体导入法需要将肝脏部分切除或通过肝损伤来刺激肝细胞分裂．研究表明，通过物理方法将裸质粒DNA直接导入靶器官同样可以获得目的基因的高效表达[12]．高压尾静脉注射法，即将大体积的注射液快速注入尾静脉，由于肝脏的组织特点，该方法可以直接将质粒注入到肝脏，实现外源基因在肝脏细胞中的表达；此法操作简便，且不会对肝脏造成永久性伤害[13-16]．我们运用这一方法将PB转座系统导入肝脏，通过观察肝脏的红色荧光、基因组PCR和splinkerette PCR技术[17]来确定PB的转座情况以及插入位点．实验结果表明，PB转座子在体内肝脏中有较高的转座活性．该结果为PB共转染系统用于小鼠体内研究又迈了一步，为肝脏基因功能的研究提供了一条新的方法思路．2.1 材料2.1.1 菌株、质粒和实验动物大肠杆菌菌株E. coli. DH5α由本实验室保存，PB转座系统(Donor和Helper)由本实验室提供[18]，Balb/c小鼠由四川大学华西实验动物中心提供．2.1.2 主要试剂Taq酶、限制性内切酶及T4 DNA ligase 均购自Fermentas公司，DNA marker 购自天根生物科技公司，SsoFastTM EvaGreen® 试剂盒购自BIO-RAD公司，pMD-19T载体购自Takara公司，质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒及基因组提取试剂盒均购自Foregene公司，质粒大提试剂盒购自Invitrogen 公司，寡核苷酸引物合成、接头(adaptor)片段的合成及测序均由北京六合华大基因科技有限公司完成．2.2 方法2.2.1 高压注射PB转座系统由两种质粒构成，分别是Donor和Helper．其中Donor提供PB必须的转座元件3′ITR(Inverted Terminal Repeat，末端反向重复序列) 和5′ITR(图2A显示ITR的相对位置)，红色荧光蛋白基因位于两段序列之间，指示PB的转座；Helper携带PB转座必须的转座酶PBase．将150只六周龄Balb/c小鼠随机分A、B、C 3个组，三种不同的注射液(表2)分别注射小鼠尾静脉．注射液的体积按小鼠重量的10%计算(如小鼠重量为20g，则注射液体积为2ml)，于5s-7s内将注射液经尾静脉快速推入体内．质粒的注射量详见表1．A、B两组作为阴性对照．the corresponding injection2.2.2 基因组PCR 使用OLYMPUS SZX2-ILLB体视显微镜观察小鼠肝脏是否发出红色荧光，对于实验其间濒临死亡或死亡的小鼠要及时取出并观察是否发出荧光，并进行下文提到的所有检测。
PiggyBac转座子:人类基因编码研究的新工具
PiggyBac转座子：人类基因编码研究的新工具于正洪;姜恩泽;张杰明【摘要】转座子是一种不依赖于同源性重组即可在宿主基因组中发生基因座位置改变的DNA片段.PiggyBac(PB)转座子是一种可移动的遗传元素,并通过"剪切-黏贴"机制在有效载体和染色体之间调换.在换位过程中,PB转座子识别具体转座子的反向末端重复序列(inverted terminal repeat sequences,ITRS)位于转座子载体的2端,有效地移动原来位置的内容,并整合到TTAA染色体.PB转座子系统强大的活动使在PB载体上位于2个ITRS之间的基因容易地动员到靶基因.PB转座子因其高转座活性,转座安全、稳定与无痕移除的特性而备受关注,在分子医学研究中有较好的应用前景.针对其特性,PiggyBac转座子可被用于基因转移载体、癌基因筛选工具和基因治疗的载体.文中就其在基因编码研究中的应用作一综述.【期刊名称】《医学研究生学报》【年(卷),期】2014(027)002【总页数】4页(P199-202)【关键词】PiggyBac;转座子;转基因【作者】于正洪;姜恩泽;张杰明【作者单位】210002,南京,南京军区南京总医院肿瘤内科;210008,南京,南京大学医学院;60611,芝加哥,美国西北大学文理学院【正文语种】中文【中图分类】Q343.10 引言人类基因组有2层意义，即遗传信息和遗传物质。
基因组(Genome)就是一个物种中所有基因的整体组成［1］。
美国科学家于1985年率先提出了人类基因组计划，并于1990年正式启动该计划。
这一预算达30亿美元的人类基因组计划由多国共同参与。
这个计划原本设想在2005年全部解开人体内约10万余个基因密码，并获得组成人体4万个基因的30亿个碱基对的全部信息，同时绘制出人类基因的图谱。
在完成了人类和鼠的基因组测序工作后，许多科学家开始把研究重心转向基因的功能研究，研究策略是诱使每个基因发生突变，并观测结果及分子机制。
piggyBac 转座系统的功能改进及在哺乳动物中的应用
第 10 期
钱秋杰等: piggyBac 转座系统的功能改进及在哺乳动物中的应用
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(Binding domain)、催化结构域(Catalytic domain)和 核定位信号(Nuclear localization signals)，可能还存 在转座酶之间作用的功能域。已有研究表明，PB 转 座酶的核定位信号存在于转座酶 C 端第 551~571 氨 基酸之间[51]。DDE 重组酶具有结合镁离子的催化核 心域 DDE 结构域，而结构预测和突变筛选都显示 PB 转座酶的第 268、346、447 个天冬氨酸(D)也具 有类似 DDE 结构域的功能[47,52]，该结构域附近的其 他保守氨基酸与转座酶的切割和插入功能有关，将 第 372 位精氨酸残基与第 375 位赖氨酸残基突变成 丙氨酸后，获得的 PB 转座酶只有剪切功能而丧失了 插入功能[53]。通过氨基酸序列比较发现，PB 转座酶 存在几个氨基酸保守性比较丰富的区域[52]，这些保 守区域很可能是转座酶的功能区域。用染色质免疫 沉淀实验(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)证实 PB 转座酶在无转座臂的情况下，也可以结合到 TTAA 序列[35]。以上研究结果表明，PB 转座酶具有 多个功能结构域，深入地理解转座酶的这些结构域 在转座功能上的作用，将有利于对 PB 转座酶进行改 造，提高转座酶的转座活性，改善靶向转座的能力。
关键词： piggyBac；转基因；靶向插入；转座
n of piggyBac transposon system in mammals
Qiujie Qian, Jiaqian Che, Lupeng Ye, Boxiong Zhong
piggyBac转座子介导HepG2细胞不同亚型药物代谢酶稳定共表达方法比较
piggyBac转座子介导HepG2细胞不同亚型药物代谢酶稳定共表达方法比较庞士慧;钟国瑞;谢水林;李浩健;邹淑香;贾英;戴仁科;黄黎珍【期刊名称】《中国药理学与毒理学杂志》【年(卷),期】2018(32)2【摘要】OBJECTIVE To study the methodology of achieving stable co-expression of drug-metab?olizing enzymes in the HepG2 cells by the piggyBac (PB) transposon system. METHODS N-terminal attachment of enhanced green fluorscent protein plasmid (pEGFP- N2) and 2A peptide linked recombinant PB transposon plasmid containing dual-genes encoding drug metabolizing enzymes cyto?chrome P450 3A4 (CYP3A4) and CYP2C19 (pPB-CYP3A4-2A-2C19) were transfected into HepG2 cells respectively by Lipofectamine?LTX reagent, GenJetTM (Ver.Ⅱ) reagent and Neon?Transfection System reagent, which were widely used for large-sized DNA fragments transfection. 48 h later, the transfection efficiency and cell toxicity were detected and compared between the three methods so as to find a method with relatively high efficiency and low toxicity for later transfection.Then,three groups of recombinant PB transposons-single-gene transposon (PB-CYP3A4), 2A peptide linked dual-gene transposon (PB-CYP3A4-2A-2C19) and multiple single-gene transposon mixture〔PB-CYP3A4, PB-CYP2C8, PB-CYP2A6, organic anion transporting polypeptide 1B1 PB transposon (PB-OATP1B1)〕-were transfected into HepG2 cellsrespectively with the above established method.The puromycin (Puro)-resistant and GFP positive cell clones were picked up and further cultured. The mRNA, protein and metabolic levels of drug-metabolizing enzymes in monoclonal cell lines were detected by quantitative real-time PCR,Western blotting and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry respectively after screening by Puro and green fluorescence. Comparisons of different groups were made using statistical analysis. RESULTS The comparison of three different transfection methodsindi?cated that the transfection efficiency of GenJetTMwas up to(94.2±2.5)% and (89.3±3.3)%,significantly higher than those of the other two methods (P<0.01), along with lower cytotoxicity. Then GenJetTMwas chosen for later transfection. In the Puro-resistant monoclonal cell lines of single transposon PB-CYP3A4,PB-CYP3A4-2A-2C19 groups,the mRNA,proteinand enzyme activity levels of drug-metabo?lizing enzymes were significantly increased respectively.The recombinant transposon (PB-CYP3A4-2A-2C19) containing 2A peptide could achieve stable and efficient co-expression of two metabolizing enzymes CYP3A4 and CYP2C19,whilethe expression of drug-metabolizing enzymes remained unbal?anced and random in those of multiple single-gene transposon mixture group (PB-CYP3A4, PB-CYP2C8,PB-CYP2A6,PB-OATP 1B1)(CYP3A4 was expressed in some cell clones only).CONCLUSION GenJetTM could be an effective method for the PB recombinant transposon transfection into HepG2 cells, by which the PB transposon could mediate stable expression of drug-metabolizing enzymes. In terms of multi-gene expression,a low andunbalanced expression is found by multiple transposons co-transfection method,which is different from that by virus mediated method.In contrast,mono-PB trans?poson linked by 2A peptide can achieve stable expression of multi-genes.%目的在piggyBac(PB)转座子介导下,探索在HepG2细胞中实现多个药物代谢酶稳定共表达的策略,为建立体外药物代谢和肝毒性研究的理想细胞模型奠定基础.方法首先选择3种目前针对大片段DNA使用较广的转染方法:Lipofectamine?LTX,GenJetTM(Ver.Ⅱ)和Neon?Transfection System,分别转染N端标记增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N2)和2A串联重组细胞色素3A4(CYP3A4)和CYP2C19的PB转座子质粒(pPB-CYP3A4-2A-2C19)至HepG2细胞,48 h后比较不同方法的转染效率和细胞毒性,确立高效低毒的HepG2细胞转染方法.然后选择该法进行转染,将设计的3组PB重组转座子:单基因转座子(PB-CYP3A4)、2A串联多基因转座子(PB-CYP3A4-2A-2C19)、多个单基因转座子混合物〔PB-CYP3A4, PB-CYP2C8,PB-CYP2A6,有机阴离子转运多肽1B1的PB转座子(PB-OATP1B1)〕分别转染HepG2细胞,利用嘌呤霉素和GFP 进行单克隆细胞筛选:挑选具有抗性且表达GFP的细胞单克隆并进行扩大培养,采用实时荧光定量PCR、Western蛋白质印迹和高效液相色谱-串联质谱联用法分别检测各组药物代谢酶mRNA、蛋白质水平及酶活性,并进行统计分析.结果 3种转染方法比较发现,GenJetTM法的转染效率显著高于其他2种(P<0.01),介导Pegfp-N2和Ppb-CYP3A4-2A-2C19的转染效率分别高达(94.2±2.5)%和(89.3±3.3)%,且该法具有较低的细胞毒性.因此选择GenJetTM法进行后续PB转座子转染.分别转染3组PB重组转座子发现,单个转座子PB-CYP3A4和PB-CYP3A4-2A-2C19转染后,筛选获得的抗性细胞克隆中各个药物代谢酶在Mrna、蛋白质及活性水平均显著提高,其中2A可实现CYP3A4和CYP2C19药物代谢酶协同稳定表达;而多个转座子混合共转染细胞中,仅有随机几个基因表达;且各药物代谢酶基因的表达不均衡,仅CYP3A4药物代谢酶基因在单克隆细胞中表达水平明显升高.结论 GenJetTM法可成为PB重组转座子转染HepG2细胞的有效方法.PB转座子可介导基因稳定表达;但在实现多基因共表达时,与病毒载体法不同,理论上可行的PB多转座子共转染方法其基因表达效率下降,且各基因表达不均衡.相比之下,应用2A串联多个基因串联重组PB单转座子可实现各基因稳定表达.【总页数】10页(P125-134)【作者】庞士慧;钟国瑞;谢水林;李浩健;邹淑香;贾英;戴仁科;黄黎珍【作者单位】华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学发酵和酶工程重点实验室,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】R969.1【相关文献】1.PiggyBac转座子介导的诱导细胞永生化转基因载体的构建及其整合效率的检测[J], 张婷婷;辛颖;张志强;任充华;杨涵江;王令;张智英2.腺病毒介导的"睡美人"转座子与IL-10共表达对NOD小鼠Th17/Treg细胞平衡的影响 [J], 庞春艳;王慧;王志华;冯秀媛;王永福3.PiggyBac转座子介导的转FGF5s基因绒山羊胎儿成纤维细胞的制备 [J], 何晓琳;袁超;屈雷;陈玉林4.一种由piggyBac转座子介导高效构建稳定细胞株的策略 [J], 盛哲津;王亮;周斌;李利妹5.piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究初探 [J], 周文林;王崇龙;刘波;曹广力;薛仁宇;沈卫德;贡成良因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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黄惠 等/一种通用型piggyBac 转座子诱导细胞永生化载体的构建及其基本功能验证Chinese Journal of Biotechnology/cjbcn August 25, 2014, 30(8): 1182−1192 DOI: 10.13345/j.cjb.130529 ©2014 Chin J Biotech, All rights reservedReceived : October 13, 2013; Accepted : January 7, 2014Supported by : National Major Project for Production of Transgenic Breeding (No. 2013ZX08007-004), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2011AA100303).Corresponding author : Suzhu Qing. Tel: +86-29-87092438; E-mail: suzhuqing@Yong Zhang. Tel: +86-29-87080085; E-mail: yongzhang19562012@ 国家转基因重大项目专项 (No. 2013ZX08007-004)，国家高技术研究发展计划 (863计划) (No. 2011AA100303) 资助。
生物工程学报一种通用型piggyBac 转座子诱导细胞永生化载体的构建及其基本功能验证黄惠1,2，胡广东1,2，康健1,2，卿素珠1，张涌1,21 西北农林科技大学动物医学院, 陕西 杨凌 7121002 西北农林科技大学 农业部动物生物技术重点实验室, 陕西 杨凌 712100黄惠, 胡广东, 康健, 等. 一种通用型piggyBac 转座子诱导细胞永生化载体的构建及其基本功能验证. 生物工程学报, 2014, 30(8): 1182–1192.Huang H, Hu GD, Kang J, et al. Construction of a general piggyBac transposon inducible cell immortalization vector and verification of its basic properties. Chin J Biotech, 2014, 30(8): 1182–1192.摘 要: 为了构建一种高效、通用的细胞永生化载体pTP-hTERT ，通过人工合成、PCR 、酶切连接等方法，对传统piggyBac (PB) 转座子系统进行改造。
改造后的载体含有转座必需元件、PB 转座酶 (PBase) 表达框、共表达筛选元件和人端粒逆转录酶 (hTERT) 基因表达框。
其中筛选元件中绿色荧光蛋白 (EGFP)基因和嘌呤霉素抗性 (Puror) 基因以猪捷申病毒2A 自我剪切肽相连，以实现共表达。
为验证载体元件功能，使用该载体转染HEK 293细胞，并对筛选出的阳性细胞进行RT-PCR 、Western blotting (WB)、热不对称PCR (Tail-PCR) 和细胞克隆亚甲蓝染色与统计分析。
载体测序鉴定与细胞培养结果表明，通用型永生化载体 pTP-hTERT 构建成功，转染HEK293细胞后能筛选出抗嘌呤霉素细胞单克隆；WB 结果显示P2A 可高效切割EGFP 和Puror 融合蛋白，证明筛选标记基因功能正常；Tail-PCR 结果表明该载体以转座整合插入宿主基因组；亚甲蓝染色统计结果显示由pTP-hTERT 引发的细胞阳性克隆数与对照组相比显著提高 (P <0.01)。
PB 转座子永生化载体pTP-hTERT 的构建为永生化细胞系的建立提供了工具，同时也为其他真核载体的构建和改造提供了参考。
关键词: piggyBac (PB) 转座子，P2A ，融合蛋白，hTERT黄惠 等/一种通用型piggyBac 转座子诱导细胞永生化载体的构建及其基本功能验证cjb@Construction of a general piggyBac transposon inducible cell immortalization vector and verification of its basic propertiesHui Huang 1,2, Guangdong Hu 1,2, Jian Kang 1,2, Suzhu Qing 1, and Yong Zhang 1,21 College of Veterinary Medicine , Northwest A&F University , Yangling 712100, Shaanxi , China2 Key Laboratory of Animal Biotechnology , Ministry of Agriculture , Northwest A&F University , Yangling 712100, Shaanxi , ChinaAbstract: In order to construct generally efficient cell immortalization vector, pTP-hTERT, we modified the traditional piggyBac (PB) transposon using artificial synthesis, PCR and enzyme digestion. The modified vector contained the necessary transposon elements, a PB transposase expression cassette, a co-expression selectable element and a human telomerase reverse transcriptase (hTERT) expression cassette. The co-expression selectable element had two markers, enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene and puromycin-resistance (Puro r ) gene, linked by porcine teschovirus-1 2A peptide (P2A). To validate the functionality of vector elements, we transfected pTP-hTERT into HEK293 cell, selected the positive cell clones and then conducted RT-PCR, Western blotting (WB) and Tail-PCR, methylene blue staining and statistic analysis on selected cells. The results of sequencing and cell culture show that the pTP-hTERT was constructed successfully and the positive cell could be selected by puromycin. The WB results, P2A cutting EGFP and Puro r fusion protein with high efficiency, reflected the selectable element worked. The sequencing result of Tail-PCR confirmed the vector integrated into the genome through transposition. The results of methylene blue staining and statistic analysis indicated the clone of positive cells triggered by pTP-hTERT significantly increased (P <0.01) compared with control group. The construction of pTP-hTERT provides an efficient tool for establishing immortalized cell lines and a demonstration for building other eukaryotic plasmids.Keywords: piggyBac (PB) transposon, P2A, fusion protein, hTERT转座子 (Transposon) 是一类能在宿主基因组中变更插入位置的可移动遗传因子，其变更插入位置的过程被称为转座 (Transposition)。
piggyBac (PB) 转座子是病毒遗传学家Fraser 等最初发现并构建二元转座系统证明其不仅仅在一个动物宿主中具有转座活性[1]。
自中国学者证明该转座子可在哺乳动物细胞中高效转座以 来[2]，PB 转座系统逐渐作为一种高效基因传递工具被应用于各种哺乳动物基因工程试验中，如反向遗传筛选[3]、转基因动物生产[4-5]、iPS 诱导[6-7]、RNA 干扰[8]、基因治疗[9]以及诱导突变[10-11]等。
PB 转座的发生是由PB 转座酶 (PBtransposase ，PBase) 介导的，实际应用过程中，PB 转座系统是由一个供体质粒和一个辅助质粒组成的二元系统[12]。
供体质粒包含转座发生所必需的5′TR 和3′TR 核苷酸序列[13]，并承担携带筛选报告基因表达框和外源基因的功能，辅助质粒主要包含一个PBase 表达框，供体质粒和辅助质粒按比例共转染细胞后，在PBase 的作用下，供体质粒中的转座元件特异性插入宿主基因组TTAA 位点[14-15]。
有报道表明PB 转座系统携带100 kb 大小的外源基因依然具有较高活性[16]，因而该系统在实现大片段基因或多基因在哺乳动物细胞中的表达具有较广阔的应用前景。